Summary
Her presenterer vi en protokoll for murine i vivo merking av glomerular celle overflaten proteiner med biotin. Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og utføre endogene immunoprecipitation av protein av interesse.
Abstract
Proteinuria resultatene fra avbrudd glomerular filter som består av fenestrated endotelet, glomerular kjelleren membranen og podocytes med sine slit membraner. Delikat strukturen glomerular filter, spesielt slit membranen, er avhengig av samspillet mellom ulike celle overflaten proteiner. Studere disse cellen overflaten proteinene har så langt vært i vitro studier eller histologic analyse. Her presenterer vi et murint i vivo biotinylation merking metoden, som muliggjør studiet av glomerular celle overflaten proteiner under fysiologiske og pathophysiologic forhold. Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og utføre endogene immunoprecipitation av et protein av interesse. Immunoprecipitation kan studeres semi kvantifisering av glomerular celle overflaten overflod er lett tilgjengelig med denne romanen metoden og alle proteiner tilgjengelig for biotin perfusjon. I tillegg kan isolering av glomeruli med eller uten biotinylation videre analyse av glomerular RNA og protein, i tillegg til primære glomerular cellekultur (dvs. primære podocyte cellekultur).
Introduction
Proteinuria er et kjennetegn på glomerular skader og vanligvis følger avbrudd av glomerular filteret1. Glomerular filteret består av fenestrated endotelet, glomerular kjelleren membranen og podocytes. Den delikate molekylære strukturen av glomerular filteret er svært dynamisk og emne til cellen overflaten protein menneskehandel i både friske og syke nyrer2,3,4,5,6 . Endocytose cellen overflaten proteiner har vist seg å være avgjørende for overlevelsen av podocytes7. Nephrin og podocalyxin er transmembrane proteiner uttrykt på podocytes. Nephrin er ryggraden i glomerular slit membranen, mens podocalyxin er en sialoglycoprotein belegg sekundære foten prosesser av podocytes8,9,10. Endocytic menneskehandel har tidligere vist for nephrin og podocalyxin3,11,12,13,14.
Til best av vår kunnskap, har endocytose cellen overflaten proteiner ikke ennå blitt beskrevet i glomerular endotelceller i litteraturen. Imidlertid uttrykke endotelceller generelt alle nødvendige proteiner for ulike endocytose (dvs. clathrin-avhengige, flåte-avhengige endocytose)15,16. Derfor endothelial celle overflaten menneskehandel kan studeres med denne metoden bruker, for eksempel vaskulær endotelial (VE)-cadherin og intracellulær vedheft molekyl (ICAM-2) som en celle overflaten markør protein for glomerular endotelceller17 .
Dessverre er det ingen nøyaktig i vitro modell for delikat tre-lagdelt glomerular filteret i hvilken celle overflaten protein menneskehandel kan studeres. Målet med denne metoden er derfor å studere glomerular protein menneskehandel i vivo. I tillegg inneholder denne protokollen informasjon om hvordan du isolerer glomeruli, en slik analyse av glomerular RNA, proteiner eller celler. Lignende glomerular isolasjon teknikker har blitt beskrevet av ulike grupper18,19.
Tidligere har vi og andre brukt ex vivo merking av glomerular celle overflaten proteiner av biotinylation,2,,3,,4,,20,,21. Men i denne ex vivo metoden, ble isolerte glomeruli utsatt for mekanisk stress, som kan påvirke endocytic menneskehandel. Eventuelt er immunofluorescence merking av glomerular celle overflaten proteiner mye brukt i litteratur2,20,22. Med denne metoden, men bare et lite antall proteiner kan analyseres i ett lysbilde, og kvantifisering av immunofluorescence bilder er ofte vanskelig.
Denne romanen i vivo metoden gir et pålitelig verktøy for å studere glomerular celle overflaten protein overflod og omsetning nøyaktig i friske og syke nyrer, og den kan brukes som et tillegg til immunofluorescence tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus ble innhentet som en egen rase fra lokale dyr pleie anlegget eller Janvier Labs i Frankrike. Undersøkelser ble gjennomført i henhold til retningslinjene skissert i guiden for omsorg og bruk av forsøksdyr (USAs nasjonale institutter av helse publikasjonen nummer 85-23, revidert 1996). Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med relevante institusjonelle godkjenninger (staten regjeringen LANUV referanse nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. utarbeidelse av instrumenter, løsninger og utstyr
- Forberede 1 L fosfat bufret saltoppløsning supplert med 1 mM magnesiumklorid (MgCl2) og 0,1 mM veisalt (CaCl2) (PBSCM) og filtrere det gjennom et sterilt filter.
- Forberede 5 mL steril PBSCM per musen perfusjon og plassere den på is.
- For hver mus, forberede 5 mL steril PBSCM med 0,5 mg/mL biotin.
- For hver musen, forberede 5 mL steril PBSCM og legge til 0.8 x 108 magnetiske perler (f.eks., 200 µL av en 4 x 108 perler/mL løsning, uten forbehandling) for embolisering av glomeruli. Klargjør denne løsningen under celle kultur benken å holde de magnetiske perlene i opprinnelige røret sterile. Plass denne løsningen på isen.
- Forberede en slukke løsning ved å legge til 100 mM glysin PBSCM (5 mL per musen) og holde den på is.
- Lage en collagenase løsning (0.378 U/mL collagenase A i sterilt PBSCM). Per mus, Pipetter 1 mL av collagenase løsningen i en 2 mL tube og plassere den på is.
- For vasking, forberede sterilt PBSCM (se trinn 1.1) i et 50 mL tube og plassere den på isen.
- For perfusjon, kan du bruke en sprøytepumpe med en flyt av 2.0 mL/min.
- Forberede en 10 mL sprøyte med en 21G nål. Plassere nålen i en 20-30 cm lang kateter (indre diameter, ID = 0.58 mm). Koble kateter (ID 0.58 mm) med en 10 cm kort kateter (ID 0,28 mm) og kutte spissen av de mindre kateter skrå for en enkel innsetting aorta musen.
- Kutte tre 5-7 cm silke tråder (4-0 til 6-0) per musen for ligatur prosedyrer under operasjonen.
- For kirurgi, forberede 3 kirurgisk klemmer, 2 kirurgisk saks, 2 pinsett, 2 fine pinsett, 1 fine saks og vattpinner. Forberede anestesi (f.eks intraperitoneal anestesi ketamin 100 mg/kg kroppsvekt og xylazine 5 mg/kg kroppsvekt).
- For isolering av glomeruli av to nyrene, bruke en 100 µm celle sil, to 50 ml rør og en magnet catcher.
- Forberede CHAPS lyseringsbuffer: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 mM sodiumchorlide (NaCl); 50 mM sodiumfluoride (NaF); 15 mM Na4P2O7; 0,1 mM Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; og 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
- Kul sentrifuger til 4 ° C.
2. kirurgi Under mikroskopet
- Bedøve musen (f.eks med ketamin/xylazine intraperitoneally, se trinn 1,11). Utfør den toe-klype for å bekrefte riktig anestesi.
- Desinfiser ventrale siden av musen med 70% isopropanol.
- Utføre en median klipp gjennom huden fra bekkenet til side og fjern skinnet fra abdominal fascia ved hjelp av pinsett. Kutt huden på begge sider i magen med kirurgisk saks.
- Endre kirurgiske redskaper. Bruk en median klipp fra xiphoid på blæren gjennom bukmuskel laget og deler dem inn i fire kvadranter med pinsett og kirurgisk saks. Fest den øvre to side med klemmer mot halsen av musen med to kirurgisk klemmer.
Merk: Magen er nå åpnet. - Sett visceral organer med en bakteriefri vattpinne og klippe hepatisk phrenic ligament med fint saks.
- Forberede en ligatur (med en silke tråd 4-0 til 6-0) rundt aorta proksimale av den nyre arteries på høyden av det adrenalin kjortelen med to fine pinsett. Stram den proksimale aorta hemorroider å avskaffe blodstrøm med pinsett.
- Gratis distale aorta fascia, fett og andre vev og forberede en ligation rundt arteria hepatisk/hvem skallen av den nyre arteries ved hjelp av fine kirurgisk pinsett.
- Forberede en ligatur (med en silke tråd 4-0 til 6-0) rundt aorta distale av den nyre arteries og klemme vena cava og aorta på høyden av bifurkasjonen.
- Skjær et lite hull aorta distale til den nyre arteries slik at hullet er halvparten så stor diameter av aorta. Sett kateter aorta og fikse det med forberedt ligatur.
FORSIKTIG: Unngå bobler i perfusjon systemet å hindre air embolism. - Start perfusjon med den iskalde PBSCM på en flow rate på 2 mL/min.
- Klippe et hull i nyre venen på nivå med den nyre arteries med fine kirurgisk saks og stram ligation rundt hepatic og hvem arteriene.
Merk: Nyrer bør slå blek etter start av perfusjon.
3. i Vivo Biotinylation
- Endre sprøyten boble-fri til iskalde PBSCM supplert med 0,5 mg/mL biotin for overflate merking, og perfuse nyrer med 5 mL på en flow rate på 2 mL/min.
Merk: Bland PBSCM løsninger (f.eks ved å slå 50 mL rør) forsiktig for å unngå danner bobler i løsningen. Etter aspirasjon av løsningen i sprøyten, evakuere noen bobler eller luft fra sprøyten. Bruke en ekstra kanyle (21G) på sprøyten for å fylle plassen i kanyle som er koblet til kateter systemet. Endelig holde sprøyten i kanyle med kateter uten bobler. - Endre sprøyten boble-fri til iskald PBSCM med 100 mM glysin slukke glomeruli og perfuse med 5 mL på en strøm av 2 mL/min.
- Endre sprøyten boble-fri til iskalde PBSCM supplert med 200 μL magnetiske perler/mL og perfuse nyrer på 2 mL/min.
Merk: På nyre overflaten, embolisering av glomeruli med brun magnetiske perler vises.
4. isolering av Glomeruli fra to nyrer
- Fjern nyrer på hilum og fjerne kapselen. Plass nyrene på isen i 15 mL PBSCM i 10 cm celle kultur parabol. Euthanize musen med cervical forvridning under narkose etter høsting nyrene. Kirurgi og perfusjon prosedyrene siste ca 20-22 min.
- Skjær nyrene i de minste delene mulig med nye tveegget blad. Flytte vevet inn i en 2 mL tube med 1 mL av collagenase A (se trinn 1.6) og fordøye på 37 ° C i 30 min. Før og etter fordøyelsen, bland forsiktig med en 1000 μL kuttet pipette.
- Skyll fordøyd vev gjennom en 100 μm celle sil bruker iskalde PBSCM. Forsiktig bruk cellen-skraper å hakke den gjenværende vev gjennom cellen silen og skylle den med iskald PBSCM etterpå til et totalt volum på 50 mL.
- Sentrifuge suspensjon 4 ° C 500 x g for 5 min. fjerne nedbryting og resuspend pellets med litt mindre enn 1,5 mL iskalde PBSCM mens vortexing pellet. Etterpå satt glomerular suspensjon i en ny 2 mL tube.
5. vask
- Bruk magnet catcher for å trekke i glomeruli til side. Vente 1 min før glomeruli har flyttet mot magneten.
- Fjern nedbryting med en 1000 μL pipette mens 2 mL tube forblir i magnet catcher. Under den første og andre vasken kan du trinn (se trinn 5.3), av 250 μL supernatant forblir i røret for å unngå tap av glomeruli. Denne fremgangsmåten raskt for å unngå å la stålrør strukturer synke å bunnen av røret.
Merk: Vask prosedyren vil vare lenger ellers. - Fjern 2 mL tube fra magnet catcher og tilsett 1 mL av PBSCM, pipette opp og ned (veldig viktig), da vortex.
- Sett røret tilbake i magnet catcher og starte på nytt med trinn 5.2.
- Gjenta vask trinnene til renhet av glomeruli har nådd 90%. For dette, kan du undersøke en representant aliquot av nedbryting under et mikroskop (40-100 X).
Merk: Glomeruli vises som runde strukturer som inneholder brun magnetiske perler. Langstrakt strukturer er rørformede fragmenter, og gratis magnetiske perler vises som brun runde prikker. Celle rusk kan vises som store strukturer. - Hvis renhet nås, anslå antall glomeruli ved å løse opp glomeruli i 1 mL av PBSCM. Etter miksing, ta en aliquot av 10 μL og telle glomeruli under mikroskop. Beregne antall glomeruli med følgende ligning: endelige antall glomeruli = antall glomeruli i 10 μL aliquot x 100.
- Vellykket isolering av glomeruli fører til en rekke 10,000-40,000 glomeruli.
6. protein utvinning og Immunoprecipitation (IP)
- Samle glomeruli med sentrifugering på 4 ° C 6800 x g for 5 min. fjerne nedbryting mens du bruker en magnet catcher og resuspend pellet i iskalde lyseringsbuffer (f.eks., 30.000 glomeruli i 300 μL; CHAPS, se trinn 1,11). Homogenize prøvene med en vev homogenizer med høyeste hastighet for 30 s og lyse dem på is 30 min.
- Fjerne uløselig materiale med sentrifugering 15.000 x g i 30 min for 4 ° C. Pipetter nedbryting som inkluderer cellen lysate til en ny 1,5 mL tube. Kast pellet.
- Måle protein konsentrasjonen nedbryting av ved hjelp av en bicinchoninic (BCA)-basert metode etter produsentens instruksjoner. En vellykket lysis av 30.000 glomeruli gir en glomerular protein mengde 700-1000 µg/mL. Justere lik protein mengder med lyseringsbuffer.
- Ta en aliquot på 10% av totalvolumet for glomerular lysate og legge til 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) før inkubasjonstiden for 5 min på 95 ° C.
- For IP, ruge resten av lysate med streptavidin agarose perler overnatting på 4 ° C på en overhead shaker.
- Sentrifuge agarose perler på 1000 x g i 3 minutter på 4 ° C, fjerne nedbryting og legge til 800 μL lyseringsbuffer å vaske perler for uspesifikke protein bindingen.
- Gjenta vask 3 ganger, og fjerne nedbryting helt.
- Legg til 30 μL 2 x Laemmli + DTT og ruge på 95 ° C i 5 minutter.
- Laste den lysate og IP-prober på en 10% SDS gel og kjøre SDS gel på 70 V i 30 minutter, så 20 mA per gel for 1,5 h. etterpå blot gel for 2t 200 mA på en nitrocellulose membran.
- Blokkere nitrocellulose membranen overnatting på 4 ° C med 5% bovin serum albumin (BSA) i vaske bufferen.
- Inkuber membranen med antistoffer rundt overnatting på 4 ° C. Vask med å vaske bufferen 3 ganger i 5 min på en shaker og ruge membranen med HRP-merket sekundære antistoffer 1t ved romtemperatur. Gjenta trinnet vask.
- Visualiser den lysate og immunoprecipitation sonder på membranen ved hjelp av en super-oppløsning chemiluminescent agent med CCD kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å isolere glomeruli nøyaktig, er det nødvendig å perfuse murint nyrene med PBSCM først. Perfusjon med PBSCM viser nyrer blek (figur 1A). Embolisering av glomeruli med magnetiske perler vises som brune prikker på nyre overflaten (figur 1B). Isolasjonen av glomeruli med magnet catcher kan vise forurensning med nyre tubuli (figur 1C). Før ytterligere analyse av glomeruli, > 95% renhet av glomeruli må oppnås ved å vaske glomeruli mer grundig (figur 1D).
I vivo biotinylation er avhengig av muligheten til å merke cellen overflaten proteiner med biotin. For å studere dette, er murine nyrer parfyme med PBSCM eller ikke-cellemembranen permeable biotin. Som vist i figur 2, etiketter biotin kapillær looper i biotin-perfused men ikke i kontroll musen nyrer. Undersøke cellen overflaten proteiner av glomerulus merket av i vivo biotin perfusjon, utføres immunoprecipitation av biotin brøkdel av glomerular ekstrakter. Figur 3 A viser at glomerular transmembrane proteiner nephrin og podocalyxin er immunoprecipitated i biotin brøken. Men i kontroll mus, er ingen nephrin eller podocalyxin oppdaget i immunoprecipitated delen av biotinylated proteiner. Som en negativ kontroll, intracellulær protein ekstracellulære-signalet regulert kinaser p42 og p44 (ERK) ikke finnes i immunoprecipitated delen av biotinylated proteiner av både kontrollen og biotin-perfused musen nyrer. For å bekrefte at cellen overflaten protein nephrin er faktisk biotinylated av denne metoden, bidrar nephrin kontroll og biotin-perfused musen nyrer. For å visualisere biotin, er immunoprecipitated brøkdel farget med streptavidin. Figur 3 B viser biotinylated nephrin i biotin-perfused men kontrollere ikke dyr. Lysate kontroller angi like mye protein i kontroll og biotin-perfused dyr. Endothelial protein vaskulær endotelial (VE)-cadherin er immunoprecipitated i biotin brøken som vist i Figur 3C. I kontroll mus bidrar ingen VE-cadherin, mens VE-cadherin finnes i lysates kontroll og biotin-perfused dyr. Intracellulær vedheft molekyl 2 (ICAM-2) bidrar fra biotin-perfused dyr, og ingen ICAM-2 finnes i kontrollen dyr. Lysates kontroll og biotin-perfused dyr viser like mengder av ICAM-2 (Figur 3C). Utgangen var kontrollen lasting.
Denne metoden kan brukes å kvantifisere mengder glomerular celle overflaten proteiner i modeller av nephropathy (f.eks nephrotoxic nefritt, NTN). I den tidlige fasen av NTN [dag 1 (1 d) etter NTN serum injeksjon] øker proteinuria raskt. I den senere fasen av NTN [dag 18 (18 d)] reduseres proteinuria betydelig. Figur 4 viser nephrin celle overflaten overflod i tidlig NTN (1 d). I vivo biotinylation analysen (Figur 4A) viser en reduksjon på celle overflaten nephrin i NTN dyr sammenlignet med kontrollene. Densitometric analyse viser en betydelig reduksjon av biotinylated nephrin (57%) i NTN dyr sammenlignet med kontrollene (Figur 4C). Kvantitativ analyse av totalt nephrin til utgangen avslører noen betydelige forskjeller mellom kontroller og NTN mus (Figur 4B). Bruker en p57 podocyte celle spesifikk farging, vises podocyte tall like mengder i NTN og kontroll dyr (tall 4 d og 4E). Figur 5 viser resultatene av nephrin celle overflaten overflod i slutten NTN (18 d). Figur 5 En viser i vivo biotinylation analysen i kontroll og NTN mus indikerer en utvinning av cellen overflaten nephrin. Densitometric analyse viser ingen vesentlig forskjell på celle overflaten nephrin i kontroll og NTN mus (figur 5B). Totalt nephrin ble redusert med 25% i NTN mus (figur 5C). Podocyte tallene ble redusert i NTN mus sammenlignet kontroller med ca 19% (tall 5 d og 5E).
Figur 1 : Nyre perfusjon og isolering av glomeruli. (A) se gjennom mikroskopet i murine situs etter perfusjon med PBSCM. Kateter i aorta er angitt med en pil. Perfusjon med PBSCM fører nyrene å blekne. (B) embolisering av glomeruli med magnetiske perler vises som brune prikker på nyre overflaten. (C) vise skjønt mikroskopet viser jeg) forurensning av glomeruli (brun runde strukturer); II) med tubuli (lys langstrakt strukturer); og iii) celle rusk. Renhet av glomeruli er ca 50%. Gratis magnetiske perler vises som brune prikker (100 X forstørrelse). (D) se gjennom mikroskopet viser 95% renhet av glomeruli (100 X forstørrelse). Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Biotin oppdaget i glomerular kapillær loop. Representant immunofluorescence bilde av musen glomeruli (C57BL/6) parfyme med PBSCM (kontroll) og biotin (biotin). Biotin (grønn) er visualisert ved streptavidin i glomerular kapillær loop i biotin-perfused mus. Kontroll mus viser ikke glomerular biotin flekker. WT1 (rød) oppdages i kjerner i podocytes i både mus. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: I vivo biotin merking av glomerular celle overflaten proteiner. (A) Western blot analyse av immunoprecipitated (IP) biotinylated celle overflaten proteiner (IP: streptavidin agarose perler) og lysates (lysate) i nyrene fra PBSCM-perfused (kontroll) og biotin-perfused (biotin) mus. Den transmembrane proteiner nephrin og podocalyxin er bare oppdaget i immunoprecipitated prøver av biotin-perfused musen nyrer. I kontroll mus, er nephrin og podocalyxin ikke funnet i immunoprecipitated sonder i kontroll musen nyrene. Lysates kontroll og biotin-perfused dyr, er totalt nephrin og podocalyxin uttrykt like i begge gruppene. Intracellulær protein ekstracellulære-signalet regulert kinaser p42 og p44 (ERK) gjenkjennes ikke i immunoprecipitated sonder kontroll og biotin-perfused musen nyrer. I lysates i begge musen grupper oppdages ERK i like mengder. Utgangen er farget som en lasting. (B) Western blot analyse av immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) i PBSCM-perfused (kontroll) og biotin-perfused (biotin) mus. I biotin-perfused nyrene, er nephrin visualisert med streptavidin flekker, mens ingen gjenkjenning for nephrin finnes i kontroll mus. Immunoprecipitated brøkdel av nephrin (IP: α-nephrin, WB: nephrin) samt lysate brøken (lysate, WB: nephrin) farget for nephrin Vis like mye nephrin. Utgangen er brukt som en lasting. (C) Western blot analyse av immunoprecipitated biotinylated celle overflaten protein (IP: streptavidin agarose perler) og lysates (lysate) i nyrene fra PBSCM parfyme (kontroll) og biotin-perfused (biotin) mus. Transmembrane markør protein vaskulær endotelial (VE)-cadherin og intracellulær vedheft molekyl 2 (ICAM-2) er kun oppdaget i immunoprecipitated fraksjonen av biotin-perfused dyr. I kontroll mus oppdages ingen VE-cadherin eller ICAM-2. Utgangen fungerer som en lasting kontroll. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Glomerular protein nephrin overflod i tidlig nephrotoxic nefritt nephropathy (NTN). (A) Western blot analyse av overflaten nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin) og total nephrin (IP: α-nephrin eller lysate, WB: nephrin) i kontroll og nephrotoxic serum-behandlet mus (NTN 1 d). Utgangen fungerer som en lasting kontroll. Sammenlignet med kontroller, NTN behandlet mus viser redusert cellen overflaten nephrin (IP: α-nephrin, WB streptavidin) sammenlignet med kontrollene. (B) kvantitativ analyse av totalt nephrin/begrepsordbok i kontroll og NTN 1 d mus [kontrollere n = 4, NTN n = 6, ikke-signifikante forskjeller (ns)]. (C) Densitometric analyse av cellen overflaten nephrin (biotinylated nephrin/totalt nephrin) i kontroll og NTN mus (* p < 0,01, kontrollere n = 4, NTN n = 6). (D) immunhistokjemi av p57 viser podocytes i kontroll og NTN 1 d mus. (E) kvantitativ analyse av p57 positiv celler per dusk området (μm2). (40 glomeruli per musen kvantifisert, ns). Western blot data viser betyr ± SD. Podocyte teller viser betyr ± SEM. Unpaired t-test med welchs korreksjon. Skala bar = 50 µm. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Glomerular protein nephrin overflod i slutten nephrotoxic nefritt nephropathy (NTN). (A) Western blot analyse av overflaten nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin) og total nephrin (IP: α-nephrin eller lysate, WB: nephrin) kontroll og nephrotoxic serum behandlet mus (NTN 18 d). I forhold til kontroller, NTN 18 d mus vise like mengder cellen overflaten nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin). NTN behandlet mus på dag 18 skjermen mindre total nephrin, og utgangen fungerer som en lasting kontroll. (B) densitometric analyse viser ingen betydelige forskjeller i cellen overflaten nephrin mellom kontroller og NTN 18 d mus (kontrollere n = 4, NTN n = 3). (C) Densitometric analyse av totalt nephrin til utgangen. I NTN mus på dag 18, er det mindre uttrykk for nephrin forhold til kontroller (kontroll n = 4, NTN n = 3, ** p < 0,001). (D) immunhistokjemi av p57 viser podocytes i kontroll og NTN 18 d mus. Det er mindre p57 positiv celler (rød) i NTN 18 d mus sammenlignet med kontrollene. Magnetiske perler vises som svarte prikker. (E) kvantitativ analyse av p57 positiv celler per glomerular dusk området (μm2) (*** p < 0,0001, kontrollere n = 2, NTN n = 2, 40 glomeruli per musen kvantifisert). Western blot data viser betyr ± SD. Podocyte teller viser betyr ± SEM. statistisk analyse: unpaired t-test med welchs korreksjon. Skala bar = 50 µm. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presentert metoden gjør det mulig for vellykket isolering av glomeruli å undersøke glomerular RNA eller protein. I tillegg kan primære glomerular cellekulturer utføres fra de isolerte glomeruli. Hvis biotin brukes før glomerular isolasjon, kan merking av glomerular celle overflaten proteiner utføres. Med denne metoden i vivo glomerular celle overflaten protein menneskehandel kan studeres, og semi kvantifisering av protein overflod er mulig. De viktigste trinnene for å kunne teste glomerular celle overflaten protein overflod er 1) utvikling av manuell ekspertise i musen kirurgi spesielt cannulation av aorta, 2) boble-fri tilkobling av sprøyter for å unngå luft embolisering av den glomeruli, og 3) arbeider under iskald forholdene når perfusjon med PBSCM har startet.
For denne teknikken er manuell ekspertise i musen kirurgi viktig. Cannulation av aorta er spesielt kritisk, som Disseksjon av fartøyet vil hindre perfusjon av nyrene. Kuttet i aorta bør være store nok (ca 50% av fartøyet diameter) lage plass for å introdusere kateter. Hvis kateter er kuttet diagonalt, blir innføring av kateter aorta enklere. I tillegg til disseksjon plasseres introduserte kateter høy i aorta for å ikke hindre den nyre arteries. Den nyre arteries ville ikke ellers være parfyme med biotin og magnetiske perler.
Biotin er en liten vitamin som binder seg til høy affinitet streptavidin proteiner. På grunn av liten størrelse (244 Da) biotin endrer ikke funksjon conjugated proteiner og filtreres gjennom glomerulus. Av inkubasjon med streptavidin, kan biotinylated proteiner lett skilles fra ukodede proteiner med agarose perler eller andre metoder. N-hydroxysuccimide (NHS) estere av biotin binde til Amin (-NH2) grupper av proteiner, som er rikelig på siden kjeder av lysin rester, for eksempel. Sulfo-NHS-LC-biotin er vannløselige og celle-ugjennomtrengelige, hvis celle membraner er intakt. Sulfo-NHS-LC-biotin har vist å merke cellen overflaten proteiner23. Binding av biotin NHS estere Amin grupper er avhengig av pH (7-9) og bruk av Amin-fri buffere (dvs. PBSCM). PBSCM med en pH på 7,4 ble derfor brukt til perfuse musen nyrene med biotin, som kombinerer perfekt fysiologiske egenskaper med optimal løselighet og funksjonen til biotin. For å slukke proteiner etter merking, er perfusjon av PBSCM med glysin utført, slik at gratis biotin å bli bundet til Amin grupper av glysin. For å hindre cellulære prosesser etter dyret, er det viktig å utføre perfusjon med en iskald løsning og fortsette arbeidet på is.
Ligner ex vivo biotinylation metoder, mekanisk stress behandling glomeruli under i vivo biotinylation protokoller kan også innvirkning endocytose, rask signalisering hendelser og RNA integritet. Derfor er det viktig at alle behandlingstrinnene utføres på isen for å redusere risikoen for enzymatisk cellular aktivitet.
Proteinuric dyr modeller som nephrotoxic serum nefritt (NTN) skade musen nyrer alvorlig. Spesielt resulterer NTN i mesangial utvidelse glomerular sklerose og rørformede lesjoner, fører til nyre fibrose i avanserte stadier av sykdom (42 dager)24. Nedsatt perfusjon av sclerosed glomeruli i sykdom modeller kan føre til forutinntatte resultater av protein overflod. Sclerosed glomeruli vil trolig ikke være parfyme med magnetiske perler, og dermed kan ikke bli isolert i denne metoden. I sykdom modeller fører til alvorlige glomerular sklerose, kan bruke teknikker for å isolere glomeruli via forskjellige sikting trinnene være et alternativ til den magnetiske perler metoden som brukes i denne protokollen25. Men hvis glomeruli er sterkt sclerosed, kan selv perfusjon med biotin bli svekket. I tillegg vil ex vivo biotinylation, der utdraget glomeruli er badet ex vivo i biotin løsninger21, sannsynligvis ikke være en fordel i disse modellene. Alternativt, bruk av immunofluorescence for å oppdage protein overflod i alvorlig syke glomeruli kan være en fordel, som den ikke stole på perfusjon av glomeruli.
Semi kvantifisering av protein overflod bruker denne teknikken fungerer godt ved hjelp av densitometry. Imidlertid kan små forskjeller i protein overflod være savnet et resultat av gjenkjenning grensen for densitometry.
Beskrevet teknikken kan overføres til andre dyr organer som er parfyme, forutsatt at strukturer av interesse er tilgjengelig av isolert teknikker eller overflate protein rundt gjelder én celle type eller organ struktur. Selv om alle overflate proteiner er biotinylated av denne teknikken, vil med et spesifikt antistoff for immunoprecipitation føre til brøkdel av cellen overflaten protein uttrykk av spesielle proteinet (som vist for nephrin i Figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Blanka Duvnjak for sin eksepsjonelle kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 til M.W. og QU280/3-1 til IQ Funder ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling, analyse, beslutningen om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
