Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para murino na vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular com biotina. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar endógena imunoprecipitação da proteína de interesse.
Abstract
Proteinúria resulta do rompimento do filtro glomerular que é composto o endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos com seus diafragmas de fenda. A estrutura delicada do filtro glomerular, especialmente o diafragma de fenda, baseia-se sobre a interacção das proteínas de superfície celular diversos. Estudar estas proteínas de superfície celular até agora tem sido limitada a estudos em vitro ou análise histológica. Aqui, apresentamos um biotinylation murino na vivo rotulagem método, que permite o estudo de proteínas de superfície celular glomerular sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar imunoprecipitação endógena de uma proteína de interesse. Semi quantificação da abundância de superfície celular glomerular é prontamente disponível com este novo método e todas as proteínas acessíveis à perfusão de biotina e imunoprecipitação pode ser estudada. Além disso, o isolamento de glomérulos com ou sem biotinylation mais permite análise da glomerular RNA e proteína, bem como a cultura de células glomerular primária (ou seja, cultura de células primárias podocyte).
Introduction
Proteinúria é uma marca registrada de lesão glomerular e acompanha geralmente o rompimento do filtro glomerular1. O filtro glomerular é composto o endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos. A delicada estrutura molecular do filtro glomerular é altamente dinâmico e sujeito a proteína de superfície celular tráfico de ambos os rins saudáveis e doentes,2,3,4,5,6 . Endocitose de proteínas de superfície celular tem demonstrado ser essencial para a sobrevivência dos podócitos7. Nefrina e podocalyxin são proteínas transmembrana expressadas em podócitos. Nefrina é a espinha dorsal do diafragma fenda glomerular, enquanto podocalyxin é um sialoglycoprotein revestimento os processos secundários pé de podócitos8,9,10. Endocítica tráfico tem sido mostrado anteriormente para Nefrina podocalyxin3,11,12,13,e14.
O melhor de nosso conhecimento, endocitose das proteínas de superfície celular ainda não foi descrita em células endoteliais glomerulares na literatura. No entanto, as células endoteliais expressam em geral todas as proteínas necessárias para os diferentes tipos de endocitose (ou seja, dependente da jangada, dependente de Clatrina endocitose)15,16. Portanto, a célula endotelial tráfico de superfície pode ser estudado com esse método, usando, por exemplo, vascular endothelial (VE)-caderina e molécula de adesão intracelular (ICAM-2), como uma célula de superfície proteínas marcador para células endoteliais glomerulares17 .
Infelizmente, não há nenhum modelo exato em vitro para o delicado filtro glomerular em três camadas no qual célula tráfico de proteína pode ser estudado. O objetivo desse método é, portanto, para estudar proteína glomerular de tráfico na vivo. Além disso, este protocolo contém informações sobre como isolar os glomérulos, permitindo ainda mais a análise do RNA, proteínas ou células glomerular. Semelhante isolamento glomerular técnicas têm sido descritas por diferentes grupos de18,19.
Anteriormente, nós e os outros têm usado ex vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular por biotinylation2,3,4,20,21. No entanto, neste método ex vivo , glomérulos isolados foram expostos ao estresse mecânico, que pode influenciar o tráfico endocítica. Alternativamente, imunofluorescência rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular tem sido usado extensivamente na literatura2,20,22. Com este método, no entanto, apenas um pequeno número de proteínas pode ser analisado dentro de um slide, e quantificação das imagens de imunofluorescência é muitas vezes difícil.
Este método de romance na vivo oferece uma ferramenta confiável para estudar células glomerulares proteína abundância e tráfico com precisão em saudáveis e doentes os rins, e pode ser usada como um complemento para testes de imunofluorescência.
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Protocol
Os ratos foram obtidos como uma raça in-house da instalação de cuidados animais locais ou de Janvier Labs em França. As investigações foram conduzidas de acordo com as diretrizes descritas no guia de cuidados e uso de animais de laboratório (E.U. nacional institutos de saúde publicação n º 85-23, revista em 1996). Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as aprovações institucionais relevantes (governo do estado LANUV AZ:84 número de referência-02.04. 2016.A435).
1. preparação dos instrumentos, soluções e equipamentos
- Preparar 1 L de solução salina tamponada fosfato suplementada com 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 0,1 mM de cloreto de cálcio (CaCl2) (PBSCM) e filtrá-la através de um filtro estéril.
- Prepare-se 5 mL de PBSCM estéril por rato para perfusão e colocá-lo no gelo.
- Para cada rato, prepare-se 5 mL de estéril PBSCM suplementado com biotina 0,5 mg/mL.
- Para cada rato, prepare-se 5 mL de PBSCM estéril e adicionar 0,8 x 108 de grânulos magnético (ex., 200 µ l de uma solução de grânulos/mL de 4 x 108 , sem tratamento prévio) para embolização de glomérulos. Prepare esta solução debaixo do banco de cultura de células para manter os grânulos magnéticos no original tubo estéril. Coloque esta solução no gelo.
- Preparar uma solução de resfriamento pela adição de glicina 100 mM para PBSCM (5 mL por rato) e mantê-lo no gelo.
- Fazer uma solução de colagenase (colagenase U/mL 0.378 A em PBSCM estéril). Por rato, Pipetar 1 mL da solução de colagenase em um tubo de 2 mL e colocá-lo no gelo.
- Para lavar, preparar estéril PBSCM (consulte a etapa 1.1) em 50 mL de um tubo e colocá-lo no gelo.
- Para perfusão, use uma bomba de seringa com um fluxo de 2,0 mL/min.
- Prepare uma seringa de 10 mL com agulha 21G. Colocar a ponta da agulha em um cateter de longa 20-30 cm (diâmetro interno, ID = 0,58 mm). Conectar o cateter (ID 0,58 mm) com um cateter curto 10cm (ID 0,28 mm) e corte a ponta do cateter menor oblíquo para uma fácil inserção na aorta de rato.
- Para procedimentos de ligadura durante a cirurgia, corte três 5-7 cm fios de seda (4-0, 6-0) por rato.
- Para a cirurgia, prepare-se 3 grampos cirúrgicos, 2 tesouras cirúrgicas, 2 pinças, 2 pinça fina, 1 tesoura fina e cotonetes. Prepare a anestesia (por exemplo, anestesia intraperitoneal cetamina 100mg/kg de peso corporal e xilazina 5 mg/kg de peso corporal).
- Para o isolamento de glomérulos de dois rins, use um coador de célula de 100 µm, dois tubos de 50 ml e um apanhador de ímã.
- Preparar CHAPS lise: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CAPS); 20 mM Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris) pH 7,5; sodiumchorlide de 50mm (NaCl); sodiumfluoride de 50mm (NaF); 15 mM at4P2O7; pH de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 0,1 mM 8.0; sodiumorthovanadate 2 mM; e adenosinetriphosphat de 2mm (ATP).
- Centrifugadores legais a 4 ° C.
2. cirurgia sob o microscópio
- Anestesiar o mouse (por exemplo, com xilazina/cetamina intraperitonealmente, consulte a etapa 1.11). Realize o teste do dedo do pé-beliscão para confirmar a anestesia adequada.
- Desinfecte o lado ventral do mouse com isopropanol 70%.
- Executar um corte mediano através da pele da pelve ao esterno e retirar a pele a fáscia abdominal usando uma pinça. Corte a pele em ambos os lados no meio do abdômen com tesoura cirúrgica.
- Alterar os instrumentos cirúrgicos. Aplique um corte mediano da xifoide até a bexiga através da camada muscular abdominal e dividi-los em quatro quadrantes, usando uma pinça e tesoura cirúrgica. Anexe o lado dois superior com grampos na direção do pescoço do mouse com duas pinças cirúrgicas.
Nota: O abdômen está agora aberto. - Colocar os órgãos viscerais à parte com um cotonete estéril e corte do ligamento frênico-hepática com uma tesoura bem.
- Prepare uma ligadura (com um fio de seda 4-0 a 6-0) em torno da aorta proximal das artérias renais na altura da glândula supra-renal com duas pinças bem. Aperte a ligadura da aorta proximal para abolir o fluxo sanguíneo com uma pinça.
- Livre a aorta distal da fáscia, gordura e outros tecidos e preparar uma ligadura ao redor da artéria hepática/mesentérica cranial das artérias renais usando uma pinça cirúrgica bem.
- Preparar uma ligadura (com um fio de seda 4-0 a 6-0) em torno da aorta distal das artérias renais e fixar a veia cava e aorta na altura da bifurcação.
- Corte um furo pequeno na aorta distal às artérias renais para que o buraco é metade do diâmetro da aorta. Colocou o cateter na aorta e corrigi-lo com a ligadura preparada.
Atenção: Evite bolhas no sistema de perfusão para evitar embolia gasosa. - Inicie a perfusão com o PBSCM gelada em uma taxa de fluxo de 2 mL/min.
- Corte um buraco na veia renal a nível das artérias renais com tesoura cirúrgica fina e aperte a ligadura ao redor das artérias hepáticas e mesentéricas.
Nota: A rins devem empalidecer após o início da perfusão.
3. in Vivo Biotinylation
- Mudança da seringa, livre de bolhas para PBSCM gelada suplementado com biotina 0,5 mg/mL para a rotulagem de superfície e perfundir rins com 5 mL em uma taxa de fluxo de 2 mL/min.
Nota: Misture as soluções PBSCM (por exemplo, rodando os tubos de 50 mL) suavemente para evitar a formação de bolhas dentro da solução. Após a aspiração da solução dentro da seringa, evacue quaisquer bolhas ou o ar da seringa. Use uma cânula extra (21G) na seringa para preencher o espaço na cânula que está conectado ao sistema de cateter. Finalmente, enfiar a seringa dentro da cânula com o cateter sem bolhas. - Altere a seringa sem bolhas para PBSCM gelada suplementado com glicina 100 mM para saciar os glomérulos e perfundir com 5 mL em um fluxo de 2 mL/min.
- Mudança da seringa, livre de bolhas para PBSCM gelada suplementado com 200 μL magnético grânulos/mL e perfundir os rins em 2 mL/min.
Nota: Na superfície renal, embolização de glomérulos com grânulos magnéticos marrons será visível.
4. isolamento de glomérulos de dois rins
- Remova os rins no hilo e a cápsula. Coloque os rins no gelo em 15 mL de PBSCM em um prato de cultura de célula de 10 cm. Eutanásia o mouse com deslocamento cervical sob anestesia depois da colheita, os rins. Os procedimentos de cirurgia e perfusão duram aproximadamente 20-22 min.
- Corte os rins nas peças de menores possível com uma nova lâmina de dois gumes. Mover o tecido em um tubo de 2 mL com 1 mL de colagenase A (ver passo 1.6) e digerir a 37 ° C por 30 min. Antes e depois da digestão, misture delicadamente com uma 1000 μL cortar a pipeta.
- Lave o tecido digerido através de um filtro de célula 100 μm usando PBSCM gelada. Suavemente, use o célula-raspador para picar o restante através de tecido o filtro célula e enxaguá-lo com PBSCM gelada depois de um volume total de 50 mL.
- Centrifugar a suspensão a 4 ° C 500 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado com pouco menos de 1,5 mL de PBSCM gelada enquanto num Vortex a pelota. Depois, colocar a suspensão glomerular em um novo tubo de 2 mL.
5. lavar roupa
- Use o apanhador de ímã para puxar os glomérulos para um lado. Aguarde 1 minuto antes de glomérulos moveram-se em direção do ímã.
- Remova o sobrenadante com uma pipeta μL de 1000 enquanto o tubo 2 mL permanece no apanhador de ímã. Durante a lavagem de primeira e segunda etapas (consulte a etapa 5.3), 250 μL do sobrenadante permanece dentro do tubo para evitar a perda de glomérulos. Execute este procedimento rapidamente para evitar deixar estruturas tubulares afundar até o fundo do tubo.
Nota: O procedimento de lavagem durará mais tempo caso contrário. - Retire o tubo de 2 mL do apanhador de ímã e adicionar 1 mL de PBSCM, pipeta e descer (muito importante), então vórtice.
- Volte a colocar o tubo no apanhador de ímã e recomeçar com passo 5.2.
- Repita as etapas de lavagem até que a pureza dos glomérulos atingiu 90%. Por isso, examine uma representante alíquota do sobrenadante sob um microscópio (40-100 X).
Nota: Glomérulos aparecerá como rodadas estruturas contendo grânulos magnéticos marrons. Estruturas alongadas são fragmentos tubulares e grânulos magnéticos livre aparecem como pontos de ronda marrons. Os restos da célula podem aparecer como estruturas volumosas. - Se a pureza é alcançada, estime a contagem de glomérulos dissolvendo os glomérulos em 1 mL de PBSCM. Após a mistura, pegue uma alíquota de 10 μL e conte os glomérulos sob o microscópio. Calcular o número de glomérulos com a seguinte equação: número final de glomérulos = número de glomérulos em 10 μL x 100 alíquota.
- Bem sucedido isolamento dos glomérulos leva a uma variedade de 10.000 40.000 glomérulos.
6. a proteína extração e imunoprecipitação (IP)
- Glomérulos cobrar por centrifugação a 4 ° C a 6800 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante enquanto estiver usando um apanhador de ímã e resuspenda o pellet em gelada do lysis (EG., 30.000 glomérulos em 300 μL; CAMARADAS, ver passo 1.11). Homogeneizar as amostras com um homogeneizador na velocidade máxima por 30 s e lyse-los no gelo por 30 min.
- Remover o material insolúvel por centrifugação a 15.000 x g, durante 30 min para 4 ° C. Pipete o sobrenadante, que inclui a célula lisada para um novo tubo de 1,5 mL. Descarte a pelota.
- Medir a concentração de proteína do líquido sobrenadante usando um bicinchoninic (BCA)-com base em método seguindo as instruções do fabricante. Uma bem sucedida lise de 30.000 glomérulos cede a uma quantidade de proteína glomerular 700-1.000 µ g/ml. Ajuste a quantidade de proteína igual com Lise.
- Tomar uma alíquota de 10% do volume total para glomerular lisado e adicionar 2 x Laemmli + dithiothreithol (TDT) antes de incubação por 5 min a 95 ° C.
- Para IP, incube o resto do lisado com grânulos de agarose streptavidin durante a noite a 4 ° C, um agitador de sobrecarga.
- Centrifugue os grânulos de agarose a 1000 x g por 3 min a 4 ° C, remover o sobrenadante e adicionar 800 μL de tampão de Lise para lavar os grânulos para o emperramento da proteína inespecíficos.
- Repita a lavagem 3 vezes e remover o sobrenadante completamente.
- Adicionar 30 μL de 2 x Laemmli + TDT e incubar a 95 ° C por 5 min.
- Carregar o lisado e sondas IP em um SDS 10% gel e funcione o gel de SDS V de 70 por 30 min, em seguida, a 20 mA por gel para 1,5 h. depois, borre o gel por 2 h em 200 mA em uma membrana de nitrocelulose.
- Bloquear a membrana de nitrocelulose durante a noite a 4 ° C, com 5% albumina de soro bovino (BSA) no tampão de lavagem.
- Incubar a membrana com o anticorpo de interesse durante a noite a 4 ° C. Lavar com buffer de 3 vezes por 5 min num agitador de lavagem e incubar a membrana com o anticorpo secundário HRP-marcados por 1h à temperatura ambiente. Repita a etapa de lavagem.
- Visualize o lisado e imunoprecipitação sondas na membrana, usando um agente quimioluminescente Super-resolução com uma câmera CCD.
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Representative Results
Para isolar glomérulos com precisão, é necessário perfundir murino rins com PBSCM primeiro. Perfusão com PBSCM transforma os rins pálidos (Figura 1A). Embolização de glomérulos com grânulos magnéticos será visível como pontos marrons na superfície do rim (Figura 1B). Isolamento de glomérulos com o apanhador de ímã pode apresentar contaminação com túbulos renais (Figura 1C). Antes de mais análise de glomérulos, pureza > 95% dos glomérulos precisa ser alcançado pelos glomérulos mais lavar (Figura 1D).
Na vivo biotinylation baseia-se na capacidade de rotular a célula superfície proteínas com biotina. Para estudar isso, rins murino são pintados com PBSCM ou não-celular-membrana permeável biotina. Como mostrado na Figura 2, biotina rotula os loops capilares em biotina-perfundidos, mas não em rins de controle do mouse. Para investigar proteínas de superfície celular do glomérulo etiquetados por na vivo perfusão de biotina, imunoprecipitação da fração dos extratos glomerulares biotina é executada. Figura 3 A demonstra que as proteínas transmembrana glomerular Nefrina e podocalyxin são immunoprecipitated dentro da fração de biotina. No entanto, em ratos de controle, sem Nefrina ou podocalyxin for detectada na fração de immunoprecipitated de proteínas biotinilado. Como um controle negativo, o proteína intracelular extracelular-sinal regulado p42 quinases e p44 (ERK) não são encontrados na fração de immunoprecipitated de proteínas biotinilado de controlo e de rins de biotina-perfundido de rato. Para confirmar se a Nefrina de proteína de superfície de célula é na verdade biotinilado por esse método, Nefrina é precipitada de controle e os rins de biotina-perfundido de rato. Para visualizar a biotina, a fração de immunoprecipitated está manchada com estreptavidina. Figura 3 B mostra biotinilado Nefrina em biotina-perfundidos mas não controlar os animais. Lisado controles indicam quantidades iguais de proteínas no controle e biotina-perfundidos animais. Proteína endotelial vascular endotelial (VE)-caderina é immunoprecipitated dentro da fração de biotina, como mostrado na Figura 3C. Em ratos de controle, não VE-caderina é precipitado, enquanto VE caderina está presente em lysates do controle e biotina-perfundidos animais. Molécula de adesão intracelular 2 (ICAM-2) é precipitada de biotina-perfundidos animais, e não ICAM-2 é encontrado em animais de controle. Lisados de controle e biotina-perfundidos animais mostram quantidades iguais de ICAM-2 (Figura 3C). Actina serviu como o controle de carregamento.
Esse método pode ser usado para quantificar a quantidade de proteínas de superfície celular glomerular em modelos de nefropatia (por exemplo, nefrite, nefrotóxicas, NTN). Na fase inicial de NTN [dia 1 (1D) após a injeção de soro NTN], a proteinúria aumenta rapidamente. Na fase posterior de NTN [dia 18 (18 d)], a proteinúria diminui significativamente. A Figura 4 mostra Nefrina abundância de superfície celular no início NTN (1D). Na vivo biotinylation ensaio (Figura 4A) mostra uma redução de Nefrina superfície celular em animais NTN comparados aos controles. A análise densitométricos mostra uma redução significativa de Nefrina biotinilado (57%) em animais NTN comparados aos controles (Figura 4C). Análise quantitativa de Nefrina total de actina revela que não houve diferença significativa entre os controles e os camundongos NTN (Figura 4B). Usando um p57 podocyte específico coloracao celular, podocyte números exibem quantidades iguais em animais NTN e controle (figuras 4 e 4E). A Figura 5 exibe os resultados de Nefrina abundância de superfície celular em tarde NTN (18 d). Figura 5 A mostra o ensaio biotinylation na vivo no controle e ratos NTN, indicando uma recuperação de Nefrina superfície celular. Análise densitométricos exibe sem diferenças significativas de célula superfície Nefrina no controle e ratos NTN (Figura 5B). Nefrina total foi reduzida em 25% em ratos NTN (Figura 5-C). Podocyte números foram menores em camundongos NTN comparados aos controles por aproximadamente 19% (figuras 5 e 5E).
Figura 1 : Perfusão renal e isolamento de glomérulos. (A) vista através do microscópio para o situs murino após perfusão com PBSCM. O cateter na aorta é indicado com uma seta. Perfusão com PBSCM leva os rins a empalidecer. (B) embolização de glomérulos com grânulos magnéticos aparecem como pontos marrons na superfície do rim. (C) Ver os embora o microscópio mostrando eu) contaminação dos glomérulos (marrons redondo estruturas); II) com túbulos (luz estruturas alongadas); e iii) detritos de células. A pureza dos glomérulos é aproximadamente 50%. Livre grânulos magnéticos aparecem como pontos marrons (ampliação 100x). (D) vista através do microscópio mostrando uma pureza de 95% dos glomérulos (ampliação 100x). Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: biotina detectada no loop capilar glomerular. Imagem representativa da imunofluorescência de glomérulos rato (C57BL/6) pintada com PBSCM (controle) e biotina (biotina). Biotina (verde) é visualizada pela estreptavidina no loop capilar glomerular somente em ratos perfundidos de biotina. Ratos do controle não mostram coloração glomerular biotina. WT1 (vermelho) é detectado no núcleo de podócitos em ambos os ratos. Esta figura foi modificada em uma publicação anterior de20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: In vivo biotina rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular. (A) Western blot-análise de immunoprecipitated (IP) biotinilado proteínas de superfície celular (IP: grânulos de agarose streptavidin) e lisados (lisados) dos rins de PBSCM-perfundidos (controle) e ratos de biotina-perfundidos (biotina). As proteínas transmembrana Nefrina e podocalyxin só são detectados em amostras de immunoprecipitated de rins de biotina-perfundido de rato. Em ratos de controle, Nefrina e podocalyxin não são detectadas em sondas de immunoprecipitated de rins de controle do mouse. Em lysates do controle e biotina-perfundidos animais, podocalyxin e total Nefrina são expressas igualmente em ambos os grupos. O proteína intracelular extracelular-sinal regulado p42 quinases e p44 (ERK) não são detectadas em sondas de immunoprecipitated de controle e os rins de biotina-perfundido de rato. Nos lysates de ambos os grupos de rato, ERK é detectado em quantidades iguais. Actina é manchada como um controle de carregamento. (B) Western blot-análise de immunoprecipitated Nefrina (IP: α-Nefrina) no PBSCM-perfundidos (controle) e ratos de biotina-perfundidos (biotina). No rins biotina-perfundidos, Nefrina é visualizada com estreptavidina coloração, enquanto nenhuma detecção para Nefrina é encontrada em ratos controle. A fração de immunoprecipitated de Nefrina (IP: α-Nefrina, WB: Nefrina) bem como a fração de lisado (lisado, WB: Nefrina) manchado para Nefrina mostrar quantidades iguais de Nefrina. Actina é usada como um controle de carregamento. Análise de borrão ocidental (C) de immunoprecipitated biotinilado proteína de superfície celular (IP: grânulos de agarose streptavidin) e lisados (lisados) dos rins de PBSCM perfundidos (controle) e ratos de biotina-perfundidos (biotina). A proteína do transmembrane marcador vascular endotelial (VE)-caderina e molécula de adesão intracelular 2 (ICAM-2) só são detectados na fração de immunoprecipitated de animais biotina-perfundidos. Em ratos de controle, não VE-caderina ou ICAM-2 são detectados. Actina serve como um controle de carregamento. Esta figura foi modificada em uma publicação anterior de20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Abundância de Nefrina proteína glomerular na nefropatia de nefrite cedo nefrotóxicas (NTN). (A) Western blot-análise de superfície Nefrina (IP: α-Nefrina, WB: streptavidin) e total Nefrina (IP: α-Nefrina ou lisado, WB: Nefrina) no controle e nefrotóxicos ratos tratados com soro (NTN d 1). Actina serve como um controle de carregamento. Comparados aos controles, NTN ratos tratados mostram reduzida superfície Nefrina célula (IP: α-Nefrina, WB streptavidin) comparados aos controles. (B) análise quantitativa de Nefrina total/actina no controle e ratos d NTN 1 [controle n = 4, NTN n = 6, diferenças não-significativas (ns)]. (C) Densitometric análise de célula superfície Nefrina (biotinilado Nefrina/total Nefrina) no controle e ratos NTN (* p < 0,01, controle n = 4, NTN n = 6). (D) imuno-histoquímica de p57 mostrando podócitos em controle e ratos d 1 NTN. (E) análise quantitativa de células positivas p57 por área de topete (μm2). (40 glomérulos por rato quantificada, ns). Borrão ocidental dados mostraram meios ± SD. Podocyte contagens mostram meios ± SEM. Unpaired t-teste com correção de Welch. Barra de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada em uma publicação anterior de20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Abundância de Nefrina proteína glomerular na nefropatia de nefrite tarde nefrotóxicas (NTN). (A) Western blot-análise de superfície Nefrina (IP: α-Nefrina, WB: streptavidin) e total Nefrina (IP: α-Nefrina ou lisado, WB: Nefrina) no soro controle e nefrotóxicos tratados ratos (NTN d 18). Em comparação com controles, NTN 18 ratos d mostram quantidades iguais de célula superfície Nefrina (IP: α-Nefrina, WB: streptavidin). NTN Tratado ratos em exibição dia 18 menos Nefrina total e actina serve como um controle de carregamento. (B) densitométricos análise exibe sem diferenças significativas na célula superfície Nefrina entre controles e ratos d NTN 18 (controle n = 4, NTN n = 3). (C) Densitometric análise de Nefrina total de actina. Em camundongos NTN no dia 18, há menos expressão de Nefrina comparada aos controles (controle n = 4, NTN n = 3, * * p < 0,001). (D) imuno-histoquímica de p57 mostrando podócitos em controle e NTN 18 d ratos. Existem menos células positivas p57 (vermelho) em ratos d 18 NTN, comparados aos controles. Esferas magnéticas aparecem como pontos pretos. (E) análise quantitativa de células positivas p57 por área de tufo glomerular (μm2) (* * * p < 0,0001, controle n = 2, NTN n = 2, 40 glomérulos por rato quantificados). Borrão ocidental dados mostraram meios ± SD. Podocyte contagens mostram meios ± análise estatística SEM.: unpaired t-teste com correção de Welch. Barra de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada em uma publicação anterior de20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método apresentado permite isolamento bem sucedido de glomérulos para investigar glomerular RNA ou proteína. Além disso, culturas de células glomerular primária podem ser realizadas de glomérulos isolados. Se biotina é aplicada antes de isolamento glomerular, rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular pode ser executada. Com este método, na vivo celular glomerular proteína tráfico pode ser estudado, e semi quantificação da abundância de proteína é possível. Os passos mais críticos para o teste com sucesso a abundância de proteínas de superfície celular glomerular são 1) desenvolvendo manual especialização em cirurgia do mouse especialmente canulação da aorta, 2) bolha-livre conexão das seringas para evitar ar embolização do glomérulos e 3) trabalham em condições bem geladas depois começou-se a perfusão com PBSCM.
Para esta técnica, manual especialização em cirurgia do mouse é essencial. Canulação da aorta é especialmente crítica, como a dissecção do vaso impedirá a perfusão dos rins. O corte da aorta deve ser grande o suficiente (cerca de 50% do diâmetro do vaso) para criar espaço suficiente para introduzir o cateter. Se o cateter é cortado na diagonal, a introdução do cateter na aorta será mais fácil. Além de dissecação, o cateter introduzido deve ser colocado alto dentro da aorta para não obstruir as artérias renais. Das artérias renais caso contrário não irão ser perfundidas com biotina e os grânulos magnéticos.
Biotina é uma vitamina de pequena que se liga com alta afinidade às proteínas estreptavidina. Por causa de seu pequeno tamanho (Da 244), biotina não altera a função das proteínas conjugadas e será filtrada através do glomérulo. De incubação com estreptavidina, biotinilado proteínas facilmente podem ser separadas das proteínas não marcas por grânulos de agarose ou outros métodos. N-hydroxysuccimide (NHS) ésteres de biotina vincular a amina (-NH2) grupos de proteínas, que são abundantes em cadeias laterais de resíduos de lisina, por exemplo. Sulfo-NHS-LC-biotina é água solúvel e célula-impermeável, se as membranas celulares estão intactas. Sulfo-NHS-LC-biotina foi mostrado para rotular de proteínas de superfície celular23. Vinculação de ésteres de NHS biotina para grupos amina é dependente do pH (7-9) e o uso de buffers de amina livre (ou seja, PBSCM). PBSCM com um pH de 7.4, portanto, foi usado para perfundir os rins de rato com biotina, pois combina propriedades fisiológicas ideais com ótima solubilidade e a função da biotina. Para saciar as proteínas depois da rotulagem, perfusão de PBSCM com glicina é executada, permitindo que a biotina livre tornar-se vinculado a grupos amina da glicina. Para evitar processos celulares após a morte do animal, é importante realizar a perfusão com solução gelada e continue trabalhando no gelo.
Semelhante ao ex vivo biotinylation métodos, o estresse mecânico de processamento glomérulos durante na vivo biotinylation protocolos maio também endocitose de impacto, rápida de sinalização de eventos e a integridade do RNA. Assim, é essencial que todas as etapas de processamento são executadas no gelo para reduzir o risco da atividade enzimática celular.
Contraste de modelos animais como os rins de nefrotóxicas soro nefrite (NTN) danos rato severamente. Em particular, NTN resulta em expansão mesangial, esclerose glomerular e lesões tubulares, levando à fibrose renal em estágio avançado da doença (42 dias)24. Perfusão deficiente de glomérulos esclerosados em modelos de doença pode levar a resultados parciais da abundância de proteína. Glomérulos esclerosados provavelmente não irão ser perfundidos com grânulos magnéticos e, portanto, não podem tornar-se isolado neste método. Em modelos de doença levando à esclerose glomerular grave, usando técnicas para isolar o glomérulo através de diferentes etapas de peneiramento pode ser uma alternativa ao método de grânulos magnético usado no presente protocolo25. No entanto, se glomérulos são severamente esclerosados, perfusão mesmo com biotina pode ser prejudicada. Além disso, a ex vivo biotinylation, no qual glomérulos extraídos são banhadas ex vivo em biotina soluções21, provavelmente não será vantajosa nestes modelos. Como alternativa, use de imunofluorescência para detectar a abundância de proteína em glomérulos severamente doentes pode ser vantajosa, como isso não depende da perfusão dos glomérulos.
Semi quantificação da abundância de proteínas usando esta técnica funciona bem por meio de densitometria. No entanto, pequenas diferenças na abundância de proteína podem ser perdidas como resultado do limite de detecção da densitometria.
A técnica descrita pode ser transferida para outros órgãos de animais que são perfundidos, desde que as estruturas de interesse são acessíveis através de técnicas de isolamento, ou a proteína de superfície de interesse é específica para a estrutura de uma célula tipo ou órgão. Apesar de todas as proteínas de superfície são biotinilado por essa técnica, usar um anticorpo específico para a imunoprecipitação levará a fração de expressão de proteínas de superfície celular da proteína específica (como mostrado para Nefrina em Figura 3B).
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Blanka Duvnjak pela sua assistência técnica excepcional. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 para M.W. e QU280/3-1 para QI. O financiador não tiveram nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados, análise de dados, a decisão de publicar e preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
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