Summary
Här presenterar vi ett protokoll för murina i vivo märkning av glomerulär yta cellproteiner med biotin. Detta protokoll innehåller information om hur att BEGJUTA mus njurar, isolera glomeruli och utföra endogena immunoprecipitation av proteinet av intresse.
Abstract
Proteinuri resultat från störningar av glomerulära filtret som består av fenestrated endotelet, glomerulära basalmembranet och podocytes med deras slit membraner. Glomerulära filtret, särskilt slitsbländaren, delikat struktur är beroende av samspelet mellan skilda cellproteiner yta. Studera dessa cell ytproteiner har hittills begränsats till in vitro- studier eller histologisk analys. Här presenterar vi en murin i vivo biotinylation märkning metoden, vilket möjliggör studier av glomerulär yta cellproteiner under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Detta protokoll innehåller information om hur att BEGJUTA mus njurar, isolera glomeruli och utföra endogena immunoprecipitation av ett protein av intresse. Semi kvantitering av glomerulär cell surface överflöd är lättillgänglig med denna nya metod, och alla proteiner tillgänglig för biotin perfusion och immunoprecipitation kan studeras. Isolering av glomeruli med eller utan biotinylation möjliggör dessutom ytterligare analys av glomerulär RNA och protein samt primära glomerulär cellkultur (dvs primära podocyte cell).
Introduction
Proteinuri är ett kännetecken för glomerulär skada och vanligen åtföljer störningar av den glomerulära filtret1. Det glomerulära filtret består av fenestrated endotelet, glomerulära basalmembranet och podocytes. Den känsliga molekylära strukturen av glomerulära filtret är mycket dynamisk och föremål för cell surface protein människohandel i både friska och sjuka njurar2,3,4,5,6 . Endocytos av cell surface proteiner har visat sig vara viktigt för överlevnaden av podocytes7. Nephrin och podocalyxin är transmembrana proteiner som uttrycks på podocytes. Nephrin är ryggraden i den glomerulära slitsbländaren, medan podocalyxin är en sialoglycoprotein beläggning den sekundära fot processen i podocytes8,9,10. Endocytic människohandel har tidigare visats för nephrin och podocalyxin3,11,12,13,14.
Till bäst av vår kunskap, har endocytos av cell ytproteiner inte ännu varit beskrivs i glomerulär endotelceller i litteraturen. Men uttrycker endotelceller i allmänhet alla nödvändiga proteiner för olika typer av endocytos (dvs. clathrin-beroende, flotte-beroende endocytos)15,16. Därför endotelceller ytan människohandel kan studeras med denna metod som använder, till exempel vaskulär endotel (VE)-cadherin och intracellulära vidhäftning molekyl (ICAM-2) som en cell surface markör protein för glomerulär endotelceller17 .
Tyvärr finns det ingen exakt in vitro- modell för delikat tre lager glomerulära filtret i vilken cell surface protein människohandel kan studeras. Målet med denna metod är således att studera glomerulär protein människohandel i vivo. Detta protokoll innehåller dessutom information om hur man isolera glomeruli, möjliggör ytterligare analys av glomerulär RNA, proteiner eller celler. Liknande glomerulär isolering tekniker har beskrivits av olika grupper18,19.
Tidigare har har vi och andra använt ex vivo märkning av glomerulär cell ytbehandlaproteinerna av biotinylation2,3,4,20,21. Dock i detta ex vivo Metod utsattes isolerade glomeruli för mekanisk stress, som kan påverka endocytic människohandel. Alternativt, immunofluorescens märkning av glomerulär cell ytproteiner har flitigt använts i litteratur2,20,22. Med denna metod, dock endast ett litet antal proteiner kan analyseras inom en bild och kvantitering av immunofluorescens bilder är ofta svårt.
Denna roman i vivo Metod erbjuder ett tillförlitligt verktyg för att studera glomerulär cell surface protein överflöd och människohandel korrekt i friska och sjuka njurar, och den kan användas som ett tillägg till immunofluorescens tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Möss erhölls som en egen ras från lokala djurvård anläggningen eller från Janvier Labs i Frankrike. Undersökningarna genomfördes enligt de riktlinjer som beskrivs i handboken för skötsel och användning av försöksdjur (US nationella institut för hälsa publikation nr 85-23, reviderad 1996). Alla djurförsök har utförts i enlighet med de relevanta institutionella godkännanden (delstatsregeringen LANUV referens nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. beredning av instrument, lösningar och utrustning
- Förbereda 1 L av fosfatbuffrad saltlösning kompletteras med 1 mM magnesiumklorid (MgCl2) och 0,1 mM kalciumklorid (CaCl2) (PBSCM) och filtrera den genom ett sterilt filter.
- Förbereda 5 mL steril PBSCM per mus perfusion och placera den på isen.
- För varje mus, förbereda 5 mL steril PBSCM kompletteras med 0,5 mg/mL biotin.
- För varje mus, förbereda 5 mL steril PBSCM och lägga till 0,8 x 108 magnetiska pärlor (t.ex., 200 µL av en 4 x 108 pärlor/mL lösning, utan förbehandling) för embolisering av i glomeruli. Bered lösningen under cell kultur bänken att hålla de magnetiska pärlorna i det ursprungliga röret sterila. Placera denna lösning på is.
- Bered en släcka genom att lägga till 100 mM glycin PBSCM (5 mL per mus) och hålla den på is.
- Gör en kollagenas lösning (U/mL 0.378 kollagenas A i sterila PBSCM). Per mus, Pipettera 1 mL kollagenas lösningen i en 2 mL tub och placera den på is.
- Tvätt, förbereda sterila PBSCM (se steg 1.1) i en 50 mL tub och placera den på isen.
- För perfusion, använda en sprutpumpen med ett flöde av 2,0 mL/min.
- Förbereda en 10 mL spruta med en 21G nål. Placera spetsen på nålen i en 20-30 cm lång kateter (inre diameter, ID = 0,58 mm). Anslut katetern (ID 0,58 mm) med en 10 cm kort kateter (ID 0,28 mm) och skär spetsen av mindre katetern sned för en enkel insättning i mus aorta.
- För ligatur förfaranden under operationen, skär tre 5-7 cm silk trådar (4-0 6-0) per mus.
- För operationen, förbereda 3 kirurgiska klämmor, 2 kirurgisk sax, 2 pincett, 2 fina pincett, 1 fin sax och kompresser. Förbereda anestesi (t.ex. intraperitoneal anestesi ketamin 100 mg/kg kroppsvikt och xylazin 5 mg/kg kroppsvikt).
- För isolering av glomeruli två njurar, använda en 100 µm cell SIL, två 50 ml rör och en magnet catcher.
- Förbereda käkar lyseringsbuffert: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (käkar); 20 mM Tris (hydroxymetyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 mM sodiumchorlide (NaCl). 50 mM sodiumfluoride (NaF); 15 mM Na4P2O7. 0,1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra pH 8,0; 2 mM sodiumorthovanadate; och 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
- Cool centrifuger till 4 ° C.
2. kirurgi Under lupp
- Söva musen (t.ex. med ketamin/xylazin intraperitonealt, se steg 1.11). Utför tå-nypa testet för att bekräfta korrekt anestesi.
- Desinficera den ventrala sidan av musen med 70% isopropanol.
- Utföra en median klippa genom huden från bäckenet till bröstbenet och ta bort huden från buken fascia med pincett. Skära huden på båda sidor i mitten av buken med kirurgisk sax.
- Ändra kirurgiska verktyg. Applicera en median klippa från xiphoid till urinblåsan genom buken muskellagrar och dela in dem i fyra kvadranter med kirurgisk sax och pincett. Fäst det övre två åt sidan med klämmorna mot halsen på musen med två kirurgiska klämmor.
Obs: Buken öppnas nu. - Sätta viscerala organ åt sidan med en steril kompress och klipp den nedsatt-phrenic ligamentet med fina sax.
- Förbereda en ligatur (med en silkestråd 4-0 6-0) runt aorta proximala av njurartärerna på höjden av binjuren med två fina pincett. Dra åt den proximala aorta ligering för att avskaffa blodflödet med pincett.
- Gratis distala aorta från fascia, fett och andra vävnader och förbereda en ligatur runt leverfunktion/mesenterica artär kraniala av njurartärerna med fina kirurgisk pincett.
- Förbereda en ligatur (med en silkestråd 4-0 6-0) runt distala aorta av njurartärerna och klämma på vena cava och aorta på höjden av bifurkation.
- Skär ett litet hål i aorta distala till njurartärerna så att hålet är halva diametern av aorta. Sätta katetern i aorta och fixa det med förberedda ligatur.
Undvik bubblor i perfusion systemet för att förhindra luftemboli. - Börja perfusion med den iskalla PBSCM med en flödeshastighet av 2 mL/min.
- Skär ett hål i njurvenen på nivån för njurartärerna med fina kirurgiska saxar och dra åt ligering runt nedsatt och mesenterica artärerna.
Obs: Njurar bör blekna efter start perfusionen.
3. in Vivo Biotinylation
- Förändring sprutan bubbla-fri till iskall PBSCM kompletteras med 0,5 mg/mL biotin för surface märkning och BEGJUTA njurarna med 5 mL med en flödeshastighet av 2 mL/min.
Obs: Blanda PBSCM lösningar (t.ex. genom att vrida de 50 mL rör) försiktigt för att undvika bildar bubblor i lösningen. Efter aspiration av lösningen i sprutan, evakuera alla bubblor eller luft ur sprutan. Använda en extra kanyl (21G) på sprutan för att fylla utrymmet i den kanyl som är ansluten till katetern systemet. Slutligen hålla sprutan i kanylen med katetern utan bubblor. - Ändra sprutan bubbla-fri till iskall PBSCM kompletteras med 100 mM glycin för att släcka glomeruli och BEGJUTA med 5 mL vid ett flöde av 2 mL/min.
- Förändring sprutan bubbla-fri till iskall PBSCM kompletteras med 200 μL magnetiska pärlor/mL och BEGJUTA njurar vid 2 mL/min.
Obs: På njure ytan, embolisering av glomeruli med brun magnetiska pärlor kommer att visas.
4. isolering av Glomeruli från två njurar
- Ta bort njurarna på hilum och kapseln. Placera njurarna på is i 15 mL PBSCM i en 10 cm cell kultur maträtt. Avliva musen med cervikal dislokation under anestesi efter skörd njurarna. Kirurgi och perfusion förfaranden varar cirka 20-22 min.
- Skär njurarna i de minsta bitarna möjligt med ny dubbel kant blad. Flytta vävnaden till en 2 mL rör med 1 mL av kollagenas A (se steg 1,6) och smälta vid 37 ° C i 30 min. Före och efter matsmältningen, blanda försiktigt med 1000 μl skär pipett.
- Skölj smält vävnaden genom en 100 μm cell SIL med iskall PBSCM. Försiktigt använda cell-skrapan att finhacka det återstående vävnaden tråget cell silen och skölj med iskallt PBSCM därefter till en total volym om 50 mL.
- Centrifugera suspensionen vid 4 ° C 500 x g för 5 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med något mindre än 1.5 mL av iskall PBSCM medan vortexa pelleten. Efteråt, sätta glomerulär suspensionen i en ny 2 mL tub.
5. tvättning
- Använd magneten catcher för att dra i glomeruli till ena sidan. Vänta 1 minut innan glomeruli har flyttat mot magneten.
- Ta bort supernatanten med 1000 μl pipett 2 mL röret är fortfarande i magnet catcher. Under första och andra tvätt steg (se steg 5.3), 250 μL av supernatanten kvar i tuben för att undvika förlust av glomeruli. Utföra den här proceduren snabbt för att undvika att låta tubulära strukturer sjunka till botten av röret.
Obs: Tvätt förfarandet kommer att pågå längre annars. - Ta bort 2 mL röret från magnet catcher och tillsätt 1 mL PBSCM, pipett upp och ner (mycket viktigt), sedan vortex.
- Placera röret i magnet catcher och börja om med steg 5.2.
- Upprepa stegen tvätt tills renheten av glomeruli har nått 90%. För detta, undersöka en representativ alikvot av supernatanten i Mikroskop (40-100 X).
Obs: Glomeruli visas som runda strukturer som innehåller brun magnetiska pärlor. Avlånga strukturer är tubulära fragment och gratis magnetiska pärlor visas som bruna runda prickar. Cellfragment kan visas som skrymmande strukturer. - Om renhet nås, uppskatta antalet glomeruli genom upplösning i glomeruli i 1 mL PBSCM. Efter blandning, ta en alikvot av 10 μL och räkna glomeruli under mikroskopet. Beräkna antalet glomeruli med följande ekvation: slutliga antalet glomeruli = antalet glomeruli i 10 μL alikvotens x 100.
- Framgångsrika isolering av glomeruli leder till en rad 10,000-40,000 glomeruli.
6. protein utvinning och Immunoprecipitation (IP)
- Samla glomeruli genom centrifugering vid 4 ° C vid 6800 x g i 5 min. ta bort supernatanten medan du använder en magnet catcher och återsuspendera pelleten i iskall lyseringsbuffert (t.ex., 30.000 glomeruli i 300 μL; KÄKAR, se steg 1.11). Homogenisera proverna med en vävnad Homogenisatorer vid högsta hastighet för 30 s och lysera dem på is i 30 min.
- Ta bort olösligt material genom centrifugering vid 15 000 x g i 30 min för 4 ° C. Pipettera supernatanten som inkluderar cellen lysate in i en ny 1,5 mL tub. Kassera pelleten.
- Mätning av protein koncentrationen av supernatanten med hjälp av en bicinchoninic (BCA)-baserad metod följa tillverkarens instruktioner. En framgångsrik lys av 30.000 glomeruli ger en glomerulär protein mängden 700-1 000 µg/mL. Justera till lika protein mängder med lyseringsbuffert.
- Ta en alikvot av 10% av den totala volymen för glomerulär lysate och Lägg till 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) innan inkubation i 5 min på 95 ° C.
- För IP, inkubera resten av den lysate med streptividin agaros pärlor övernattning på 4 ° C på en overhead shaker.
- Centrifugera agaros pärlor vid 1000 x g i 3 minuter vid 4 ° C, avlägsna supernatanten och tillsätt 800 μL lyseringsbuffert att tvätta pärlorna för ospecifikt proteinbindning.
- Upprepa tvätten 3 gånger och ta bort supernatanten helt.
- Tillsätt 30 μL av 2 x Laemmli + DTT och inkubera vid 95 ° C i 5 min.
- Ladda den lysate och IP-sonder ett 10% SDS gel och kör SDS gelen vid 70 V för 30 min, sedan vid 20 mA per gel för 1,5 h. efteråt, blot gelen för 2 h på 200 mA på nitrocellulosa membran.
- Blockera nitrocellulosa membranet övernattning på 4 ° C med 5% bovint serumalbumin (BSA) tvätta buffert.
- Inkubera membranet med antikroppen sevärdheter över natten vid 4 ° C. Tvätta med tvätt buffert 3 gånger för 5 min på en shaker och inkubera membranet med HRP-taggade sekundära antikroppen för 1 h i rumstemperatur. Upprepa detta tvätt.
- Visualisera den lysate och immunoprecipitation sonder på membranet med en super-upplösning Kemiluminiscens agent med en CCD-kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att isolera glomeruli korrekt, är det nödvändigt att BEGJUTA murina njurarna med PBSCM först. Perfusion med PBSCM vänder njurarna blek (figur 1A). Embolisering av glomeruli med magnetiska pärlor kommer att visas som bruna prickar på njure ytan (figur 1B). Isolering av glomeruli med magnet catcher kan visa kontaminering med renal tubuli (figur 1C). Innan ytterligare analys av glomeruli, en > 95% renhet av glomeruli måste uppnås genom att tvätta glomeruli mer noggrant (figur 1D).
In vivo biotinylation är beroende av förmågan att märka cell ytproteiner med biotin. För att studera detta, är murina njurar perfusion med PBSCM eller icke-cell-membran genomsläpplig biotin. I figur 2visas etiketter biotin kapillär slingor i biotin-perfusion men inte i kontroll mus njurar. För att undersöka cell ytbehandlaproteinerna av den urin som märkt av i vivo biotin perfusion, utförs immunoprecipitation för biotin fraktionen av glomerulär extrakt. Figur 3 A visar att glomerulär transmembrana proteiner nephrin och podocalyxin är immunoprecipitated inom den biotin fraktionen. Dock i kontroll möss, har inga nephrin eller podocalyxin upptäckts i den immunoprecipitated fraktionen av biotinylerade proteiner. Som en negativ kontroll, intracellulära protein extracellulära-signalen reglerade kinaser p42 och p44 (ERK) inte finns i den immunoprecipitated fraktionen av biotinylerade proteiner i både kontroll och biotin-perfusion mus njurar. För att bekräfta att den cellen ytbehandlar protein nephrin är faktiskt biotinylerade av denna metod, fälls nephrin ut från kontroll och biotin-perfusion mus njurar. För att visualisera biotin, är den immunoprecipitated fraktionen målat med streptividin. Figur 3 B visar biotinylerade nephrin i biotin-perfusion men styra inte djur. Lysate kontroller visar lika mängder protein i kontroll och biotin-perfusion djur. Endothelial proteinet vaskulär endotel (VE)-cadherin är immunoprecipitated inom den biotin fraktionen som visas i figur 3C. I kontroll möss fälls ingen VE-cadherin, medan VE-cadherin är närvarande i lysates av kontroll och biotin-perfusion djur. Intracellulära vidhäftning molekyl 2 (ICAM-2) fälls ut från biotin-perfusion djur och ingen ICAM-2 finns i kontrolldjur. Lysates kontroll och biotin-perfusion djur visar lika mängder ICAM-2 (figur 3C). Aktin tjänstgjorde som kontrollen lastning.
Denna metod kan användas för att kvantifiera mängder glomerulär yta cellproteiner i modeller av nefropati (t.ex. nefrotoxiska nefrit, NTN). I den tidiga fasen av NTN [dag 1 (1 d) efter NTN seruminjektioner] ökar proteinuri snabbt. I den senare fasen av NTN [dag 18 (18 d)] minskar proteinuri betydligt. Figur 4 visar nephrin cell surface överflöd i tidig NTN (1 d). I vivo biotinylation analysen (figur 4A) visar en minskning av cell surface nephrin i NTN djur jämfört med kontroller. Densitometrisk analysen visar en signifikant minskning av biotinylerade nephrin (57%) i NTN djur jämfört med kontroller (figur 4C). Kvantitativ analys av totala nephrin till aktin avslöjar inga signifikanta skillnader mellan kontroller och NTN möss (figur 4B). Använda specifik färgning en p57 podocyte cell, podocyte nummer lika belopp visas i NTN och kontrolldjur (siffrorna 4 d och 4E). Figur 5 visar resultaten av nephrin cell surface överflöd i sena NTN (18 d). Figur 5 A visar i vivo biotinylation analysen i kontroll och NTN möss som anger en återhämtning av cellen ytbehandlar nephrin. Densitometrisk analys visar inga signifikanta skillnader i cell surface nephrin i kontroll och NTN möss (figur 5B). Totala nephrin minskade med 25% i NTN möss (bild 5C). Podocyte siffror minskade i NTN möss jämfört med kontroller av cirka 19% (siffrorna 5 d och 5E).
Figur 1 : Njure perfusion och isolering av glomeruli. (A) vy genom mikroskopet i den murina situs efter perfusion med PBSCM. Katetern i aorta indikeras med en pil. Perfusion med PBSCM leder njurarna att blekna. (B) embolisering av glomeruli med magnetiska pärlor visas som bruna prickar på njure ytan. (C) Visa dock mikroskopet visar jag) kontaminering av glomeruli (bruna runda strukturer); (II) med tubuli (lätta avlånga strukturer); och iii) cell skräp. Renhet av glomeruli är cirka 50%. Gratis magnetiska pärlor visas som bruna prickar (100 X förstoring). (D) Visa genom mikroskopet visar en 95% renhet av glomeruli (100 X förstoring). Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Biotin upptäcktes i glomerulär kapillär slingan. Representativa immunofluorescens bild av mus glomeruli (C57BL/6) perfusion med PBSCM (kontroll) och biotin (biotin). Biotin (grön) är visualiseras av streptividin i glomerulär kapillär slingan endast i biotin-perfusion möss. Kontroll möss visar inte glomerulär biotin färgning. WT1 (röd) upptäcks i kärnor av podocytes i både möss. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: In vivo biotin märkning av glomerulär yta cellproteiner. (A) Western blot analys av immunoprecipitated (IP) biotinylerade cell ytproteiner (IP: streptividin agaros pärlor) och lysates (lysate) av njurar från PBSCM-perfusion (kontroll) och biotin-perfusion (biotin) möss. De transmembrana proteiner nephrin och podocalyxin upptäcks endast i immunoprecipitated prover av biotin-perfusion mus njurar. I kontroll möss upptäcks nephrin och podocalyxin inte i immunoprecipitated sonder kontroll mus njurar. I lysates av kontroll och biotin-perfusion djur uttrycks totala nephrin och podocalyxin lika i båda grupperna. Intracellulära protein extracellulära-signalen reglerade kinaser p42 och p44 (ERK) inte upptäcks i immunoprecipitated sonder för kontroll och biotin-perfusion mus njurar. I lysates av båda mus grupper upptäcks ERK i lika stora mängder. Aktin är målat som en lastning kontroll. (B) Western blot analys av immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) i PBSCM-perfusion (kontroll) och biotin-perfusion (biotin) möss. I biotin-perfusion njurar visualiseras nephrin med streptividin färgning, medan ingen identifiering för nephrin återfinns i kontroll möss. Den immunoprecipitated fraktionen av nephrin (IP: α-nephrin, WB: nephrin) samt den lysate fraktionen (lysate, WB: nephrin) färgas för nephrin Visa lika mängder nephrin. Aktin används som en lastning kontroll. (C) Western blot analys av immunoprecipitated biotinylerade cell surface protein (IP: streptividin agaros pärlor) och lysates (lysate) av njurar från PBSCM perfusion (kontroll) och biotin-perfusion (biotin) möss. Transmembrana markör proteinet vaskulär endotel (VE)-cadherin och intracellulära vidhäftning molekyl 2 (ICAM-2) upptäcks endast i den immunoprecipitated fraktionen av biotin-perfusion djur. I kontroll möss upptäcks ingen VE-cadherin eller ICAM-2. Aktin fungerar som en lastning kontroll. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Glomerulär protein nephrin överflöd i tidig nefrotoxiska nefrit nefropati (NTN). (A) Western blot analys av surface nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptividin) och totala nephrin (IP: α-nephrin eller lysate, WB: nephrin) i kontroll och nefrotoxiska serum-behandlade möss (NTN 1 d). Aktin fungerar som en lastning kontroll. Jämfört med kontroller, NTN behandlade möss visar minskat cell surface nephrin (IP: α-nephrin, WB streptividin) jämfört med kontroller. (B) kvantitativ analys av totala nephrin/aktin i kontroll och NTN 1 d möss [styra n = 4, NTN n = 6, icke-signifikanta skillnader (ns)]. (C) Densitometric analys av cell surface nephrin (biotinylerade nephrin/total nephrin) i kontroll och NTN möss (* p < 0,01, styra n = 4, NTN n = 6). (D) immunohistokemi av p57 visar podocytes i kontroll och NTN 1 d möss. (E) kvantitativ analys av p57 positiva celler per tofs område (μm2). (40 glomeruli per mus kvantifierade, ns). Western blot data Visa medel ± SD. Podocyte räknas Visa medel ± SEM. Unpaired t-test med Welchs korrigering. Skalstapeln = 50 µm. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Glomerulär protein nephrin överflöd i sena nefrotoxiska nefrit nefropati (NTN). (A) Western blot analys av surface nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptividin) och totala nephrin (IP: α-nephrin eller lysate, WB: nephrin) i kontroll och nefrotoxiska serum behandlade möss (NTN 18 d). Jämfört med kontroller, NTN 18 d möss visar lika mängder cell surface nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptividin). NTN behandlade möss på dag 18 display mindre totala nephrin och aktin fungerar som en lastning kontroll. (B) Densitometrisk analys visar inga signifikanta skillnader i cell surface nephrin mellan kontroller och NTN 18 d möss (styra n = 4, NTN n = 3). (C) Densitometric analys av totala nephrin till aktin. I NTN möss på dag 18, finns det mindre uttryck för nephrin jämfört med kontroller (styra n = 4, NTN n = 3, ** p < 0,001). (D) immunohistokemi av p57 visar podocytes i kontroll och NTN 18 d möss. Det finns mindre p57 positiva celler (röd) i NTN 18 d möss jämfört med kontroller. Magnetiska pärlor visas som svarta prickar. (E) kvantitativ analys av p57 positiva celler per glomerulär tofs område (μm2) (*** p < 0,0001, styra n = 2, NTN n = 2, 40 glomeruli per mus kvantifieras). Western blot data Visa medel ± SD. Podocyte räknas Visa medel ± SEM. statistisk analys: oparade t-test med Welchs korrigering. Skalstapeln = 50 µm. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade metoden möjliggör framgångsrika isolering av glomeruli att undersöka glomerulär RNA eller proteiner. Primära glomerulär cellkulturer kan dessutom utföras från de isolerade glomeruli. Om biotin appliceras innan glomerulär isolering, kan märkning av glomerulär cell ytproteiner utföras. Med den här metoden i vivo glomerulär cell surface protein människohandel kan studeras och semi kvantitering av protein överflöd är möjligt. De mest kritiska steg för att framgångsrikt testa glomerulär cell surface protein överflöd är 1) utveckla manuell expertis i mus kirurgi särskilt kanylering av aorta, 2) bubbla-gratis anslutning av sprutor för att undvika luft embolisering av den glomeruli, och 3) arbetar under iskalla förhållanden när perfusion med PBSCM har börjat.
För denna teknik krävs manuell expertis i mus kirurgi. Kanylering av aorta är särskilt kritisk, som dissekering av fartyget kommer att förhindra genomblödning i njurarna. Snittet i aortan bör vara tillräckligt stor (cirka 50% av fartyget diameter) att skapa tillräckligt utrymme för att införa katetern. Om katetern skärs diagonalt, blir införande av katetern i aorta lättare. Utöver dissektion, bör introducerade katetern placeras högt inom aorta för att inte hindra njurartärerna. Njurartärerna kommer annars inte vara perfusion med biotin och magnetiska pärlor.
Biotin är ett litet vitamin binds med hög affinitet till streptividin proteiner. På grund av sin ringa storlek (244 Da), biotin påverkar inte funktionen av konjugerat proteiner och filtreras genom glomeruli. Genom inkubation med streptividin, kan biotinylerade proteiner lätt separeras från otaggade proteiner av agaros pärlor eller andra metoder. N-hydroxysuccimide (NHS) estrar av biotin binda till amine (-NH2) grupper av proteiner, som är rikligt på sida kedjor av lysin restprodukter, t.ex. Sulfo-NHS-LC-biotin är vatten lösliga och cell-impermeable, om cellmembran är intakta. Sulfo-NHS-LC-biotin har visat att märka cell ytproteiner23. Bindning av biotin NHS estrar till amine grupper är beroende av pH (7-9) och användning av amine-gratis buffertar (dvs. PBSCM). PBSCM med ett pH på 7,4 användes därför att BEGJUTA mus njurarna med biotin, eftersom den kombinerar perfekt fysiologiska egenskaperna med optimal löslighet och funktionen av biotin. För att släcka proteiner efter märkning, utförs genomblödning av PBSCM med glycin, tillåter gratis biotin att bli bundna till amine grupper av glycin. För att förhindra cellulära processer efter djuret, är det viktigt att utföra perfusion med en iskall lösning och fortsätta arbeta på is.
Liknar ex vivo biotinylation metoder, mekanisk stress bearbetning glomeruli under i vivo biotinylation protokoll maj också inverkan endocytos, snabb signalering händelser och RNA integritet. Det är därför viktigt att alla åtgärder för bearbetning utförs på is för att minska risken för enzymatisk cellulär aktivitet.
Proteinuric djurmodeller som nefrotoxiska serum nefrit (NTN) skada mus njurarna hårt. I synnerhet resulterar NTN i systemet expansion, glomerulär skleros och tubulär lesioner, leder till njure fibros i avancerade stadier av sjukdomen (42 dagar)24. Försämrad genomblödning av sclerosed glomeruli i sjukdomsmodeller kan leda till partisk resultat av protein överflöd. Sclerosed glomeruli kommer sannolikt inte vara perfusion med magnetiska pärlor och kan således inte bli isolerade i denna metod. I sjukdomsmodeller leder till svår glomerulär skleros, kan använda tekniker för att isolera glomeruli via olika siktning steg vara ett alternativ till den magnetiska pärlor-metod som används i detta protokoll25. Dock om glomeruli är allvarligt sclerosed, kan även perfusion med biotin försämras. Ex vivo biotinylation, där extraherade glomeruli är badade ex vivo i biotin lösningar21, kommer dessutom förmodligen inte vara en fördel i dessa modeller. Alternativt använda av immunofluorescens för att upptäcka protein överflöd i allvarligt sjuka glomeruli kan vara fördelaktigt, eftersom det inte bygger på perfusionen i glomeruli.
Semi kvantitering av protein överflöd med den här tekniken fungerar väl med hjälp av densitometry. Små skillnader i protein överflöd kan dock missas av detektionsgränsen för densitometry.
Den beskrivna tekniken kan överföras till andra animaliska organ som är perfusion, förutsatt att strukturerna av intresse nås med isolering tekniker eller surface proteinet av intresse är specifik för en cell typ eller orgel struktur. Även om alla ytproteiner är biotinylerade av denna teknik, kommer med en specifik antikropp för immunoprecipitation leda till fraktionen av cell surface proteinuttryck av specifika protein (som visas för nephrin i figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Blanka Duvnjak för hennes enastående teknisk assistans. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschafts (www.dfg.de) WO1811/2-1 till M.W. och QU280/3-1 till IQ Finansiären hade ingen roll i den studiedesign, datainsamling, dataanalys, beslut om att offentliggöra och beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
