Summary
כאן, אנו מציגים מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה בקלות מגה-פלקס gRNA וקטורים עבור גישות CRISPR/Cas9. STAgR הופך gRNA ריבוב פשוטה ויעילה, הניתנים להתאמה אישית.
Abstract
מערכת CRISPR/Cas9 חיידקי הגדילה מתודולוגי אפשרויות עבור המדענים החיים. בשל ניצול שלה, הנדסה גנטית, גנומית הפך החלים על מגוון רחב של מערכות. יתר על כן, רבים תעתיק גישות הנדסה epigenomic נמצאים כעת בדרך כלל ריאלי בפעם הראשונה. אחת הסיבות תחולתה הרחבה של CRISPR טמון טבעה דו-צדדי. GRNAs קטן לקבוע המטרות גנומית של המתחם, גרסאות של החלבון Cas9, ההשלכות מולקולרית מקומיים. עם זאת, גישות CRISPR רבות תלויות מסירת gRNAs מרובים בו זמנית לתוך תאים בודדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה המאפשרת ביטוי וקטורים בשיבוט יחיד הדור פשוטה, מהירה ויעילה של gRNA מרובבת צעד. STAgR היא חסכונית, מאז (ב פרוטוקול זה) רצפי מיקוד בודדים מוצגים על ידי הסככה קצר תחל בעוד תבניות DNA ארוך של הקלטות ביטוי gRNA ניתן להשתמש מחדש מספר פעמים. יתר על כן, STAgR מאפשר צעד בודד התאגדות של מספר גדול של gRNAs, כמו גם שילובים של גרסאות שונות gRNA, וקטורים, היזמים.
Introduction
מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR) היא שיטה המאפשרת דור לילה יעיל של וקטורים ביטוי המכיל ביטוי gRNA מספר קלטות בשיבוט יחיד אחד צעד. פרוטוקול STAgR אינה תלויה מומחה מומחיות או חומרים, ומציע אפשרויות מרובות עבור התאמה אישית.
החלבון CRISPR חיידקי Cas9 יש יכולת ייחודית. הוא מסוגל למצוא ואיגוד באופן סלקטיבי רק האלה רצפי DNA מקודד crRNAs טבעי או מהונדסים gRNAs1. ניצול שלו ככלי מולקולרית אפשרה מספר רב של גישות בלתי אפשרי, ישים או מוגבלת מסוימים דגמי הסלולר עד לאחרונה. אלה כוללים גנים יישוב מוטציות2, הנדסה גנום3, epigenome עריכה4,5,6, הפעלת גנים ברמת השעתוק ו ג'ין להשתיק7,8. ככל שאנחנו יודעים ש-CRISPR היא אוניברסלית הניתנות לפריסה, כמו דוחות של היישום שלה קיימות עבור מגוון רחב של אתרי היעד, סוגי תאים מינים. עם זאת, יישומים CRISPR רבים תלויים באופן ישיר או עקיף המסירה של gRNAs מרובים כולל סדרה של מניפולציות גנומית (translocations9,10, בינוני11 ו שינויים גנומית בקנה מידה גדול 12 , 13), אסטרטגיות17בהנדסת הגנום (שימוש Cas9 nickases14), דור של אללים מותנה11,15 או מוטציות טורי16והמעקב. יתר על כן, עבור גישות אחרות (תעתיק הנדסה18, epigenome19,הנדסה20) מספר אתרי מיקוד אינם חובה אך ורק, אולם שיגיעו האפקט המקסימלי שלהם לעתים קרובות רק מתחת לזה התנאי.
תוארו מספר שיטות שימושי ליצירת וקטורים gRNA המכילה אחד או יותר gRNA ביטוי קלטת21,22,23,24,25,26, 27. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור STAgR, gRNA הרכבה מחרוזת שיבוט, אשר יוצא מן הכלל שלה שילוב של פשטות, מהירות (לילה אחד בלבד שלב שכפול נדרש), עלות נמוכה (כמו תבניות DNA חוזר מספר פעמים), ההתאמה האישית (עבור מערכות gRNA שונים של היזמים) והיעילות (זה מאפשר את הדור של וקטורים המכיל מספר גבוה של קלטות gRNA)28.
STAgR באופן עקרוני ניתן להשתמש כדי ליצור ביטוי וקטורים עם מספר (1-2 gRNAs), מספר (3-5 gRNAs) וחלק המספר הגבוה ביותר של הביטוי קלטות שדווחו עד כה (6-8 gRNAs)28. באופן דומה, STAgR ישימה לכל רצף gRNA, עמוד השדרה או יזם. מאז. אולם, STAgR מתבסס בעיקר על תגובות שרשרת של פולימראז (PCR) והרכבה גיבסון, צריך ניתן להפיק gRNAs עם דמיון גבוה רצף שיטה חלופית.
Protocol
1. עיצוב של STAgR שיבוט אסטרטגיה
- להחליט על gRNA כמה קלטות ייכלל ביטוי אחד וקטור, ובאיזה סדר. לקבוע אילו היזמים, gRNA פיגומים אמור לשמש עבור כל אחד gRNAs. לעצב את gRNAs באמצעות כל כלי מקוון (למשל, www.benchling.com).
2. עיצוב של STAgR תחל עם המסוכך על שיבוט
הערה: על רצף protospacer טעם gRNA האחרונה, את antisense של gRNA הראשון בהתאמה יתווספו תחל ה-PCR המשמשות הגברה של עמוד השדרה וקטור (איור 1). רצפי הנותרים הם מוגבר ממחרוזות, ובכך הצמדת את החוש והן gRNAs antisense לפי הסדר הרצוי. המחרוזת הראשונה חתיכה מוגבר עם פריימר לפנים המכיל את gRNA הראשונה N20 רצף כמו להיות, פריימר הפוכה עם gRNA השני N20 רצף (הפוך המשלים) כמו להיות. כל החלקים הבאים נוצרים בהתאם.
- להוסיף רצפים gRNA N20 תחל ההגברה הקדמיים עבור מחרוזת STAgR DNA כפי חופות סלעיות (טבלה 1). להוסיף תחושה רצפים gRNA 5' פריימר לפנים "scf-FP" (עבור לפיגום קונבנציונלי) או "סאם-FP" (עבור לפיגום המכיל MS2). FP תחל anneal לחלק לגרדום/MS2 של המחרוזת STAgR בהתאמה (איור 1).
- להוסיף את המשלים הפוכה N20 gRNA רצף הרצפים פריימר הפוכה. לבחור RP תחל בהתאם היזמים ספציפי מחרוזות בשימוש (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).
3. הדור של STAgR שיבוט קטעים
- כדי להפיק את השברים שיבוט בודדים להרכבה גיבסון, לבצע מותני על-ידי הגדרת µL 10 של מאגר דיוק גבוה (HF), µL 1 של 10 מ מ dNTPs, µL 0.25 של הסככה-פריימר (100 מיקרומטר), 10 ng של ה-DNA תבנית (מחרוזת או וקטור), 0.5 µL HF פולימראז , µL 1.5 של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ולהוסיף H2O לעשות נפח סופי של 50 µL.
הערה: השתמש פלסמיד את "STAgR_Neo" כתבנית עבור עמוד השדרה ה-PCR לשלב לגרדום gRNA כדי gRNA האחרון, אם נבחרה לגרדום סאם, השתמש "STAgR_SAM". לדוגמה, עבור פלסמיד STAgR עם gRNA 6 קסטות מותני שישה הם הצורך, שחמש דקות עם ה-DNA מיתרים בתור תבניות ואחד עם עמוד השדרה וקטור כתבנית. - דגירה תגובות על thermocycler שימוש בתנאים הבאים: 1 מחזור 98 ° C עבור s 1 דקות 30; 38 מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 59 ° C (עבור gRNA לגרדום) / 68 מעלות צלזיוס (לולאה סם) 10 s, 72 ° C ל 30 s (עבור מוסיף) / 1 דקות 30 s (עבור וקטורים); מחזור 1 של 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להסיר 5.5 µL התגובה PCR, להוסיף צבע הטעינה ולנתח השברים מוגבר על ג'ל agarose 1%. עומס סולם הדנ א המתאים עבור שינוי גודל (100 bp DNA הסולם/1 kb DNA הסולם) ולהפעיל ג'ל ריצה ג'ל המתאים מאגר (למשל, מאגר TLE)-120 V למשך 30 דקות.
- בזמן הג'ל פועל, להוסיף 5 µL של המאגר סיפק את אנזים הגבלה ו- 0.5 µL Dpnאני (10 יחידות) כדי התגובה PCR 44.5 µL הנותרים דגירה למשך 30 דקות כדי h 1-37 מעלות צלזיוס.
- לבצע טיהור DNA באמצעות beads מגנטי.
- מוסיפים 1.8 beads מגנטי µL לכל 1 µL של מוצר ה-PCR ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- חרוזים נפרדים, שברי DNA שיורית נוזל עם מגנט. רחץ חרוזים פעמיים עם אתנול 70% על ידי שטיפה בגדר ללא resuspending לחלוטין.
- להסיר כל אתנול עם פיפטה ולתת את האוויר צניפה יבש.
- להמיס בגדר 15 – 20 µL H2O על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהפריד את החרוזים של הנוזל באמצעות מגנט. להעביר את תגובת שיקוע ברור צינור חדש.
הערה: לחלופין, ערכות ניקיון התגובה מבוססי עמודה יכול לשמש.
- לקבוע את ריכוז הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים כמתואר29.
4. גיבסון התגובה הרכבה ושינוי חיידקי
הערה: השלבים הבאים הם ממאמרו של גיבסון. et al. 30.
- להכין גיבסון תוצרת בית התגובה לערבב או להשתמש ערכת שיבוט מסחרי גיבסון.
- לשלב 3 מ ל ז 1 טריס (טריס (hydroxymethyl) aminomethane)-HCl ב- pH 7.5, 300 µL של MgCl מ' 1, 60 µL של 100 מ מ dGTP (deoxyguanosine טריפוספט), µL 60 של 100 מ מ dATP (deoxyadenosine טריפוספט), µL 60 של 100 מ מ dTTP (deoxythymidine טריפוספט), µL 60 של 100 מ מ dCTP ( deoxycytidine טריפוספט), µL 300 של 1 מ' DTT (dithiothreitol), 1.5 גר' פג-8000 (פוליאתילן גליקול), µL 300 מ"מ NAD (nicotinamide אדנין dinucleotide) ולהוסיף H2O להשיג 6 מ ל 5 × התגובה איזותרמי המאגר.
הערה: מאגר Aliquoted ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך 12 חודשים לפחות. - עבור תבנית הבסיס הרכבה גיבסון לערבב, לשלב µL 320 5 x תגובת איזותרמי מאגר עם µL 697 של H2O, להוסיף 3 µL של אקסונוקלאז U/µL T5 10, 20 µL של 2 U/µL DNA פולימראז ו- 160 µL של 40 U/µL Taq DNA ליגאז.
הערה: בשילוב זה יכול להיות aliquoted ומאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך 12 חודשים לפחות.
- לשלב 3 מ ל ז 1 טריס (טריס (hydroxymethyl) aminomethane)-HCl ב- pH 7.5, 300 µL של MgCl מ' 1, 60 µL של 100 מ מ dGTP (deoxyguanosine טריפוספט), µL 60 של 100 מ מ dATP (deoxyadenosine טריפוספט), µL 60 של 100 מ מ dTTP (deoxythymidine טריפוספט), µL 60 של 100 מ מ dCTP ( deoxycytidine טריפוספט), µL 300 של 1 מ' DTT (dithiothreitol), 1.5 גר' פג-8000 (פוליאתילן גליקול), µL 300 מ"מ NAD (nicotinamide אדנין dinucleotide) ולהוסיף H2O להשיג 6 מ ל 5 × התגובה איזותרמי המאגר.
- השתמש µL 7.5 של מיקס מאסטר הרכבה עם 2.5 µL של הוספה, וקטור. לתגובה x STAgR 2 להשתמש וקטור טוחנת כדי להוסיף יחס של 1:1 אך לא יותר מ 0.2 pmol של דנ א סה. עבור יותר מ-2 gRNA ביטוי קלטות, להשתמש וקטור כדי להוסיף יחס של 1:3 אך לא יעלה על סכום כולל ה-DNA של 0.5 pmol.
הערה: כל קלטות ביטוי מוגבר gRNA אמור לשמש בכמויות equimolar. כוללות פקד פלסמיד עם כמות זהה של וקטור אבל מסודר כדי לשלוט מעוכל תבנית וקטורית (ו/או מצדו עצמית). - דגירה דגימות ב 50 מעלות צלזיוס לדוגמאות חנות 45 עד 60 דקות על קרח או ב-20 ° C לשינוי עוקבות.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. - ישירות להפוך את מחצית התערובת חיידקים כשיר מבחינה כימית.
- הפשרת המוסמכת כימי TOP10 e. coli חיידקים על קרח.
- להוסיף 5 µL של המיקס גיבסון µL 50 של חיידקים כשיר. מערבבים בעדינות על ידי מצליף התחתון של הצינור. דגירה על קרח למשך 30 דקות.
- מבצע הלם חום על ידי הנחת הצינור באמבט מים 42 ° C או גוש חום עבור 45 s.
- להדליק את הצינורות קרח. להוסיף µL 250 SOC בינוני החיידק ולתת להם לשחזר ב- 37 מעלות צלזיוס חממה חזק למשך 30-45 דקות.
- לאחר התאוששות, צלחת החיידק טרנספורמציה על 1.5% lysogeny מרק (LB) אגר צלחות המכיל אמפיצילין (100 µg / mL) דגירה בין לילה ב 37 º C.
5. בחירת שיבוטים STAgR על ידי חיידקי המושבה PCR
- להכין לפחות שני סטים של 200 µL התגובה המבחנות (בין 3 24) כל לבנות, אשר מסומנות באופן זהה.
- למלא סידרה אחת בינונית LB µL 100, המכיל 100 µg / mL אמפיצילין.
- השתמש טיפ פיפטה סטרילי כדי לגרד את החומר הביולוגי של אחד מושבת חיידקים, להפיץ את זה בחלק התחתון של הצינור ריק של תגובת ה-PCR 100 µL. מיד להעביר את הטיפ הצינור השני התגובה המתאימה המכיל המדיום ליברות.
- מערבולת הטיפ סביב בעדינות כדי לוודא חלק מהחיידקים מועברים למדיה LB דגירה ב 37 ° C לשימוש מאוחר יותר.
- להגדיר את תערובת הבסיס PCR (10 µL לכל תגובה).
- עבור 10 תגובות, לשלב 10 מאגר Taq µL, 2 µL 10 מ מ dNTPs, 0.5 µL של פריימר (100 מיקרומטר), 0.5 µL של אנזימים ולהוסיף H2O נפח של 100 µL.
- להשתמש את תחל הבאה: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
- להוסיף 10 µL של המיקס מאסטר PCR הצינורות התגובה PCR שכותרתו בלי התקשורת ליברות.
- דגירה תגובות על thermocycler שימוש בתנאים הבאים: 1 מחזור 94 ° C למשך 5 דקות, 38 מחזורים של 94 ° C ל 30 s, 55 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; מחזור 1 של 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: התארכות זמן (שלב 72 ° C) צריך להיות מוגברת עם מספר קלטות ביטוי gRNA. חישוב גודל תיאורטי מוסיף באמצעות טבלה 2 ולהשתמש 1 דקות לכל 1 kb-72 מעלות צלזיוס. - להוסיף צבע הטעינה ולנתח השברים מוגבר על ג'ל agarose 1%. לטעון על סולם הדנ א המתאים עבור שינוי גודל (1kb סולם הדנ א) ולהפעיל את הג'ל המתאים בתוך הפעלת מאגר (למשל, מאגר TLE)-120 V למשך 30 דקות.
- לחשב את הגודל תיאורטי של אמפליקון בעזרת טבלה 2 על-ידי הוספת את הגדלים בודדים של היזמים בשימוש, פיגומים gRNA ומספר N20 רצפים. את התוצאות של המושבה, PCR, לזהות שיבוטים חיידקי בהתבסס על הגודל הנכון הלהקה אם הם נוטים הנמל וקטורים הנכון.
- לחסן 2.5 מ ל לילה תרבות ליברות (עם 100 אמפיצילין µg/mL) עם התרבות 100 µL המתאימים, להגדיר קודם לכן. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.
- תמצית ה-DNA פלסמיד באמצעות ערכת מיני פלסמיד מסחרי ו- הוראות היצרן31.
- רצף של פלסמידים באמצעות תחל את הבאים: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG), StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) על ידי סנגר רצף.
Representative Results
בעקבות פרוטוקול בהישג יד הופכת את הדור של אישית ריבוב gRNA הווקטורים האפשריים (איור 1). התוצאות נציג גישות STAgR באמצעות קלטות שונות gRNA שש מתוארת באיור2. איור 2 א מראה תוצאה אופיינית של מותני מנת להשיג את החלקים STAgR (פרוטוקול 3.1-3.3). Amplicons 6 (BB, S1-S5) מייצגים חתיכות DNA ליניארי המכיל את רצפי בודדים gRNA N20 על הקצוות שלהם. עמוד השדרה פלסמיד (BB) עכשיו מורחב עם רצפי מיקוד gRNA1, gRNA6, לכן יש חופף הנדרשים כדי שני אחרים מותני (S1 ו- S5) להרכבה גיבסון (איור 2א, טבלה 3). לאחר טיהור ניתן להשיג תשואה הדנ א של µg לפחות 1 עבור וקטורים והוספות.
לאחר ההרכבה גיבסון, טרנספורמציה חיידקי צריך לגרום מושבות חיידקים 100-700. איור 2 B מציג ניתוח נציג של מושבות חיידקים 10 דרך המושבה PCR, בעקבות פרוטוקול STAgR עם קלטות gRNA 6. אלקטרופורזה בג'ל מציין כי שלושה שיבוטים להראות את גודל אמפליקון הצפוי עבור הרכבה מלאה (טבלה 2). השני שיבוטים סביר שהתקבלו וקטורים STAgR המכיל אחד עד חמישה gRNA קלטות, ואילו אחד שיבוט (איור 2B, no.18) הוא ריק.
איור 1 : סקירה של עיצוב פריימר STAgR. הראשון מספר gRNA, פיגומים הם נבחר, ולאחר מכן gRNA סדר ו יזם האחרון, איזה סוג של וקטור אמור לשמש. עבור כל gRNA, מיועד פריימר לפנים ספציפי עם gRNA מיקוד רצף חוש התמצאות, או החלק משותף של "scf-FP" או "סאם-FP". באופן דומה, כדי ליצור פריימר הפוכה בודדים את הרצף מקדם המתאים (RP) התמזגו עם המשלים הפוכה של N20 רצף gRNA הבא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תוצאות נציג גישות STAgR באמצעות קלטות שונות gRNA שש- (א) נציג דוגמה ה-PCR של מוסיף חמש, כמו גם וקטור STAgR_Tomato. (B) PCR המושבה של 6 x תגובת STAgR באמצעות היזמים hU6, mU6, gRNA הקנוני, כמו גם סאם פיגומים. 22 מושבות חיידקים נותחו, מתוכם 7 הראה הלהקה צפויה המציינת את מכלול שלם. סולם: 1 kb פלוס, המספרים בזוגות בסיס (bp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פריימר לפנים על מיתרים, וקטור | |
| scaffold_fwd | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT |
| SAM_fwd | GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG |
| פריימר הפוכה על מיתרים, וקטור | |
| hU6_rev | CGGTGTTTCGTCCTTT |
| mU6_rev | CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG |
| hH1_rev | CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA |
| h7SK_rev | CCGAGGTACCCAAGCGG |
טבלה 1: פריימר רצפים gRNA פיגומים, היזמים.
| בגדלים של היזמים, פיגומים. | |
| hU6 | 265. לחץ דם |
| hH1 | 225. לחץ דם |
| mU6 | 316 bp |
| h7SK | 245. לחץ דם |
| gRNA לגרדום | 83. לחץ דם |
| SAMloop + gRNA לגרדום | 143. לחץ דם |
טבלה 2: גדלים תיאורטי של כל קלטת בביטוי כדי לחשב תוצאה PCR המושבה.
| hU6 | hH1 | mU6 | h7SK | STAgR_Neo | STAgR_tdTomato | |
| gRNA Scf | 400 bp | 360 bp | 451 bp | 380 bp | 3722 bp | 4487 bp |
| סאם | 460 bp | 420 bp | 511 bp | 440 bp | - | - |
טבלה 3: גודל של היזמים, פיגומים.
| hU6 | hH1 | mU6 | h7SK | STAgR_Neo | STAgR_tdTomato | |
| gRNA Scf | 368 bp | 328 bp | 419. לחץ דם | 348. לחץ דם | +74 bp | +67 bp |
| סאם | 428 bp | 388. לחץ דם | 479 bp | 408 bp |
טבלה 4: גודל מחושב חתיכות STAgR לאחר ה-PCR.
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור STAgR המאפשר הדור מהירה ופשוטה של פלסמידים ביטוי gRNA בגדלים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש בשלב אחד בדור של פלסמידים gRNA עם 2 – 8 קלטות של ביטוי gRNA (עם או בלי aptamers MS2 RNA שני) לתוך הווקטור הביטוי gRNA STAgR_Neo, ואת השימוש האנושי U6, העכבר U6, 7sK האנושי האנושי H1 היזמים28 ,32,33. אם יותר מ-4 קסטות הם הרצויה, מומלץ להשתמש לפחות שני סוגים שונים יזם/לגרדום כדי להגביר את היעילות. וקטורים אחרים, היזמים, יזם שילובים, כמו גם יותר מ- 8 קלטות gRNA יכול להיות ריאלי כמו גם; עם זאת, זה לא נבדק. למרות מניסיוננו שהשיטה עובדת בצורה אמינה, reproducibly, יש לנו נחוש שלבים קריטיים לפתרון בעיות אסטרטגיות מהי התוצאה הצפויה לא מיד להתבצע. מניסיוננו כמה צעדים הם מרכזי להצלחה של הגישה: בראש ובראשונה, חשוב להשתמש את היחס הנכון טוחנת של מוסיף לשדרת וקטור בשלב ההרכבה גיבסון (3:1). עם זאת, הבחנו לערכות gRNA קצת יחס 1:1 של מוסיף וקטוריים זה מועיל, גם כאשר מספר קלטות gRNA יעלה על שניים. שנית, התקופה של התגובה הרכבה גיבסון צריכה להיות ארוכה דיה (לפחות 45 דקות מומלץ).
STAgR יכול להיות מועסק עם מספר גדול של שינויים. פילוח רצפים, gRNA מספרים, פיגומים, היזמים, עמוד השדרה וקטור ניתן להיות אישית, בשילוב בחופשיות. עם זאת, כל צירוף ייתכן דרישות מעט שונות. מניסיוננו, אם בינונית או גבוהה מספר קלטות gRNA (> 4) רצוי אך לא לקבל באופן מיידי, בדרך כלל היא הדרך המהירה ביותר כדי להתגבר על בעיה זו כדי לשנות את הסדר של הקלטות gRNA בודדים בוקטור. באופן דומה, שילוב של gRNA שונים ובעלי פיגומים משפר את יעילות (ו ובכך מורידה את המספר הנדרש של מותני המושבה חייב להיות הבקיע) כאשר קלטות gRNA רבים הם משובטים. מצאנו כי שיבוטים שגוי בדרך כלל נוצרים על-ידי מפגש ספונטני של רצפים חוזרים ונשנים במהלך ההרכבה גיבסון. אמנם זה יכול להפחית את היעילות של השיטה, גם התוצאה הדור בו זמנית של וקטורים עם קבוצות משנה פונקציונלי gRNA28.
דור של ריבוב וקטורים gRNA המכילה אחד או יותר gRNA ביטוי קלטת דווחה עם מספר רב של שיטות שונות21,22,23,24,25, 26,27. בעוד כמה מעסיקים בו זמנית או רציפים שיבוט של gRNA זוגות22,34, אחרים תלויים הרכבה שער הזהב ואת מספר רציפים שיבוט שלבים25,35. גישה מיוחדת שימש. שייה et al., על ידי העסקת אנדוגני הסלולר tRNA עיבוד המערכת לחתוך מספר gRNAs מתוך תעתיק קדמון יחיד36. Advangetage של שיטה זו היא הדרישה של יזם אחד בלבד; החיסרון הוא הצורך שברי DNA מסונתז לאחרונה עבור כל שילוב gRNA. כל gRNA ריבוב שיטה יש יתרונות וחסרונות; STAgR משלב פשטות עם יעילות, מספר גבוה של קלטות gRNA אפשרי עם עלות נמוכה.
STAgR (ומערכות אחרות multiplexing) צפוי להיות אינסטרומנטלי הפעלת הפרעה יעיל (וגם בו זמנית) של מספר גנים ויוו, כמו חלוץ דג זברה המוח28. יישום נוסף בעתיד gRNA ריבוב וקטורים הוא ההבטחה של מניפולציה של תוכניות תעתיק מלא בניגוד אינדוקציה או דיכוי של גנים יחיד. סביר להניח, גישות אלה יאפשרו הפיכת תאים ואיברים -יהיה ברמה גבוהה יותר מאשר אפשרי היום.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה תודה פרופ ' ד ר סטפן בק, פרופ ' ד ר Jovica נינקוביק לקבל את התשומה שלהם, לעזור ולתמוך בפיתוח השיטה STAgR. טוביאס Klötzer, אנה Köferle, ולנטין באומן להערות מועיל. העבודה היא נתמכה על ידי DFG (STR 1385/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
| dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
| dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| Agarose | VWR | 443666A | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
| Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
| DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
| PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
| NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
| T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
| Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
| Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
| DNA Ladder 1 kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
| Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
| EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
| MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
| Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
| Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
| NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |
References
- Barrangou, R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biol. 16, 247 (2015).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).
- Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering. Genome Med. 7 (1), 59 (2015).
- Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology. BMC Genomics. 17 (1), 739 (2016).
- Jiang, J., et al. Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 6, 21918 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Wang, L., et al. Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos. Scientific Reports. 5, 17517 (2015).
- Zhang, L., et al. Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 10 (3), 0120396 (2015).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Bultmann, S., Stricker, S. H. Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics. Open Biology. 8 (3), (2018).
- Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators. FEBS Journal. , (2016).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Wrighton, K. H., et al. Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes. Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).
- Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
- Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), 147 (2014).
- Cress, B. F., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS ONE. 13 (4), 0196015 (2018).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1982).
- Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17 (1), 917 (2016).
- Koferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. Journal of Visualized Experiments. (130), e56264 (2017).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4, 5400 (2014).
- Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).
