Summary
여기, 선물이 문자열 어셈블리 gRNA 복제 (STAgR), CRISPR/Cas9 접근에 쉽게 gRNA 벡터를 다중화 하는 방법. STAgR은 gRNA 멀티플렉싱 간단 하 고 효율적인 사용자 정의 합니다.
Abstract
세균 CRISPR/Cas9 시스템은 실질적으로 생명 과학자에 대 한 방법론적 옵션을 증가 했다. 그것의 사용으로 인해 유전자와 게놈 엔지니어링 시스템의 넓은 범위에 적용 되었다. 또한, 많은 transcriptional epigenomic 엔지니어링 접근은 이제 처음으로 일반적으로 가능 하 고. CRISPR의 광범위 한 적용에 대 한 이유 중 하나는 분 자연에 있다. 작은 gRNAs의 복잡 한 게놈 대상, Cas9, 단백질의 변형 및 로컬 분자 결과 결정합니다. 그러나, 많은 CRISPR 접근 개별 셀에 여러 개의 gRNAs의 동시 제공에 따라 다릅니다. 여기, 우리는 문자열 어셈블리 gRNA (STAgR) 복제에 대 한 사용자 정의 프로토콜을 제시, 수 다중화 gRNA의 간단, 신속 하 고 효율적인 세대 단일 복제 식 벡터 방법 단계. STAgR (에이 프로토콜) 개별 대상 시퀀스는 도입 이후 짧은 오버행 뇌관에 의해 gRNA 식 카세트의 긴 DNA 서식 파일 다시 사용할 수 있는 여러 번 하는 동안 비용 효율적,입니다. 또한, STAgR gRNAs의 많은 다른 gRNA 변종, 벡터 및 발기인의 조합에의 한 단계 설립을 허용 한다.
Introduction
문자열 어셈블리 gRNA (STAgR) 복제 여러 gRNA 식 카세트 하나의 단일 복제에 단계를 포함 하는 식 벡터의 효율적인 하룻밤 생성을 활성화 하는 방법입니다. STAgR 프로토콜 전문 지식 또는 재료에 의존 하지 않는 하 고 사용자 지정에 대 한 여러 옵션을 제공 합니다.
세균 CRISPR 단백질 Cas9에 한 고유 용량이 있습니다. 그것은 찾아서 선택적으로 자연스럽 게 발생 crRNAs 또는 조작된 gRNAs1에 인코딩된 그 DNA 시퀀스만 바인딩할 수 있습니다. 분자 도구로 이용 불가능, unfeasible 접근 또는 특정 휴대 전화 모델을 최근까지 유일한 제한의 많은 수가 있었습니다. 타겟된 유전자 변이2, 게놈 엔지니어링3,4,,56, transcriptional 활성화 및 유전자7,8입을 편집 epigenome 포함 됩니다. 우리가 아는 한 CRISPR은 보편적으로 구축, 응용 프로그램의 보고서 다양 한 대상 사이트, 세포 유형 및 종에 대 한 존재 합니다. 그러나, 많은 CRISPR 응용 프로그램에 따라 달라 직접 또는 간접적으로 게놈 조작 (translocations9,10, 중간11 및 대규모 게놈 변경의 일련을 포함 하는 여러 gRNAs의 납품 12 , 13) 게놈 엔지니어링 (Cas9 nickases14의 사용), 조건부 대립11,15 또는 직렬 돌연변이16생성 및 추적 전략17. 그러나 또한, 여러 대상 사이트는 다른 접근 (transcriptional 엔지니어링18, epigenome 엔지니어링19,20)에 대 한 엄격 하 게 필수이 고, 그들은 도달 자주이 아래 에서만 그들의 최대 효과 조건입니다.
여러 가지 유용한 방법은 포함 하는 하나 이상의 gRNA 식 카세트21,22,23,,2425,26, gRNA 벡터 생성을 설명 되었습니다. 27. 여기, 선물이 뛰어난 단순의 조합 (하나의 하룻밤 복제 단계) 속도, 낮은 비용 (DNA 템플릿을 여러 번 다시 사용할 수 있습니다), STAgR, 문자열 어셈블리 gRNA 복제에 대 한 프로토콜 (에 대 한 사용자 다른 gRNA 시스템 및 발기인)와 효과 (gRNA 카세트의 높은 숫자를 포함 하는 벡터의 세대 수 있습니다)28.
STAgR 원리에서를 사용할 수 있는 몇 가지 (1-2 gRNAs)와 식 벡터 생성, 여러 (3-5 gRNAs)와 식 카세트의 가장 높은 번호의 일부 보고 지금까지 (6-8 gRNAs)28. 마찬가지로, STAgR는 gRNA 시퀀스, 백본 또는 발기인 적용 됩니다. 그러나, STAgR은 주로 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)과 깁슨 어셈블리에 기반 하 고, 높은 순서 상사 성 가진 gRNAs는 대체 방법을 사용 하 여 생성 되어야 합니다.
Protocol
1입니다. 디자인 전략을 복제 하는 STAgR의
- 결정에 얼마나 많은 gRNA 카세트 하나의 벡터와 어떤 순서로 포함 됩니다. 발기인 및 gRNA 결정은 gRNAs의 각 건설 기계를 사용 해야 합니다. 모든 온라인 도구 (예: www.benchling.com)를 사용 하 여는 gRNAs 디자인.
2. STAgR 복제 돌출부와 뇌관 디자인
참고: 마지막 gRNA의 의미 protospacer 시퀀스와 antisense 첫 번째 gRNA의 각각에 추가 됩니다 벡터 백본 (그림 1)의 증폭에 사용 되는 PCR 뇌관. 나머지 시퀀스는 그로 인하여 감각과 센스 gRNAs 원하는 순서로 연결 문자열에서 증폭 된다. 첫 번째 문자열 조각 첫 번째 gRNA 오버행으로 N20 시퀀스를 포함 하는 앞으로 입문서와 두 번째 gRNA N20 시퀀스 (역 보수) 오버행으로 역방향 뇌관 증폭. 모든 다음 조각은 그에 따라 생성 됩니다.
- STAgR DNA 문자열으로 돌출 (표 1)에 대 한 앞으로 확대 뇌관에 N20 gRNA 시퀀스를 추가 합니다. (기존 비 계)에 대 한 앞으로 뇌관 "scf-FP" 또는 "샘-FP" (MS2 포함 하 비)에 대 한 감각 gRNA 시퀀스 5'를 추가 합니다. FP 뇌관 anneal 각각 STAgR 문자열 (그림 1)의 비 계/MS2 부분에.
- 반전 뇌관 시퀀스를 역방향 보완 N20 gRNA 시퀀스를 추가 합니다. 문자열 사용 (hU6 RP, mU6 RP, 7sK-RP, H1-라인란트) 및 특정 발기인에 따라 RP 뇌관을 선택 합니다.
3입니다. 파편을 복제 하는 STAgR의 생성
- 고 충실도 (HF) 버퍼, 10mm dNTPs의 1 µ L, 오버행-뇌관 (100 µ M), 10의 0.25 µ L 10 µ L를 설정 하 여 PCRs 깁슨 어셈블리에 대 한 개별 복제 파편을 생성 하기 위해 수행은 DNA 서식 파일 (문자열 또는 벡터), 0.5 µ L HF 중 합 효소의 ng 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 1.5 µ L H2O 50 µ L의 최종 볼륨을 추가 하 고.
참고: 사용 플라스 미드 "STAgR_Neo" 템플릿으로 PCR 백본을 위한 마지막 gRNA에 gRNA 비 계를 통합 하 샘 비 계를 선택 하는 경우, "STAgR_SAM"를 사용 하 여. 6 gRNA 카세트와 STAgR 플라스 미드에 대 한 예를 들어 6 PCRs는 필요, 5 DNA와 서식 파일과 서식 파일으로 벡터 백본으로 문자열. - 품 어 thermocycler 다음과 같은 조건에 반응: 1 분 30 s; 98 ° C의 1 개 주기 10에 대 한 98 ° C의 38 주기 s, 59 ° C (gRNA 비 계) / 68 ° C (샘 루프) 10 s, 72 ° C 30에 대 한 (삽입)에 대 한 s / 1 분 30 s로 (벡터); 10 분 동안 72 ° C의 1 주기.
- PCR 반응에서 5.5 µ L를 제거, 로드 염료를 추가 하 고 1 %agarose 젤에 증폭 된 파편을 분석. 부하 조정 (100 bp DNA 사다리/1 kb DNA 사다리)와 실행 실행 하는 적절 한 젤 젤에 대 한 적절 한 DNA 사다리를 30 분 동안 120 V에서 버퍼 (예를 들어, TLE 버퍼).
- 젤 실행 되는 동안 추가 버퍼를 제공 하는 제한 효소와 0.5 µ L의 5 µ L DpnI (10 단위) 나머지 44.5 µ L PCR 반응 하 고 37 ° c.에서 1 시간 30 분 품 어
- 마그네틱 비즈를 사용 하 여 DNA 정화를 수행 합니다.
- PCR 제품의 1 µ L 당 1.8 µ L 자석 구슬을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 실 온 (RT)에서 2 분 동안 품 어.
- 별도 구슬 그리고 자석으로 잔여 액체에서 DNA 파편. 완전히 resuspending 없이 펠 릿을 rinsing 하 여 구슬 70% 에탄올으로 두 번 세척.
- 모든 에탄올을 피 펫을 제거 하 고 건조 한 펠 릿 공기.
- 아래로 pipetting으로 15-20 µ L H2O에서에서 펠 릿을 녹이 고 액체에서 자석을 사용 하 여 구슬을 분리. 새로운 튜브에 분명 상쾌한 전송.
참고: 또는, 반응 열 기반 정리 키트 사용할 수 있습니다.
- 29설명 되어 있는 대로 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 결정 합니다.
4. 깁슨 어셈블리 반응과 세균 변환
참고: 다음 단계는 깁슨 외. 에서 적응 30.
- 반응 혼합 하거나 상업 깁슨 복제 키트를 사용 하 여 만든 깁슨을 준비 합니다.
- 3 mL 1 M 트리 스 (Tris (hydroxymethyl) aminomethane)의 결합-pH 7.5, 1 M MgCl, 100 m m dGTP (deoxyguanosine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 mM dATP (deoxyadenosine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 m m dTTP (deoxythymidine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 mM dCTP (60 µ L의 300 µ L에서 HCl deoxycytidine 3 인산 염), 1 M DTT (dithiothreitol), 페그-8000 (폴 리 에틸렌 글리콜), 300 µ L 100 mm 나드 (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)의 1.5 g의 300 µ L H2O 5 × 등온 반응 버퍼의 6 mL를 추가.
참고: Aliquoted 버퍼 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 최소 12 개월 동안. - 깁슨 어셈블리 마스터에 대 한 혼합 하 고 H2O의 697 µ L 5 x 등온 반응 버퍼의 320 µ L를 결합 한 10 U / µ L T5 exonuclease의 3 µ L, 2 U / µ L DNA 중 합 효소의 20 µ L 40 U / µ L Taq DNA 리가의 160 µ L을 추가.
참고:이 혼합 수 aliquoted-20 ° C에서 저장 된 적어도 12 개월 동안.
- 3 mL 1 M 트리 스 (Tris (hydroxymethyl) aminomethane)의 결합-pH 7.5, 1 M MgCl, 100 m m dGTP (deoxyguanosine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 mM dATP (deoxyadenosine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 m m dTTP (deoxythymidine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 mM dCTP (60 µ L의 300 µ L에서 HCl deoxycytidine 3 인산 염), 1 M DTT (dithiothreitol), 페그-8000 (폴 리 에틸렌 글리콜), 300 µ L 100 mm 나드 (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)의 1.5 g의 300 µ L H2O 5 × 등온 반응 버퍼의 6 mL를 추가.
- 어셈블리 마스터 믹스의 7.5 µ L를 사용 하 여 삽입 및 벡터의 2.5 µ L로. 2 x STAgR 반응에 대 한 총에서 DNA의 1: 1만 이상 0.2 pmol의 비율을 삽입 하는 어 금 니 벡터를 사용 합니다. 2 개 이상의 gRNA 식 카세트에 대 한 벡터를 사용 하 여 1: 3의 비율을 삽입 하지만 0.5 pmol의 DNA 총액을 초과 하지 마십시오.
참고: 모든 증폭된 gRNA 식 카세트 아데닌 금액에 사용 되어야 한다. 플라스 미드 컨트롤 벡터만 소화 되지 않은 서식 파일 벡터 (또는 각자 결 찰)에 대 한 제어를 없음 삽입의 동일한 금액을 포함 합니다. - 샘플에 대 한 45 ~ 60 분이 게 샘플 얼음 50 ° C에 또는 후속 변환-20 ° C에서 품 어.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. - 직접 변환 믹스의 화학적 유능한 박테리아.
- 화학적으로 유능한 TOP10 대장균 박테리아 얼음에 녹여
- 유능한 박테리아의 50 µ L에 깁슨 믹스의 5 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브의 하단을 터치 하 여 혼합. 30 분 동안 얼음에 품 어.
- 42 ° C 물 목욕 또는 45에 대 한 열 블록에 튜브를 삽입 하 여 열 충격을 수행 s.
- 얼음에 다시 튜브를 넣어. 박테리아에 SOC 매체의 250 µ L을 추가 하 고 그들이 30-45 분 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에 복구.
- 복구 후 접시에 1.5 %lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지 암 피 실린 포함 된 변환된 박테리아 (100 µ g / mL)와 37 ° c.에서 밤새 품 어
5. 세균성 식민지 PCR에 의해 STAgR 클론 선택
- 각 구문에 대 한 (3, 24) 사이 200 µ L PCR 반응 관의 적어도 2 세트 준비는 동일 하 게 표시 됩니다.
- 100 µ L 파운드 매체 100 µ g를 포함 한 세트를 채우기 / mL 암 피 실린.
- 1 세균성 식민지의 생물학 물자에서 처음에 살 균 피 펫 팁을 사용 하 고 빈 100 µ L PCR 반응 관의 하단에 그것을 확산. 즉시 파운드 매체를 포함 하는 두 번째 해당 반응 관에 팁을 전송.
- 박테리아의 일부 파운드 미디어를 전송 하 고 나중에 사용에 대 한 37 ° C에서 품 어 부드럽게 팁을 주위를 소용돌이 친다.
- PCR 마스터 믹스 (반응 당 10 µ L)를 설정 합니다.
- 10 반응에 대 한 10 µ L Taq 버퍼, 2 µ L 10 mM dNTPs, 뇌관 (100 µ M), Taq 중 합 효소의 0.5 µ L의 0.5 µ L를 결합 하 고 H2O 100 µ L의 볼륨을 추가 합니다.
- 다음 프라이 머를 사용 하 여: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
- LB 미디어 없이 레이블이 PCR 반응 관에 PCR 마스터 믹스의 10 µ L를 추가 합니다.
- 품 어 thermocycler 다음과 같은 조건에 반응: 30 94 ° C의 38 주기 5 분, 94 ° C의 1 사이클 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 2 분; 10 분 동안 72 ° C의 1 주기.
참고: 신장 시간 (72 ° C 단계) gRNA 식 카세트의 수로 증가 한다. 표 2 를 사용 하 여 삽입의 이론적인 크기를 계산 하 고 72 ° c.에 1kb 당 1 분 사용 - 로드 염료를 추가 하 고 1 %agarose 젤에 증폭 된 파편을 분석. 크기 조정에 대 한 적절 한 DNA 사다리를 로드 (1 kb DNA 사다리) 실행에 적합 한 젤 30 분 120 V에서 버퍼 (예를 들어, TLE 버퍼)를 실행 하 고.
- 사용 된 발기인, gRNA 건설 기계 및 수 N20 시퀀스의 개별 크기를 추가 하 여 표 2 의 도움으로는 amplicon의 이론적인 크기를 계산 합니다. 식민지 PCR의 결과에서 올바른 밴드 크기 및 올바른 벡터 항구 가능성이 있는지 여부에 따라 세균성 복제품을 식별 합니다.
- 해당 100 µ L 문화, 이전 설정으로 (100 µ g/mL 암 피 실린)와 2.5 mL 하룻밤 파운드 문화를 예방. 37 ° C 12 h에서 품 어.
- 상업적인 플라스 미드 미니 키트와 제조 업체의 지침31를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 추출 합니다.
- 다음 프라이 머를 사용 하 여 플라스 미드를 순서: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) 및 StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) 생어 시퀀싱에 의해.
Representative Results
프로토콜에 따라 사용자 지정 된 멀티플렉싱 gRNA 벡터의 실현 (그림 1) 생성을 합니다. 6 다른 gRNA 카세트를 사용 하 여 STAgR 접근의 대표적인 결과 그림 2에 묘사 된다. 그림 2 A STAgR 조각 (3.1-3.3 프로토콜)를 사용 하는 PCRs의 전형적인 결과 보여줍니다. 6 amplicons (BB, S1-s 5) 그들의 끝에 개별 gRNA N20 시퀀스를 포함 하는 선형 DNA 조각을 나타냅니다. 플라스 미드 백본 (BB) gRNA1와 gRNA6의 대상 시퀀스와 지금 확장 하 고 따라서 두 개의 다른 PCRs (s 1과 s 5) 깁슨 어셈블리 (그림 2A, 표 3)에 필요한 오버랩을 소유한 다. 정화 후 벡터 및 삽입에 대 한 적어도 1 µ g의 DNA 수율을 얻을 수 있습니다.
깁슨 조립 후 세균 변환 100 700 세균성 식민지 발생 한다. 그림 2 B 식민지 PCR, 다음 6 gRNA 카세트와 STAgR 프로토콜을 통해 10 세균성 식민지의 대표적인 분석을 보여줍니다. 젤 전기 이동 법 3 클론 전체 어셈블리 (표 2)에 대 한 예상된 amplicon 크기를 보여을 나타냅니다. 다른 복제 가능성이 받은 STAgR 벡터를 포함 하는 1-5 gRNA 카세트, 한 복제 (그림 2B, No.18)는 빈.
그림 1 : STAgR 뇌관 설계의 개요. 첫 번째 gRNA 번호와 건설 기계 있습니다 선택한 다음 gRNA 순서 및 발기인 및 마지막으로, 벡터의 어떤 종류를 사용 해야 합니다. 각 gRNA 감각 방향 및 일반적인 부분의 "scf-FP" 또는 "샘-FP" 시퀀스를 대상으로 하는 gRNA와 특정 앞으로 뇌관 설계 되었습니다. 마찬가지로, 개별 역 뇌관 해당 발기인 순서를 생성 하기 위해 (RP)은 융합 다음 gRNA의 네 20 시퀀스의 반전 보수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 6 다른 gRNA 카세트를 사용 하 여 STAgR 접근의 대표적인 결과. (A) 5 삽입 벡터 STAgR_Tomato의 PCR의 대표적인 예입니다. STAgR 반응 샘 건설 기계 뿐만 아니라 hU6 및 mU6 발기인 및 정식 gRNA를 사용 하 여 x 6 (B) 식민지 PCR. 22 세균성 식민지의 7 나타났다 완전 한 어셈블리를 나타내는 예상된 밴드 분석 되었다. 사다리: 1 kb 플러스, 기본적인 쌍 (bp)에 숫자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 문자열 및 벡터에 대 한 입문서를 전달 | |
| scaffold_fwd | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT |
| SAM_fwd | GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG |
| 문자열 및 벡터에 대 한 역방향 뇌관 | |
| hU6_rev | CGGTGTTTCGTCCTTT |
| mU6_rev | CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG |
| hH1_rev | CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA |
| h7SK_rev | CCGAGGTACCCAAGCGG |
표 1: 뇌관 시퀀스 gRNA 건설 기계 및 발기인.
| 발기인 및 건설 기계 크기입니다. | |
| hU6 | 265 혈압 |
| hH1 | 225 bp |
| mU6 | 316 혈압 |
| h7SK | 245 혈압 |
| gRNA 비 계 | 83 혈압 |
| SAMloop + gRNA 발판 | 143 혈압 |
표 2: 식민지 PCR 결과 계산 하려면 각 식 카세트의 이론적인 크기.
| hU6 | hH1 | mU6 | h7SK | STAgR_Neo | STAgR_tdTomato | |
| gRNA Scf | 400 bp | 360 혈압 | 451 혈압 | 380 혈압 | 3722 혈압 | 4487 혈압 |
| 샘 | 460 혈압 | 420 혈압 | 511 혈압 | 440 혈압 | - | - |
표 3: 발기인 및 건설 기계 크기입니다.
| hU6 | hH1 | mU6 | h7SK | STAgR_Neo | STAgR_tdTomato | |
| gRNA Scf | 368 혈압 | 328 혈압 | 419 혈압 | 348 혈압 | +74 bp | +67 bp |
| 샘 | 428 혈압 | 388 혈압 | 479 혈압 | 408 혈압 |
표 4: PCR 후 STAgR의 계산 된 크기.
Discussion
여기 우리가 현재 자세한 프로토콜 STAgR에 대 한 다양 한 크기의 gRNA 식 플라스 미드의 신속 하 고 간단한 세대 수 있습니다. 이 프로토콜 2-8 gRNA 식 카세트 (또는 두 MS2 RNA aptamers 없이)와 gRNA 플라스 미드의 원스텝 세대 gRNA 식 벡터 STAgR_Neo, 인간의 U6, 마우스 U6, 인간의 7sK와 인간 H1 발기인28 의 사용으로 사용 될 수 있습니다. ,3233. 이상 4 개의 카세트 바란다면 형식을 사용 하 여 두 개 이상의 다른 발기인/비 효율성을 증가 하는 것이 좋습니다. 다른 벡터, 발기인 및 발기인 조합으로 8 gRNA 카세트 수도 가능할 뿐; 그러나, 이것은 테스트 되지. 우리의 경험에서 방법은 안정적으로 그리고 reproducibly, 비록 우리는 중요 한 단계를 결정 하 고 문제 해결 전략 예상된 결과 즉시 발생 한다. 우리의 경험에서 몇 가지 단계는 접근의 성공을 위한 중추적인: 맨먼저, 그것은 깁슨 어셈블리 단계 (3:1)에서 벡터 백본 삽입의 올바른 어 금 니 비율을 사용 하는 것이 중요. 그러나, 우리는 일부 gRNA 집합에 대 한 벡터에 삽입의 1:1 비율 도움이 됩니다, gRNA 카세트 수 두를 초과 않도록 하는 경우에 것으로 나타났습니다. 둘째, 깁슨 어셈블리 반응의 기간을 충분히 긴 있어야 (적어도 45 분 권장).
STAgR 수정 많은 함께 사용할 수 있습니다. 대상 시퀀스, gRNA 숫자 및 건설 기계, 발기인 및 벡터 백본 사용자 지정 고 자유롭게 결합. 그러나, 각 조합에는 약간 다른 요구 사항이 있을 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 중간 또는 높은 경우 gRNA 카세트의 숫자 (> 4) 원하는 하지만 얻지 못하면 즉시, 일반적으로이 문제를 극복 하는 가장 빠른 방법은 개별 gRNA 카세트는 벡터에서의 순서를 변경 하는. 마찬가지로, 다른 gRNA 발기인 및 건설 기계 결합 효율 향상 (그리고 따라서 득점 해야 식민지 PCRs의 필요한 수를 낮춘 다) 때 많은 gRNA 카세트 복제 됩니다. 우리는 잘못 된 클론 깁슨 조립 하는 동안 반복된 시퀀스의 자연 스러운 결합에 의해 일반적으로 생성 됩니다 발견. 이 방법의 효율성을 줄일 수 있습니다, 하지만이 또한 기능 gRNA 하위 집합28와 벡터의 동시 발생을 발생 합니다.
포함 하는 하나 이상의 gRNA 식 카세트 gRNA 벡터 멀티플렉싱의 세대 다른 방법21,22,23,,2425의 번호와 함께 보고 되었습니다. 26,27. 일부 고용 동시 또는 순차적 gRNA 쌍22,34의 복제를 하는 동안 다른 골든 게이트 어셈블리 및 여러 순차적 복제 단계25,35에 따라 달라 집니다. 특별 한 접근은 단일 조상 대 본36에서 여러 gRNAs를 잘라 생 세포 tRNA 처리 시스템을 채용 하 여 시 외.에 의해 사용 되었습니다. 이 방법의 advangetage는 하나의 발기인;의 요구 사항 단점은 각 gRNA 조합에 대 한 새로 합성된 DNA 파편의 필요성입니다. 각 gRNA 다중화 하는 방법에는 장점과 단점이; STAgR은 효율성, 낮은 비용으로 가능한 gRNA 카세트의 높은 번호와 단순을 결합합니다.
STAgR (와 다른 멀티플렉싱 시스템) 됩니다 (효율과 동시) 중단 여러 유전자에 vivo에서,의 사용에 zebrafish 두뇌28개척으로. GRNA 멀티플렉싱 벡터의 또 다른 미래의 응용 프로그램에는 유도 또는 단일 유전자의 진압에 대조적으로 완전 한 transcriptional 프로그램의 조작에 대 한 약속 이다. 아마, 이러한 방식을 변형 세포와 장기에는 그것이 가능한 오늘날 보다 훨씬 더 높은 학위를 허용할 것 이다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 교수 박사 스테판 벡과 교수 박사 Jovica Ninkovic 그들의 입력에 대 한 감사, 도움말 및 STAgR 메서드를 사용 하면 개발에 지원 하 고 싶습니다. Tobias Klötzer, 안 나 Köferle 하 고 유용한 의견에 대 한 발렌틴 바 우만. 작품은 DFG (STR 1385/1-1)에 의해 지원 되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
| dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
| dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| Agarose | VWR | 443666A | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
| Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
| DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
| PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
| NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
| T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
| Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
| Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
| DNA Ladder 1 kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
| Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
| EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
| MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
| Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
| Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
| NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |
References
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- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).
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