Summary
Här presenterar vi sträng församlingen gärna kloning (STAgR), en metod för att enkelt multiplex gärna vektorer för CRISPR/Cas9 närmar sig. STAgR gör gärna multiplexing enkel, effektiv och anpassningsbar.
Abstract
Det bakteriella CRISPR/Cas9-systemet ökat väsentligt metodologiska alternativ för life forskare. Tack vare dess utnyttjande blev genetiska och genomisk engineering tillämpliga på ett stort utbud av system. Dessutom många transkriptionell och epigenetisk engineering metoder är nu allmänt genomförbara för första gången. En beror bred tillämpligheten av CRISPR på dess bipartit natur. Små gRNAs bestämma genomisk målen av komplexet, varianter av proteinet Cas9 och lokala molekylär konsekvenserna. Men beror många CRISPR metoder på samtidig leverans av flera gRNAs i enskilda celler. Här presenterar vi ett anpassningsbara protokoll för sträng församlingen gärna kloning (STAgR), en metod som möjliggör enkel, snabb och effektiv generering av multiplexade gärna uttryck vektorer i en enda kloning steg. STAgR är kostnadseffektiv, eftersom (i detta protokoll) införs individuell inriktning sekvenser av kort överhäng primers medan de långa DNA-mallarna av gärna uttryck kassetter kan återanvändas flera gånger. Dessutom tillåter STAgR enda steg införlivandet av ett stort antal gRNAs, samt kombinationer av olika gärna varianter, vektorer och initiativtagare.
Introduction
Sträng församlingen gärna kloning (STAgR) är en metod som möjliggör effektiv övernattning generation av uttrycket vektorer som innehåller flera gärna uttryck kassetter i en enda kloning steg. Protokollet STAgR beror inte på specialistkompetens eller material och erbjuder flera alternativ för anpassning.
Proteinet bakteriell CRISPR Cas9 har en unik kapacitet. Det ska kunna hitta och selektivt binder endast dessa DNA-sekvenser som kodats i naturligt förekommande crRNAs eller konstruerade gRNAs1. Dess utnyttjande som molekylära verktyg har möjliggjort ett stort antal strategier som var omöjligt, omöjligt eller endast begränsat till vissa cellular-modeller tills nyligen. Dessa inkluderar riktade genen mutationer2, genomet engineering3, epigenomet redigera4,5,6, transkriptionell aktivering och nedtystning7,8. Såvitt vi vet CRISPR är universellt distribuerbara, som rapporter om dess tillämpning finns för en rad mål platser, celltyper och arter. Men beror många CRISPR program direkt eller indirekt på leveransen av flera gRNAs inklusive en serie av genetiska manipulationer (flyttningar9,10, medellång11 och storskalig genomisk förändringar 12 , ( 13), genomet engineering (användning av Cas9 nickases14), generering av villkorlig alleler11,15 eller seriell mutationer16och spårning strategier17. Dessutom för andra metoder (transkriptionell engineering18, epigenomet engineering19,20) flera inriktning webbplatser inte är strikt obligatoriskt, men de når sin maximala effekt ofta endast under detta skick.
Flera användbara metoder har beskrivits för att generera gärna vektorer som innehåller mer än en gärna uttryck kassett21,22,23,24,25,26, 27. Här presenterar vi ett protokoll för STAgR, sträng församlingen gärna kloning, som är enastående i sin kombination av enkelhet och hastighet (endast en övernattning kloning steg behövs), låg kostnad (som DNA mallar kan återanvändas flera gånger), customizability (för olika gärna system och initiativtagare) och effektivitet (det gör generationen av vektorer som innehåller höga siffror gärna kassetter)28.
STAgR kan i princip användas för att generera uttryck vektorer med några (1 – 2 gRNAs), flera (3 – 5 gRNAs) och några av det högsta antalet uttryck kassetter rapporterats hittills (6 – 8 gRNAs)28. Likaså är STAgR tillämplig på gärna sekvens, ryggrad eller arrangören. Eftersom STAgR är dock främst baserad på polymeras kedjereaktioner (PCR) och Gibson montering, ska gRNAs med hög sekvens likheter genereras med hjälp av en alternativ metod.
Protocol
1. utformningen av STAgR kloning strategi
- Besluta om hur många gärna kassetter kommer att ingå i ett uttryck i vektor och i vilken ordning. Avgöra vilka initiativtagare och gärna ställningar ska användas för var och en av gRNAs. Designa gRNAs med hjälp av någon online-verktyg (t.ex. www.benchling.com).
2. design av STAgR kloning grundfärger med överhäng
Obs: Sense protospacer sekvensen av den sista gärna och antisense av den första gärna respektive läggs till PCR primers används för förstärkning av vektor ryggraden (figur 1). De återstående sekvenserna förstärks från strängarna, därmed fästa känsla och antisense gRNAs i önskad ordning. Den första strängen bit förstärks med en forward primer som innehåller den första gärna N20 sekvens som ett överhäng och en omvänd primer med den andra gärna N20 sekvens (omvänd komplement) som ett överhäng. Alla följande bitar genereras med detta.
- Lägga till N20 gärna sekvenser i framåt förstärkning primers för STAgR DNA sträng som överhäng (tabell 1). Lägga till sense gärna sekvenser 5' till framåt primer ”scf-FP” (för en konventionell byggnadsställning) eller ”sam-FP” (för en MS2 innehållande byggnadsställning). FP primers glödga den byggnadsställning/MS2 delen av strängen för respektive STAgR (figur 1).
- Lägga till omvänd komplementet N20 gärna sekvens reverse primer sekvenser. Välj RP primers beroende på specifika initiativtagare och strängar som används (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).
3. generation av STAgR kloning fragment
- För att generera de enskilda kloning fragment för Gibson montering, utföra primärvården genom att ställa in 10 µL HiFi (HF) buffert, 1 µL 10 mM dNTP, 0,25 µL av överhäng-primer (100 µM), 10 ng av DNA mall (sträng eller vektor), 0,5 µL HF-polymerasen , 1,5 µL av dimetyl sulfoxid (DMSO) och lägga till H2O för att göra en slutlig volym av 50 µL.
Obs: Plasmiden ”STAgR_Neo” som en mall för ryggraden PCR för att införliva den gärna byggnadsställningen till den sista gärna, om SAM scaffolden väljs, Använd ”STAgR_SAM”. För en STAgR plasmid med sex gärna kassetter till exempel är sex primärvården nödvändiga, fem med DNA strängar som mallar och en med vektor ryggraden som mall. - Inkubera reaktioner på en termocykler med följande villkor: 1 cykel 98 ° c för 1 min 30 s; 38 cykler av 98 ° C för 10 s, 59 ° C (för gärna byggnadsställning) / 68 ° C (för SAM loop) för 10 s, 72 ° C under 30 s (för skär) / 1 min 30 s (för vektorer); 1 cykel av 72 ° C i 10 min.
- Ta bort 5,5 µL av PCR-reaktionen, lägga till lastning färgämne och analysera de förstärkta fragment på en 1% agarosgel. Ladda en lämplig DNA-stege för dimensionering (100 bp DNA stege/1 kb DNA stege) och kör gelen i en lämplig gel kör buffert (t.ex., TLE buffert) vid 120 V för 30 min.
- När gelen är igång, tillsätt 5 µL buffert restriktionsenzym och 0,5 µL DpnI (10 enheter) till återstående 44,5 µL PCR-reaktionen och inkubera i 30 min till 1 h vid 37 ° C.
- Utföra DNA rening med hjälp av magnetiska pärlor.
- Lägg till 1,8 µL magnetiska pärlor per 1 µL av PCR-produkten och blanda genom pipettering upp och ner. Inkubera i 2 min i rumstemperatur (RT).
- Separat pärlor och DNA-fragment från kvarvarande vätskan med en magnet. Tvätta pärlor två gånger med 70% etanol genom att skölja pelleten utan omblandning helt.
- Ta bort alla etanol med en pipett och låt pelleten lufttorka.
- Lös upp pelleten i 15 – 20 µL H2O genom pipettering upp och ner och separera pärlorna från vätskan med hjälp av en magnet. Överföra klara supernatanten till en ny tub.
Obs: Alternativt kolumnbaserade reaktion sanering Kit kan användas.
- Fastställa DNA koncentrationer med en spektrofotometer som beskrivs på andra ställen29.
4. Gibson församlingen reaktion och bakteriell omvandling
Obs: Följande är anpassade från Gibson et al. 30.
- Förbereda en hemmagjord Gibson reaktion blanda eller använda en kommersiell Gibson kloning kit.
- Kombinera 3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymetyl) aminometan)-HCl vid pH 7.5, 300 µL av 60 µL av 100 mM dGTP (deoxyguanosine trifosfat), 60 µL av 100 mM dTTP (deoxythymidine trifosfat), 60 µL av 100 mM dATP (deoxyadenosin trifosfat), 1 M MgCl, 60 µL av 100 mM dCTP ( deoxycytidine trifosfat), 300 µL av 1 M DTT (Ditiotreitol), 1,5 g PEG-8000 (polyetylenglykol), 300 µL av 100 mM NAD (nikotinamid-adenin-dinukleotid) och lägga till H2O för att få 6 mL 5 × isotermiska reaktion buffert.
Obs: Aliquoted buffert kan förvaras vid-20 ° C under minst 12 månader. - För Gibson församlingen master mix, kombinera 320 µL av 5 x isotermiska reaktion buffert med 697 µL av H2O och tillsätt 3 µL av 10 U/µL T5 exonuclease, 20 µL av 2 U/µL DNA-polymeras och 160 µL av 40 U/µL Taq -DNA-ligase.
Obs: Denna blandning kan vara aliquoted och lagras vid-20 ° C i minst 12 månader.
- Kombinera 3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymetyl) aminometan)-HCl vid pH 7.5, 300 µL av 60 µL av 100 mM dGTP (deoxyguanosine trifosfat), 60 µL av 100 mM dTTP (deoxythymidine trifosfat), 60 µL av 100 mM dATP (deoxyadenosin trifosfat), 1 M MgCl, 60 µL av 100 mM dCTP ( deoxycytidine trifosfat), 300 µL av 1 M DTT (Ditiotreitol), 1,5 g PEG-8000 (polyetylenglykol), 300 µL av 100 mM NAD (nikotinamid-adenin-dinukleotid) och lägga till H2O för att få 6 mL 5 × isotermiska reaktion buffert.
- Använd 7,5 µL av församlingen master mix med 2,5 µL infoga och vektor. Använda en molar vektor för att infoga förhållandet 1:1 men inte mer än 0.2 pmol DNA totalt för en 2 x STAgR reaktion. För mer än 2 gärna uttryck kassetter, använda en vektor för att infoga förhållandet 1:3 men Överskrid inte DNA sammanlagt 0,5 pmol.
Obs: Alla förstärkta gärna uttryck kassetter bör användas i equimolar mängder. Inkludera en plasmid kontroll med identiska mängden vektor men ingen skär till kontrollen för osmält mall vektor (eller egen ligatur). - Inkubera prover vid 50 ° C i 45-60 min. Store prover på is eller vid-20 ° C för efterföljande omvandling.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Direkt förvandla hälften av blandningen i kemiskt behöriga bakterier.
- Tina kemiskt behöriga TOP10 E. coli -bakterier på is.
- Tillsätt 5 µL av Gibson mixen till 50 µL av behöriga bakterier. Blanda försiktigt genom att bläddra till botten av röret. Inkubera i isen i 30 min.
- Utföra en värme chock genom att placera röret i ett 42 ° C vattenbad eller ett värme block för 45 s.
- Få rören på isen. Tillsätt 250 µL av SOC medium till bakterierna och låta dem återhämta sig vid 37 ° C i en skakande inkubator för 30 – 45 min.
- Efter återhämtning, tallrik transformerad bakterierna på 1,5% lysogeny buljong (LB) agarplattor som innehåller ampicillin (100 µg / mL) och inkubera över natten vid 37 ° C.
5. att välja STAgR kloner av bakteriell kolonin PCR
- Förbereda minst två uppsättningar av 200 µL PCR reaktionsrören (mellan 3 och 24) för varje konstruktion, som är märkta identiskt.
- Fyll ett set med 100 µL LB medium innehållande 100 µg / mL ampicillin.
- Använd en steril pipettspetsen att skrapa det biologiska materialet av en bakteriell koloni och sprida den på botten av Tom 100 µL PCR reaktionsröret. Omedelbart överföra spetsen till andra motsvarande reaktionsröret innehållande LB medium.
- Snurra spetsen runt försiktigt för att säkerställa några av bakterierna överförs till LB media och inkubera vid 37 ° C för senare användning.
- Ställa in en PCR-master mix (10 µL per reaktion).
- 10 reaktioner, kombinera 10 µL Taq buffert, 2 µL 10 mM dNTP, 0,5 µL av primer (100 µM), 0,5 µL av Taq polymeras och lägga till H2O till en volym av 100 µL.
- Använd följande grundfärger: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
- Lägg till 10 µL av PCR huvudmixen märkt PCR-reaktion rören utan LB media.
- Inkubera reaktioner på en termocykler med följande villkor: 1 cykel av 94 ° C i 5 min, 38 cykler av 94 ° C för 30 s, 55 ° C för 30 s, 72 ° C under 2 min; 1 cykel av 72 ° C i 10 min.
Obs: Töjning tid (72 ° C steg) bör ökas med antalet gärna uttryck kassetter. Beräkna teoretiska storleken av vändskär med hjälp av tabell 2 och Använd 1 min per 1 kb vid 72 ° C. - Lägg till lastning färgämne och analysera de förstärkta fragment på en 1% agarosgel. Läsa in en lämplig DNA-stege för dimensionering (1kb DNA stege) och kör i lämpliga gelen kör buffert (t.ex., TLE buffert) vid 120 V för 30 min.
- Beräkna teoretiska storleken på ospädd med hjälp av tabell 2 genom att lägga ihop de enskilda storlekarna används initiativtagare, gärna ställningar och antal N20 sekvenser. Från resultaten av kolonin PCR, identifiera bakteriell klonerna utifrån rätt bandstorlek och huruvida de är benägna att hysa rätt vektorer.
- Inokulera en 2,5 mL övernattning LB kultur (med 100 µg/mL ampicillin) med motsvarande 100 µL kulturen, ställa in tidigare. Inkubera vid 37 ° C i 12 h.
- Extrahera plasmid DNA med hjälp av en kommersiell plasmid mini kit och tillverkarens instruktioner31.
- Sekvens av plasmider som använder följande grundfärger: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) och StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) av Sanger sekvensering.
Representative Results
Efter protokollet till hands gör generationen av anpassade multiplexering gärna vektorer genomförbart (figur 1). Representativa resultat av STAgR metoder med hjälp av sex olika gärna kassetter avbildas i figur 2. Figur 2 A visar ett typiskt resultat av de primärvården som används för att erhålla STAgR bitar (3.1-3.3 protocol). De sex amplikoner (BB, S1-S5) representerar linjära DNA-bitar som innehåller de enskilda gärna N20 sekvenserna på deras ändar. Plasmid ryggraden (BB) utökas nu med inriktning sekvenser av gRNA1 och gRNA6 och därför äger krävs överlappningar till två andra primärvården (S1 och S5) för Gibson montering (figur 2A, tabell 3). Efter rening kan DNA kapacitet på minst 1 µg för vektorer och skär uppnås.
Efter Gibson monteringen, bör bakteriell omvandling resultera i 100 till 700 bakteriekolonier. Figur 2 B visar en representativ analys av 10 bakteriekolonier via kolonin PCR, efter ett STAgR protokoll med sex gärna kassetter. Gelelektrofores anger att tre kloner visar den beräknade kopiestorlek för fullständig montering (tabell 2). Andra kloner sannolikt mottagna STAgR vektorer som innehåller en till fem gärna kassetter, medan en klon (figur 2B, No.18) är tom.
Figur 1 : Översikt av STAgR primer design. Första gärna nummer och ställningar är valt, sedan gärna order och arrangören och sista, vilken typ av vektorn bör användas. För varje gärna, är utformad för en specifik framåt primer med den gärna inriktning sekvens i avkänningen orientering samt den gemensamma delen av ”scf-FP” eller ”sam-FP”. Likaså för att generera den enskilda reverse primern motsvarande arrangören sekvensen smälts (RP) samman med det omvända komplementet av N20 sekvensen av den nästa gärna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa resultat av STAgR metoder med hjälp av sex olika gärna kassetter. (A) representativt exempel på en PCR av fem skär samt vektorn STAgR_Tomato. (B) kolonin PCR av en 6 x STAgR reaktion med hU6 och mU6 initiativtagare och kanoniska gärna liksom SAM ställningar. 22 bakteriekolonier analyserades, varav 7 visade förväntade bandet som visar komplett montering. Stege: 1 kb plus, nummer i baspar (bp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Forward primer för sträng och vektor | |
| scaffold_fwd | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT |
| SAM_fwd | GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG |
| Reverse primer för sträng och vektor | |
| hU6_rev | CGGTGTTTCGTCCTTT |
| mU6_rev | CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG |
| hH1_rev | CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA |
| h7SK_rev | CCGAGGTACCCAAGCGG |
Tabell 1: Primer sekvenser för gärna ställningar och initiativtagare.
| Storlekar av initiativtagare och ställningar. | |
| hU6 | 265 bp |
| hH1 | 225 bp |
| mU6 | 316 bp |
| h7SK | 245 bp |
| Gärna byggnadsställning | 83 bp |
| SAMloop + gärna schavotten | 143 bp |
Tabell 2: Teoretiska storlekar av varje uttryck kassett att beräkna kolonin PCR resultatet.
| hU6 | hH1 | mU6 | h7SK | STAgR_Neo | STAgR_tdTomato | |
| Gärna Scf | 400 bp | 360 bp | 451 bp | 380 bp | 3722 bp | 4487 bp |
| SAM | 460 bp | 420 bp | 511 bp | 440 bp | - | - |
Tabell 3: Storlekar av initiativtagare och ställningar.
| hU6 | hH1 | mU6 | h7SK | STAgR_Neo | STAgR_tdTomato | |
| Gärna Scf | 368 bp | 328 bp | 419 bp | 348 bp | +74 bp | + 67 bp |
| SAM | 428 bp | 388 bp | 479 bp | 408 bp |
Tabell 4: Beräknade storlekar av STAgR bitar efter PCR.
Discussion
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för STAgR möjliggör snabb och enkel generering av gärna uttryck plasmider av varierande storlek. Detta protokoll kan användas för one-step generation gärna plasmider med 2 – 8 gärna uttryck kassetter (med eller utan två MS2 RNA aptamers) in gärna uttryck vektorn STAgR_Neo, och användningen av mänskliga U6, mus U6, mänskliga 7sK och mänskliga H1 initiativtagare28 ,32,33. Om fler än fyra kassetter önskas, rekommenderas att använda minst två olika arrangören/byggnadsställning typer för att öka effektiviteten. Andra vektorer, initiativtagare och arrangören kombinationer samt fler än 8 gärna kassetter kan vara genomförbart samt; Detta har dock inte testats. Även om vår erfarenhet metoden fungerar tillförlitligt och reproducibly, har vi fastställt kritiska steg och felsökningsstrategier bör det förväntade resultatet inte omedelbart inträffa. Vår erfarenhet några steg är avgörande för framgången med metoden: först och främst är det viktigt att använda rätt molar nyckeltalen skär till vektor ryggraden vid Gibson församlingen steg (3:1). Vi märkte dock att för vissa gärna uppsättningar förhållandet 1:1 skär till vektor är fördelaktig, även när antalet gärna kassett överstiger två. För det andra, Gibson församlingen reaktionen bör vara tillräckligt lång (minst 45 min rekommenderas).
STAgR kan användas med ett stort antal ändringar. Inriktning sekvenser, gärna kan siffror och ställningar, initiativtagare och vektor ryggrader anpassas och fritt kombineras. Varje kombination kan dock ha lite olika krav. Vår erfarenhet om medium eller höga siffror gärna kassetter (> 4) är önskvärt men inte erhållits omedelbart, oftast det snabbaste sättet att lösa problemet är att ändra ordningen på de enskilda gärna kassetterna i vektorn. På samma sätt kombinera olika gärna initiativtagare och ställningar förbättrar effektiviteten (och således sänker antalet krävs för kolonin primärvården som har som skall poängsättas) när många gärna kassetter klonas. Vi hittade att felaktiga kloner vanligen genereras genom spontan konjunktionen upprepade sekvenser under Gibson montering. Även detta kan minska effektiviteten i metoden, resulterar detta också i samtidig framställning av vektorer med funktionella gärna delmängder28.
Generation av multiplexing gärna vektorer som innehåller mer än en gärna uttryck kassett har rapporterats med ett antal olika metoder21,22,23,24,25, 26,27. Medan vissa anställa simultana eller sekventiella kloning av gärna par22,34, beror andra på Golden Gate församling och flera sekventiella kloning steg25,35. Ett särskilt tillvägagångssätt har använts av Xie et al., genom att anställa endogena cellulära tRNA tillverkningssystemet att skära flera gRNAs ur en enda stamceller avskrift36. Advangetage av denna metod är kravet på endast en arrangören; Nackdelen är behovet av nya syntetiskt DNA-fragment för varje gärna kombination. Varje gärna multiplexing metod har fördelar och nackdelar; STAgR kombinerar enkelhet med effektivitet, hög antal möjligt gärna kassetter med låg kostnad.
STAgR (och andra multiplexering system) kommer sannolikt att bidra möjliggör effektiv (och samtidiga) störningar av flera gener i vivo, som banat väg i zebrafiskar hjärnor28. En annan framtida tillämpning av gärna multiplexering vektorer är löftet för manipulation av kompletta transkriptionell program i motsats till den induktion eller förtryck av enskilda gener. Dessa metoder gör troligt, att omvandla celler och organ på kommer i mycket högre grad än idag är det möjligt.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Prof. Dr. Stephan Beck och Prof. Dr. Jovica Ninkovic för deras insats, hjälp och stöd i att utveckla den STAgR metoden. Tobias Klötzer, Anna Köferle och Valentin Baumann för hjälpsamma kommentarer. Arbetet har stötts av DFG (STR 1385/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
| dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
| dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| Agarose | VWR | 443666A | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
| Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
| DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
| PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
| NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
| T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
| Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
| Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
| DNA Ladder 1 kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
| Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
| EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
| MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
| Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
| Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
| NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |
References
- Barrangou, R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biol. 16, 247 (2015).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).
- Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering. Genome Med. 7 (1), 59 (2015).
- Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology. BMC Genomics. 17 (1), 739 (2016).
- Jiang, J., et al. Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 6, 21918 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Wang, L., et al. Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos. Scientific Reports. 5, 17517 (2015).
- Zhang, L., et al. Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 10 (3), 0120396 (2015).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Bultmann, S., Stricker, S. H. Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics. Open Biology. 8 (3), (2018).
- Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators. FEBS Journal. , (2016).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Wrighton, K. H., et al. Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes. Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).
- Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
- Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), 147 (2014).
- Cress, B. F., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS ONE. 13 (4), 0196015 (2018).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1982).
- Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17 (1), 917 (2016).
- Koferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. Journal of Visualized Experiments. (130), e56264 (2017).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4, 5400 (2014).
- Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).
