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Genetics

स्ट्रिंग असेंबली gRNA क्लोनिंग (STAgR) के लिए एक अनुकूलन प्रोटोकॉल

Published: December 26, 2018 doi: 10.3791/58556
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 3, 2,4, 1,2
1MCN Junior Research Group, Munich Center for Neurosciences, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center, 2Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 3Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 4Physiological Genomics, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center

Summary

यहां, हम वर्तमान स्ट्रिंग विधानसभा gRNA क्लोनिंग (STAgR), CRISPR के लिए आसानी से मल्टीप्लेक्स gRNA वैक्टर के लिए एक विधि/Cas9 दृष्टिकोण । STAgR एकुण gRNA division सरल, कार्यक्षम व अनुकूलनीय.

Abstract

बैक्टीरियल CRISPR/Cas9 प्रणाली के जीवन वैज्ञानिकों के लिए methodological विकल्पों में काफी वृद्धि हुई है । इसके उपयोग के कारण, आनुवंशिक और जीनोमिक इंजीनियरिंग प्रणालियों की एक बड़ी रेंज के लिए लागू हो गया । इसके अलावा, कई transcriptional और epigenomic इंजीनियरिंग दृष्टिकोण अब आम तौर पर पहली बार के लिए व्यवहार्य हैं । CRISPR की व्यापक प्रयोज्यता का एक कारण इसकी द्विपक्षीय प्रकृति में निहित है । छोटे gRNAs जटिल, प्रोटीन Cas9 के वेरिएंट के जीनोमिक लक्ष्य निर्धारित करते हैं, और स्थानीय आणविक परिणाम । हालांकि, कई CRISPR दृष्टिकोण व्यक्तिगत कोशिकाओं में एकाधिक gRNAs के एक साथ वितरण पर निर्भर करते हैं । यहां, हम स्ट्रिंग विधानसभा gRNA क्लोनिंग (STAgR), एक तरीका है कि एक क्लोनिंग कदम में मल्टीप्लेक्स gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर के सरल, तेज और कुशल पीढ़ी की अनुमति देता है के लिए एक अनुकूलन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । STAgR लागत प्रभावी है, के बाद से (इस प्रोटोकॉल में) व्यक्तिगत लक्ष्यीकरण दृश्यों कम बदस्तूर प्राइमरों द्वारा पेश कर रहे हैं, जबकि gRNA अभिव्यक्ति कैसेट के लंबे डीएनए टेंपलेट्स फिर से किया जा सकता है कई बार । इसके अलावा, STAgR gRNAs की एक बड़ी संख्या का एक कदम शामिल करने की अनुमति देता है, साथ ही विभिंन gRNA वेरिएंट, वैक्टर और प्रवर्तकों के संयोजन ।

Introduction

स्ट्रिंग विधानसभा gRNA क्लोनिंग (STAgR) एक एकल क्लोनिंग कदम में एकाधिक gRNA अभिव्यक्ति कैसेट युक्त अभिव्यक्ति वैक्टर के कुशल रातोंरात पीढ़ी को सक्षम करने के लिए एक विधि है । STAgR प्रोटोकॉल विशेषज्ञ विशेषज्ञता या सामग्री पर निर्भर नहीं करता है और अनुकूलन के लिए कई विकल्प प्रदान करता है ।

बैक्टीरियल CRISPR प्रोटीन Cas9 की एक अनोखी क्षमता होती है । यह खोजने के लिए सक्षम है और चुनिंदा ही उन डीएनए स्वाभाविक रूप से उत्पंन crRNAs या1gRNAs इंजीनियर में इनकोडिंग अनुक्रम । एक आणविक उपकरण के रूप में इसके उपयोग के दृष्टिकोण है कि असंभव, साध्य या केवल कुछ सेलुलर मॉडलों तक ही सीमित थे की एक बड़ी संख्या में सक्षम है हाल ही में जब तक । इनमें लक्षित जीन उत्परिवर्तनों2, जीनोम इंजीनियरिंग3, epigenome संपादन4,5,6, transcriptional सक्रियण और जीन मुंह बंद करने7,8शामिल हैं । जहां तक हम जानते है CRISPR सार्वभौमिक रूप से तैनात है, इसके आवेदन की रिपोर्ट के रूप में लक्ष्य साइटों, सेल प्रकार और प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए मौजूद हैं । हालांकि, कई CRISPR अनुप्रयोगों जीनोमिक जोड़तोड़ (अनुवादन9,10, मध्यम11 और बड़े पैमाने जीनोमिक परिवर्तन की एक श्रृंखला सहित एकाधिक gRNAs की डिलीवरी पर प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से निर्भर 12 , 13), जीनोम इंजीनियरिंग (Cas9 nickases14, सशर्त alleles11,15 या धारावाहिक उत्परिवर्तनों16की पीढ़ी का उपयोग करें) और17रणनीतियों अनुरेखण । इसके अलावा, अंय दृष्टिकोण के लिए (transcriptional इंजीनियरिंग18, epigenome इंजीनियरिंग19,20) एकाधिक लक्ष्यीकरण साइटों को सख्ती से अनिवार्य नहीं हैं, लेकिन वे अपनी अधिकतम प्रभाव तक पहुंचने अक्सर केवल इस के तहत हालत.

कई उपयोगी तरीकों को उत्पंन करने के लिए वर्णित किया गया है gRNA वैक्टर एक से अधिक gRNA अभिव्यक्ति कैसेट युक्त21,22,23,24,25,26, 27. यहां, हम STAgR, स्ट्रिंग विधानसभा gRNA क्लोनिंग, जो सादगी और गति के अपने संयोजन में बकाया है के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (केवल एक रातोंरात क्लोनिंग कदम की जरूरत है), कम लागत (के रूप में डीएनए टेंपलेट्स कई बार reused किया जा सकता है), अनुकूलन (के लिए विभिंन gRNA प्रणालियों और प्रमोटरों) और प्रभावशीलता (यह gRNA कैसेट की उच्च संख्या से युक्त वैक्टर की पीढ़ी की अनुमति देता है)28।

STAgR सिद्धांत में कुछ (1-2 gRNAs), कई (3-5 gRNAs) और अभिव्यक्ति कैसेट की सबसे अधिक संख्या में से कुछ के साथ अभिव्यक्ति वैक्टर उत्पंन किया जा सकता है अब तक (6-8 gRNAs)28की सूचना दी । इसी तरह, STAgR किसी भी gRNA अनुक्रम, रीढ़ या प्रमोटर के लिए लागू होता है । हालांकि, STAgR मुख्य रूप से पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) और गिब्सन विधानसभा पर आधारित है, उच्च अनुक्रम समानता के साथ gRNAs एक वैकल्पिक पद्धति का उपयोग कर उत्पंन किया जाना चाहिए ।

Protocol

1. STAgR क्लोनिंग रणनीति का डिजाइन

  1. कितने gRNA कैसेटों पर निर्णय एक अभिव्यक्ति वेक्टर में शामिल किया जाएगा और जो क्रम में । निर्धारित करें कि कौन से प्रवर्तकों और gRNA पाड़ों का उपयोग प्रत्येक gRNAs के लिए किया जाना चाहिए । किसी भी ऑनलाइन उपकरण का उपयोग करके gRNAs डिजाइन (जैसे, www.benchling.com) ।

2. फांसी के साथ STAgR क्लोनिंग प्राइमरों के डिजाइन

नोट: नब्ज पिछले gRNA के protospacer अनुक्रम और पहले gRNA के antisense क्रमशः पीसीआर प्राइमरों वेक्टर रीढ़ की प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया (चित्रा 1) में जोड़ रहे हैं । शेष अनुक्रम तार से परिवर्धित होते हैं, जिससे भाव और antisense gRNAs इच्छित क्रम में संलग्न होते हैं. पहली स्ट्रिंग टुकड़ा एक आगे एक बदस्तूर और दूसरा gRNA N20 अनुक्रम के साथ एक रिवर्स प्राइमर के रूप में पहली gRNA N20 अनुक्रम युक्त प्राइमर के साथ परिवर्धित (एक बदस्तूर के रूप में पूरक रिवर्स) है । इसके अनुसार सभी निम्न मोहरे उत्पन्न होते हैं ।

  1. STAgR डीएनए स्ट्रिंग के लिए आगे प्रवर्धन प्राइमरों के लिए N20 gRNA दृश्यों जोड़ें (तालिका 1) के रूप में भांप लिया । नब्ज gRNA अनुक्रम 5 ' आगे प्राइमर "एससीएफ-fp के लिए जोड़ें" (एक पारंपरिक पाड़ के लिए) या "सैम-fp" (एक MS2 पाड़ युक्त के लिए) । एफ पी प्राइमर पाड़ को ऐनी/MS2 संबंधित STAgR स्ट्रिंग के भाग (1 चित्रा) ।
  2. उल्टे प्राइमरी जुगाड़ को रिवर्स पूरक N20 gRNA अनुक्रम में जोड़ें । विशेष प्रवर्तकों और इस्तेमाल किया तार के आधार पर आरपी प्राइमरों चुनें (hU6-आरपी, mU6-आरपी, 7sK-आरपी, H1-आरपी).

3. STAgR क्लोनिंग टुकड़े की पीढ़ी

  1. गिब्सन विधानसभा के लिए व्यक्तिगत क्लोनिंग टुकड़े उत्पंन करने के लिए, उच्च निष्ठा (HF) बफर के 10 µ एल की स्थापना करके पीसीआर प्रदर्शन, 1 µ एल के 10 मिमी dNTPs, ०.२५ µ एल के l बदस्तूर-प्राइमरी (१०० µ मीटर), डीएनए टेम्पलेट के 10 एनजी (स्ट्रिंग या वेक्टर), ०.५ µ l HF पोलीमरेज़ , १.५ µ l के dimethyl sulfoxide (DMSO) और add H2O के ५० µ l का अंतिम आयतन बना.
    नोट: प्लाज्मिड का प्रयोग करें "STAgR_Neo" रीढ़ पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में पिछले gRNA के लिए gRNA पाड़ शामिल करने के लिए, अगर सैम पाड़ चुना जाता है, का उपयोग करें "STAgR_SAM". उदाहरण के लिए छह gRNA कैसेट के साथ एक STAgR प्लाज्मिड के लिए, छह पीसीआर आवश्यक हैं, पांच के रूप में डीएनए तार के साथ टेंपलेट्स और एक टेंपलेट के रूप में वेक्टर रीढ़ के साथ ।
  2. निंनलिखित शर्तों का उपयोग कर एक thermocycler पर मशीन प्रतिक्रियाओं: 1 ंयूनतम 30 s के लिए ९८ ° c का चक्र; ३८ चक्र के लिए ९८ ° c 10 s, ५९ ° c (gRNA पाड़ के लिए)/६८ ° c (सैम लूप के लिए) के लिए 10 s, ७२ ° c के लिए 30 s (सम्मिलित करता है के लिए)/1 न्यूनतम 30 s (वैक्टर के लिए); 10 मिनट के लिए ७२ ° c के 1 चक्र ।
  3. पीसीआर रिएक्शन से ५.५ µ एल निकालें, लोड हो रहा है डाई जोड़ें और एक 1% agarose जेल पर प्रवर्धित टुकड़े का विश्लेषण । आकार के लिए एक उपयुक्त डीएनए सीढ़ी लोड (१०० बीपी डीएनए सीढ़ी/1 kb डीएनए सीढ़ी) और एक उपयुक्त जेल चल बफर में जेल चलाने (जैसे, TLE बफर) १२० वी पर 30 मिनट के लिए ।
  4. जेल चल रहा है, जबकि प्रतिबंध एंजाइम और ०.५ µ एल Dpnमैं (10 इकाइयों) के साथ प्रदान की बफर के 5 µ एल जोड़ें शेष ४४.५ µ l पीसीआर प्रतिक्रिया और 30 मिनट के लिए 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  5. चुंबकीय मोतियों का उपयोग डीएनए शुद्धि प्रदर्शन ।
    1. पीसीआर उत्पाद के 1 µ एल प्रति १.८ µ एल चुंबकीय मोती जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण । कमरे के तापमान (आरटी) में 2 मिनट के लिए मशीन ।
    2. अलग मोती और एक चुंबक के साथ अवशिष्ट तरल से डीएनए टुकड़े । पूरी तरह से resuspend बिना गोली धोने से ७०% इथेनॉल के साथ दो बार मोती धो लो ।
    3. एक पिपेट के साथ सभी इथेनॉल निकालें और चलो गोली हवा सूखी ।
    4. 15 में गोली भंग-20 µ एल एच2ओ ऊपर और नीचे pipetting और एक चुंबक का उपयोग करके तरल से मोतियों को अलग से । एक नई ट्यूब के लिए स्पष्ट supernatant स्थानांतरण ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, कॉलम आधारित प्रतिक्रिया साफ-अप किट इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. निर्धारित डीएनए सांद्रता29कहीं वर्णित के रूप में एक spectrophotometer का उपयोग कर ।

4. गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रिया और बैक्टीरियल परिवर्तन

नोट: निंनलिखित कदम गिब्सन एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं । 30.

  1. एक घर का बना गिब्सन प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार या एक वाणिज्यिक गिब्सन क्लोनिंग किट का उपयोग करें ।
    1. 1 मीटर Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) के 3 मिलीलीटर का मिश्रण-एचसीएल नं० ७.५ पर, ३०० µ l के 1 M MgCl, ६० µ l के १०० mm dGTP (deoxyguanosine ट्राइफॉस्फेट), ६० µ l की १०० mm dATP (deoxyadenosine ट्राइफॉस्फेट), ६० µ l की १०० mm dTTP (deoxythymidine ट्राइफॉस्फेट), ६० µ l की १०० mm dCTP ( deoxycytidine ट्राइफॉस्फेट), ३०० µ l के 1 M डीटीटी (dithiothreitol), खूंटी के १.५ ग्राम-८००० (पॉलीथीन ग्लाइकोल), ३०० µ l के १०० mM णड (nicotinamide adenine dinucleotide) और add ज2O 5 × इज़ोटेर्माल प्रतिक्रिया बफर के 6 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए ।
      नोट: Aliquoted बफर पर संग्रहित किया जा सकता है-20 डिग्री सेल्सियस से कम 12 महीने के लिए ।
    2. गिब्सन विधानसभा मास्टर मिक्स के लिए, 5x इज़ोटेर्माल रिएक्शन बफर के ६९७ µ l के साथ जुडा ३२० µ एल एच2ओ के एल और जोड़ 3 µ l के 10 u/µ l T5 exonuclease, 20 µ l के 2 u/µ l डीएनए पोलीमरेज़ और १६० µ l के ४० u/µ l Taq डीएनए ligase.
      नोट: इस मिश्रण aliquoted और में संग्रहित किया जा सकता है-20 डिग्री सेल्सियस कम से कम 12 महीने के लिए.
  2. insert और वेक्टर के २.५ µ l के साथ असेंबली मास्टर मिक्स का ७.५ µ l का उपयोग करें । एक 2x STAgR प्रतिक्रिया के लिए एक दाढ़ सदिश का उपयोग करें 1:1 के अनुपात में नहीं बल्कि अधिक से अधिक ०.२ डीएनए के कुल में pmol । से अधिक 2 gRNA अभिव्यक्ति कैसेट के लिए, एक सदिश का उपयोग 1:3 के अनुपात डालने के लिए, लेकिन ०.५ pmol की कुल डीएनए राशि से अधिक नहीं है ।
    नोट: सभी प्रवर्धित gRNA अभिव्यक्ति कैसेट का प्रयोग equimolar मात्रा में किया जाना चाहिए । वेक्टर के समान राशि के साथ एक प्लाज्मिड नियंत्रण शामिल हैं, लेकिन कोई आवेषण के लिए नियंत्रित करने के लिए अपच टेंपलेट वेक्टर (और/
  3. ५० के लिए ४५ ° c पर नमूने की मशीन के लिए ६० मिनट । बर्फ या पर-20 डिग्री सेल्सियस बाद के परिवर्तन के लिए नमूनों की दुकान ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  4. सीधे रासायनिक सक्षम बैक्टीरिया में मिश्रण का आधा बदल जाते हैं ।
    1. गल रासायनिक सक्षम TOP10 ई. बर्फ पर कोलाई बैक्टीरिया ।
    2. गिब्सन मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें सक्षम बैक्टीरिया के ५० µ एल के लिए । धीरे से ट्यूब के नीचे झाड़ करके मिक्स । 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    3. ४५ s के लिए एक ४२ ° c जल स्नान या एक गर्मी ब्लॉक में ट्यूब रखकर एक गर्मी सदमे प्रदर्शन ।
    4. ट्यूबों बर्फ पर वापस रखो । जोड़ें २५० µ समाज माध्यम के एल बैक्टीरिया को और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 के लिए एक मिलाकर मशीन में ठीक-45 मिनट ।
  5. वसूली के बाद, प्लेट १.५% lysogeny शोरबा पर रूपांतरित बैक्टीरिया (पौंड) एम्पीसिलीन युक्त प्लेटों (१०० µ जी/एमएल) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन ।

5. बैक्टीरियल कॉलोनी पीसीआर द्वारा STAgR क्लोन का चयन

  1. २०० µ l पीसीआर रिएक्शन ट्यूब (3 और 24 के बीच) के प्रत्येक निर्माण, जो हूबहू लेबल किए गए हैं, के कम से कम दो सेट तैयार करें ।
  2. १०० µ के साथ एक सेट भरें l LB मध्यम जिसमें १०० µ g/mL एम्पीसिलीन.
  3. एक बाँझ पिपेट टिप का प्रयोग करें एक बैक्टीरियल कॉलोनी की जैविक सामग्री को खरोंच और यह खाली १०० µ l पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब के तल पर फैल गया । तुरंत दूसरी इसी प्रतिक्रिया पौंड मध्यम युक्त ट्यूब के लिए टिप हस्तांतरण ।
  4. भंवर के आसपास धीरे टिप के लिए जीवाणुओं के कुछ सुनिश्चित पौंड मीडिया को हस्तांतरित कर रहे है और बाद में उपयोग के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  5. एक पीसीआर मास्टर मिक्स (10 µ एल प्रति प्रतिक्रिया) की स्थापना की ।
    1. 10 प्रतिक्रियाओं के लिए, 10 µ एल Taq बफर, 2 µ l 10 मिमी dNTPs, प्राइमर के ०.५ µ एल (१०० µ मीटर), ०.५ µ एल के मिश्रण Taq पोलीमरेज़ और एच2ओ जोड़ने के लिए एक मात्रा १०० µ एल.
    2. निंनलिखित प्राइमरों का प्रयोग करें: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG ।
  6. बिना लेग मीडिया के लेबल किए गए पीसीआर मास्टर मिश्रण के 10 µ l को डालें ।
  7. निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग कर एक thermocycler पर मशीन प्रतिक्रियाओं: 1 चक्र के लिए ९४ ° c के 5 मिनट, ३८ चक्र के लिए ९४ ° c के 30 s, ५५ ° c के लिए 30 s, ७२ ° c 2 मिनट के लिए; 10 मिनट के लिए ७२ ° c के 1 चक्र ।
    नोट: बढ़ाव समय (७२ डिग्री सेल्सियस कदम) gRNA अभिव्यक्ति कैसेट की संख्या के साथ बढ़ाया जाना चाहिए । तालिका 2 का उपयोग कर आवेषण के सैद्धांतिक आकार की गणना और ७२ डिग्री सेल्सियस पर 1 kb प्रति 1 मिनट का उपयोग करें ।
  8. लोड हो रहा है डाई जोड़ें और एक 1% agarose जेल पर प्रवर्धित टुकड़े का विश्लेषण । (1kb डीएनए सीढ़ी) नौकरशाही का आकार घटाने के लिए एक उचित डीएनए सीढ़ी लोड और 30 मिनट के लिए १२० वी पर उचित जेल चल बफर (जैसे, TLE बफर) में चलाते हैं ।
  9. प्रयुक्त प्रमोटरों, gRNA पाड़ों और N20 दृश्यों की संख्या के व्यक्तिगत आकार को जोड़कर तालिका 2 की मदद से amplicon के सैद्धांतिक आकार की गणना । कॉलोनी पीसीआर के परिणामों से, सही बैंड आकार के आधार पर बैक्टीरियल क्लोन की पहचान और क्या वे सही वैक्टर बंदरगाह की संभावना है ।
  10. Inoculate एक २.५ मिलीलीटर रातोंरात पौंड संस्कृति (१०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ) इसी १०० µ एल संस्कृति के साथ, पहले की स्थापना की । 12 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  11. एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड मिनी किट और निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर प्लाज्मिड डीएनए निकालें31।
  12. निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग कर plasmids अनुक्रम: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) और StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) द्वारा सैंज अनुक्रमण ।

Representative Results

हाथ में प्रोटोकॉल के बाद अनुकूलित मल्टीप्लेक्सिंग gRNA वैक्टर व्यवहार्य की पीढ़ी बनाता है (1 चित्रा) । छह अलग gRNA कैसेट का उपयोग STAgR दृष्टिकोण के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2में चित्रित कर रहे हैं । चित्रा 2 एक STAgR टुकड़े (प्रोटोकॉल 3.1-3.3) प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया पीसीआर के एक ठेठ परिणाम से पता चलता है । छह amplicons (BB, एस एम-S5) रैखिक डीएनए उनके सिरों पर व्यक्तिगत gRNA N20 दृश्यों युक्त टुकड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्लाज्मिड रीढ़ (BB) अब gRNA1 और gRNA6 के लक्ष्यीकरण दृश्यों के साथ विस्तारित है और इसलिए आवश्यक के पास दो अंय पीसीआर (एस 1 और S5) गिब्सन विधानसभा (चित्रा 2ए, तालिका 3) के लिए ओवरलैप । शुद्धीकरण के बाद वैक्टर और आवेषण के लिए कम से 1 µ जी की डीएनए उपज प्राप्त किया जा सकता है ।

गिब्सन विधानसभा के बाद, बैक्टीरियल परिवर्तन १०० में ७०० बैक्टीरियल कालोनियों के लिए परिणाम चाहिए । चित्रा 2 बी कॉलोनी पीसीआर के माध्यम से 10 बैक्टीरियल कालोनियों के एक प्रतिनिधि विश्लेषण से पता चलता है, छह gRNA कैसेट के साथ एक STAgR प्रोटोकॉल के बाद । Gel ट्रो इंगित करता है कि तीन क्लोन पूर्ण असेंबली (तालिका 2) के लिए अपेक्षित amplicon आकार दिखाते हैं । अंय क्लोनों की संभावना एक से पांच gRNA कैसेट युक्त STAgR वैक्टर प्राप्त किया, जबकि एक क्लोन (चित्रा 2बी, नहीं 18) खाली है ।

Figure 1
चित्रा 1 : STAgR प्राइमर डिजाइन का अवलोकन । पहले gRNA संख्या और पाड़ चुना जाता है, तो gRNA आदेश और प्रमोटर और पिछले, वेक्टर के प्रकार का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । प्रत्येक gRNA के लिए, भावना अभिविंयास में gRNA लक्ष्यीकरण अनुक्रम के साथ एक विशिष्ट आगे प्राइमर और या तो "एससीएफ-fp" या "सैम-fp" का आम हिस्सा डिज़ाइन किया गया है । इसी तरह, व्यक्तिगत रिवर्स प्राइमर उत्पन्न करने के लिए इसी प्रवर्तक अनुक्रम (आरपी) रिवर्स अगले gRNA के N20 अनुक्रम के पूरक के साथ जुड़े है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : STAgR छह अलग gRNA कैसेट का उपयोग दृष्टिकोण के प्रतिनिधि परिणाम । (एक) पांच आवेषण के एक पीसीआर के प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वेक्टर STAgR_Tomato । (ख) एक 6x STAgR की कॉलोनी पीसीआर hU6 और mU6 प्रवर्तकों और विहित gRNA के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सैम पाड़ का उपयोग प्रतिक्रिया । 22 बैक्टीरियल कालोनियों का विश्लेषण किया गया, जिनमें से 7 उंमीद बैंड पूर्ण विधानसभा का संकेत दिखाया । सीढ़ी: 1 केबी प्लस, आधार जोड़े में संख्या (बीपी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

आगे स्ट्रिंग और वेक्टर के लिए प्राइमर
scaffold_fwd GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT
SAM_fwd GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG
स्ट्रिंग और वेक्टर के लिए रिवर्स प्राइमर
hU6_rev CGGTGTTTCGTCCTTT
mU6_rev CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG
hH1_rev CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA
h7SK_rev CCGAGGTACCCAAGCGG

तालिका 1: gRNA पाड़ और प्रमोटरों के लिए प्राइमर अनुक्रम ।

प्रवर्तकों और पाड़ों के आकार ।
hU6 २६५ बीपी
hH1 २२५ बीपी
mU6 ३१६ बीपी
h7SK २४५ बीपी
gRNA पाड़ा ८३ बीपी
SAMloop + gRNA पाड़ा १४३ बीपी

तालिका 2: प्रत्येक अभिव्यक्ति कैसेट के सैद्धांतिक आकार कॉलोनी पीसीआर परिणाम की गणना करने के लिए ।

hU6 hH1 mU6 h7SK STAgR_Neo STAgR_tdTomato
gRNA एससीएफ ४०० बीपी ३६० बीपी ४५१ बीपी ३८० बीपी ३७२२ बीपी ४४८७ बीपी
सैम ४६० बीपी ४२० बीपी ५११ बीपी ४४० बीपी - -

तालिका 3: प्रवर्तकों और पाड़ों के आकार ।

hU6 hH1 mU6 h7SK STAgR_Neo STAgR_tdTomato
gRNA एससीएफ ३६८ बीपी ३२८ बीपी ४१९ बीपी ३४८ बीपी + ७४ bp + ६७ bp
सैम ४२८ बीपी ३८८ बीपी ४७९ बीपी ४०८ बीपी

तालिका 4: पीसीआर के बाद STAgR टुकड़ों की गणना आकार ।

Discussion

यहां हम STAgR के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान gRNA अभिव्यक्ति की तेजी और सरल पीढ़ी अलग आकार के plasmids की अनुमति । इस प्रोटोकॉल gRNA plasmids की एक कदम पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ 2 – 8 gRNA अभिव्यक्ति कैसेट (के साथ या बिना दो MS2 आरएनए aptamers) gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर STAgR_Neo में, और मानव U6 का उपयोग, माउस U6, मानव 7sK और मानव H1 प्रवर्तक28 ,३२,३३. यदि चार से अधिक कैसेट वांछित हैं, यह क्षमता बढ़ाने के लिए कम से कम दो अलग प्रमोटर/पाड़ प्रकार का उपयोग करने की सिफारिश की है । अंय वैक्टर, प्रवर्तकों और प्रमोटर संयोजन के रूप में अच्छी तरह से अधिक से अधिक 8 gRNA कैसेट के रूप में अच्छी तरह से संभव हो सकता है; हालांकि, इस पर जांच नहीं की गई है । हालांकि हमारे अनुभव में विधि मज़बूती से काम करता है और reproducibly, हम महत्वपूर्ण कदम निर्धारित किया है और समस्या निवारण रणनीतियों अपेक्षित परिणाम तुरंत नहीं होने चाहिए । हमारे अनुभव में कुछ कदम दृष्टिकोण की सफलता के लिए निर्णायक हैं: और सबसे पहले, यह गिब्सन विधानसभा कदम (3:1) में वेक्टर रीढ़ आवेषण के सही दाढ़ अनुपात का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । लेकिन, हमने देखा है कि कुछ gRNA के लिए आवेषण के एक 1:1 अनुपात सेट के लिए वेक्टर लाभप्रद है, यहां तक कि जब gRNA कैसेट संख्या दो से अधिक है । दूसरे, गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रिया की अवधि पर्याप्त रूप से लंबा होना चाहिए (कम से कम ४५ मिनट की सिफारिश की) ।

STAgR संशोधनों की एक बड़ी संख्या के साथ नियोजित किया जा सकता है । लक्ष्यीकरण अनुक्रम, gRNA संख्या और पाड़, प्रवर्तकों और वेक्टर रीढ़ की और अनुकूलित किया जा सकता है स्वतंत्र रूप से संयुक्त । हालांकि, प्रत्येक संयोजन थोड़ा अलग आवश्यकताओं हो सकता है । हमारे अनुभव में, यदि मध्यम या gRNA कैसेट (> 4) के उच्च संख्या वांछित हैं, लेकिन तुरंत प्राप्त नहीं है, आमतौर पर सबसे तेजी से इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए वेक्टर में व्यक्तिगत gRNA कैसेट का क्रम बदल रहा है । इसी तरह, अलग gRNA प्रवर्तकों और पाड़ों के संयोजन दक्षता में सुधार (और इस प्रकार कॉलोनी पीसीआर की आवश्यकता संख्या है कि रन बनाए है कम करती है) जब कई gRNA कैसेट क्लोन कर रहे हैं । हमने पाया है कि गलत क्लोन आमतौर पर गिब्सन विधानसभा के दौरान दोहराया दृश्यों का सहज संयोजन के द्वारा उत्पंन कर रहे हैं । हालांकि इस विधि की क्षमता को कम कर सकते हैं, यह भी कार्यात्मक gRNA के साथ वैक्टर के एक साथ पीढ़ी में परिणाम28सेट ।

एक से अधिक gRNA अभिव्यक्ति कैसेट युक्त मल्टीप्लेक्सिंग gRNA वैक्टर की पीढ़ी के विभिंन तरीकों की एक संख्या के साथ सूचित किया गया है21,22,23,24,25, २६,२७. जबकि कुछ एक साथ या gRNA जोड़े22,३४के अनुक्रमिक क्लोनिंग रोजगार, दूसरों गोल्डन गेट विधानसभा और कई अनुक्रमिक क्लोनिंग कदम25,३५पर निर्भर करते हैं । एक विशेष दृष्टिकोण Xie एट अलद्वारा इस्तेमाल किया गया है, अंतर्जात सेलुलर tRNA प्रसंस्करण प्रणाली को रोजगार के लिए कई gRNAs एक जनक प्रतिलिपि३६से बाहर कटौती । इस विधि का advangetage केवल एक प्रवर्तक की आवश्यकता है; दोष प्रत्येक gRNA संयोजन के लिए नए संश्लेषित डीएनए टुकड़े की जरूरत है । प्रत्येक gRNA division कृती ही फायदे आणि नुकसान होते; STAgR कम लागत के साथ दक्षता, संभव gRNA कैसेट की उच्च संख्या के साथ सादगी को जोड़ती है ।

STAgR (और अंय मल्टीप्लेक्सिंग प्रणालियों) की संभावना को सक्षम करने में सहायक होगा कुशल (और एक साथ) vivo मेंकई जीन के विघटन, के रूप में zebrafish दिमाग में अग्रणी28। gRNA मल्टीप्लेक्सिंग वैक्टर के एक अंय भविष्य के आवेदन में एक जीन की प्रेरण या दमन के विपरीत पूरा transcriptional कार्यक्रमों में हेरफेर के लिए वादा है । संभावना है, इन तरीकों से यह संभव है की तुलना में एक बहुत अधिक डिग्री करने के लिए होगा पर कोशिकाओं और अंगों को बदलने की अनुमति देगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक प्रो डॉ स्टीफ़न बेक और प्रो डॉ Jovica Ninkovic उनके इनपुट, मदद और STAgR विधि के विकास में समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । टोबीस Klötzer, अण्णा Köferle आणि वैलेंटिन Baumann उपयोगी टिपण्णी लिए. काम DFG (STR 1385/1-1) द्वारा समर्थित किया गया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase NEB M0530L Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs
dNTPs Life Technology R0191 dNTPs for all PCRs
dATP Life Technology R0141 dNTPs for Gibson Master Mix
dCTP Life Technology R0151 dNTPs for Gibson Master Mix
dGTP Life Technology R0161 dNTPs for Gibson Master Mix
dTTP Life Technology R0171 dNTPs for Gibson Master Mix
Agarose VWR 443666A
DpnI NEB R0176S
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881 for DNA clean up
Tris HCL Roth 9090.2 for Gibson Master Mix
DTT Life Technology R0861 for Gibson Master Mix
PEG 8000 VWR RC- 077 for Gibson Master Mix
NAD Cayman Chemicals Company 16077 for Gibson Master Mix
T5 Exonuclease NEB M0363S for Gibson Master Mix
Taq DNA Ligase NEB M0208S for Gibson Master Mix
Ampicilin SigmaAldrich PHR1393-1G
DNA Ladder 1 kb Plus Thermo Scientific SM0311
Plasmid Mini Kit Thermo Scientific K0503
Plasmid and Primer Sequences All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).
EDTA PanReacAppliChem 6381-92-6 for TLE Buffer
MgCl2 SigmaAldrich M8266 for Gibson Master Mix
Top10 chemically competent bacteria Thermo Scientific C404003
S.O.C. Medium Thermo Scientific 15544034
Yeast- Extract SigmaAldrich Y1625 for lysogenic broth (LB Media)
NaCl SigmaAldrich S7653 for lysogenic broth (LB Media)
Peptone SigmaAldrich 91249 for lysogenic broth (LB Media)
Agar-Agar SigmaAldrich 5040 for lysogenic broth (LB Media)
Taq DNA Polymerase Quiagen 201203

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १४२ CRISPR Cas9 dCas9 gRNA क्लोनिंग gRNA division जीनोम एडिटिंग transcriptome एडिटिंग
स्ट्रिंग असेंबली gRNA क्लोनिंग (STAgR) के लिए एक अनुकूलन प्रोटोकॉल
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Breunig, C. T., Neuner, A. M., Giehrl-Schwab, J., Wurst, W., Götz, M., Stricker, S. H. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). J. Vis. Exp. (142), e58556, doi:10.3791/58556 (2018).

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