Summary
بروتوكول للسابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية مفيدة للجرح شفاء الدراسات هو وصف. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتقييم آثار عوامل لتعزيز الشفاء التجدد أو سمية العقاقير في بيئة متعددة الخلايا 3D منظم.
Abstract
القرنية وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة التئام الجروح. القدرة على توليد واستخدام خلايا الثدييات الأولية في اثنين الأبعاد (2D) والثقافة (ثلاثي الأبعاد) الأبعاد الثلاثة قد ولدت ثروة معلومات ليس فقط حول البيولوجيا القرنية ولكن أيضا حول الجرح تضميد الجراح، والبيولوجيا أرومية، وتندب بشكل عام . وهدف البروتوكول هو نظام مقايسة للتحديد الكمي للتنمية أرومية، الذي يميز تندب. علينا أن نظهر ثقافة جهاز القرنية السابقين فيفو نموذج باستخدام عيون خنزير. في هذا كيراتيكتومي الأمامي الجرح، جرح القرنيات لا يزال في أنحاء العالم مع شفرة دائرية تسمى ترفين. يتم إزالة المكونات من حوالي 1/3 للقرنية الأمامي منها الظهارة والغشاء الطابق السفلي والجزء الأمامي ستروما. بعد إصابة، هي القرنيات قص من أنحاء العالم والتي شنت على قاعدة الكولاجين/أجار ومثقف لمدة أسبوعين في المصل تستكمل المتوسطة الحرة مع استقرار فيتامين C لزيادة تكاثر الخلايا وإفراز المصفوفة خارج الخلية من الخلايا الليفية المقيم. تفعيل ميوفيبروبلاستس في ستروما الأمامي يتجلى في القرنية تلتئم. يمكن استخدام هذا النموذج للاعتداء إغلاق الجرح، وضع علامات تليفية وميوفيبروبلاستس، ودراسات علم السموم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار تأثيرات مثبطات جزيء صغير، فضلا عن تعداء siRNA الدهن بوساطة للجينات ضربة قاضية في هذا النظام.
Introduction
تندب في القرنية الناتجة عن الإصابة أو الصدمة أو الإصابة يمكن أن تؤدي إلى إضعاف نسبة تظليل وفقدان الرؤية الدائمة. ومن ثم، هناك حاجة ماسة لتحديد المسارات التي يمكن أن تكون مستهدفة للتدخل العلاجي. خيارات العلاج الحالية محدودة، وتتمثل أساسا في عمليات زرع القرنية، التي لا يمكن الوصول إلى المرضى عبر العالم. الإنسان (الشكل 1) والقرنية الحيوانية يمكن أن تستخدم ل 2D وخلية 3D ثقافة الدراسات1،2. يمكن الحصول على القرنيات الجثث البشرية لا تصلح لزرع من المصارف العين أو مصارف مركزية الأنسجة (الوطنية المرض بحوث التبادل (ندري))، ويمكن الحصول على عيون الحيوان من مسلخ. الابتدائي الخلايا الظهارية القرنية والليفية stromal وأكثر في الآونة الأخيرة، خلايا بطانية، يمكن عزل ومثقف من هذه الأنسجة لالتئام الجروح ودراسات علم السموم3،،من45. بالإضافة إلى أهمية فهم الأساس الجزيئي لأمراض العيون المسببة للعمى، جعلت إمكانية الحصول على القدرة على الثقافة الابتدائية الخلايا والأنسجة القرنية نظام نموذجا هاما للدراسة. القرنية مثالية لاختبار آثار وكلاء على تندب القرنية عادية تتسم بالشفافية وإنشاء أنواع معينة من الجروح نسبة تظليل أو ندبات تليفية (استعرض في6). في فيفو القرنية الجرح الشفاء نماذج عديدة أيضا على نطاق واسع استخدمت تندب الدراسات1. وقد استخدمت أقل السابقين فيفو القرنية الجرح الشفاء النموذجي7،8 هي تصف بالتفصيل هنا. والهدف من هذا الأسلوب لقياس نتائج تندب تتميز بصانعي تليفية في 3D متعددة الخلايا القرنية السابقين فيفو نموذج النظام.
إصابة الظهارة القرنية التي لا يخل الغشاء الظهارية عادة يغلق داخل 24-72 ح9. قريبا بعد إصابة، تبدأ الخلايا عند حافة ظهارة تنتشر وتهاجر إلى السطح الحر الظهارية، وإعادة تأسيس وظيفة الحاجز الظهارية. هذا النشاط تسلسلياً يليه تفعيل انتشار الخلايا القاعدية القرنية أولاً، وفي مرحلة لاحقة، من الخلايا السليفة التي تقع في منطقة حوفي الخارجي لتحقيق الانتعاش من الخلايا الظهارية الشامل10،11. غالباً ما تشفي هذه الجروح بدون تندب. ومع ذلك، النتائج جرح التي تخترق الغشاء الطابق السفلي ستروما غالباً ما في تشكيل ندبة1. بعد إصابة stromal القرنية، يتم ملؤها سدى مع خلايا أصول متعددة بما في ذلك الخلايا اللحمية المقيم المتباينة، فضلا عن المشتقة من نخاع العظم فيبروسيتيس12،،من1314. ندبات تليفية تتسم باستمرار ميوفيبروبلاستس في التئام الجروح. إظهار هذه ميوفيبروبلاستس المرضية الالتصاق المتزايد من خلال تراكم إينتيجرينس في الالتصاقات المحورية، وألياف الإجهاد أكتين (α-SMA) الهوس α-السلس العضلات والتنشيط المحلي للمصفوفة خارج الخلية (ECM)-المحتبسة الكامنة تحويل عامل النمو-بيتا (TGFβ). التفريق بين الخلايا الظهارية المشتقة، تعرف باسم الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT)، قد يسهم أيضا في ندبة تشكيل6.
هناك توازن دقيق بين الخلية التمايز والمبرمج بعد إصابة. بسبب الخرق في غشاء الطابق السفلي، عوامل النمو مثل عامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF) و TGFβ من الدموع وظهاره يستحم ستروما، الذي يحفز التمايز أرومية، حلقة متواصلة autocrine TGFβ التنشيط، إفراز غير منظم تليفية ECM15،16. ويعزز استمرار ميوفيبروبلاستس في الجرح تلتئم الضباب والندوب في القرنية (الشكل 2). ومع ذلك، في ريجينيراتيفيلي تلتئم الجرح على الرغم من أن تطوير ميوفيبروبلاستس، أنهم أبوبتوسي وهكذا هي غائبة أو انخفاض ملحوظ في عدد في الأنسجة تلتئم في المرجع6،10(استعراض). وهكذا، قد ركزت البحوث على ندبات تليفية جزئيا على الأقل على استهداف الجزيئات التي تحول دون التنمية أرومية المفرط أو أرومية استمرار17،18. نظراً لاستمرار أرومية يميز المرض ندبات وتليفيه على حد سواء في جميع الأنسجة19، قد يكون من المفيد كنظام نموذجي لدراسة الآليات الخلوية العامة التليف القرنية.
في النظام النموذجي، هو إصابة القرنية بشفرة أسطواني يسمى ترفين في حين لا يزال في أنحاء العالم. البشرية ويمكن إصابة الخنازير القرنيات مع أما 6 أو 7 ملم تريفيني؛ للقرنيات الأرنب ترفين 6 مم المفضل. القرنية الخنزير مشابه في الحجم للقرنية البشرية. لأنها فعالة من حيث التكلفة ومتاحة بسهولة في إعداد كبيرة، والقرنيات خنزير تستخدم بشكل روتيني لثقافة الجهاز. وعلاوة على ذلك، قد دأبت كروسريكتيد الأجسام المضادة وسيرناس لتتفاعل مع الإنسان مع خنزير7. بعد إصابة، القرنيات هي قطع من أنحاء العالم مع ليمبوس سليمة والتي شنت على قاعدة أجار/الكولاجين. القرنيات تربى في وسائل الإعلام الحرة المصل بالإضافة إلى استقرت فيتامين (ج) لمحاكاة انتشار تنتجها الخلايا الليفية وإدارة المحتوى في المؤسسة ترسب20. إضافة المصل لا عوامل النمو لا بد للحث على تشكيل أرومية7. القرنيات بشكل روتيني ثابت وتجهيزها للأنسجة بعد أسبوعين ثقافة. للجينات ضربة قاضية، أو لاختبار آثار وكيلاً على التئام الجرح يمكن أن تعامل مع siRNA في الجرح بعد إصابة7 أو عامل القابلة لذوبان يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام، على التوالي8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الجهاز الثقافة
-
الأعمال التحضيرية
- إعداد أجار الحل كما يلي. وفي قارورة صغيرة، تعد أجار 1% و 1 ملغ/مل من الكولاجين البقري في دميم-F12 يصل إلى 20 مل. جلب ليغلي على طبق ساخن. وضع الحل في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. ضع الأنبوبة في حمام مائي على لوحة الساخن للحفاظ على الحل من ترسيخ.
- تحضير الوسائط الحرة المصل المكملة (سفم) وفقا لتكوين المنصوص عليه في الجدول للمواد.
ملاحظة: المبلغ اللازم من سفم سيعد يعتمد على عدد القرنيات بحيث تتم معالجتها. عادة ما يكون 30 مل وسائط كافية للقرنيات 4.
-
تشريح
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء تشريح أو غطاء كيميائية. يتم شحنها في العيون مع أغطية لا تزال تعلق في أكياس فردية لحماية الكرات.- إزالة الكرات من أغطية مع شفرة حافة مستقيمة جراحية على لوح تقطيع تنظيفها الإيثانول. إزالة الأنسجة الدهنية الزائدة من العين باستخدام شفرة أو مقصات صغيرة (الشكل 3 أ، 3).
- بعد إزالة الكرة الأرضية من الغطاء، عقد العالم جيدة مع الملقط وتراجع فورا العين في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). وتراجع بسرعة x 3 في اليود 10% (في كوب 100 مل). وتراجع بسرعة x 2 في برنامج تلفزيوني (~ 100 مل في كوب، تغيير برنامج تلفزيوني في كثير من الأحيان).
- استخدام منشفة نظيفة أو الأنسجة، التفاف العين circumferentially مع ما يكفي من الضغط على سطح القرنية مشدود قطع مع ترفين.
ملاحظة: الحرص على منع منشفة أو الأنسجة من الاتصال بالقرنية.
-
مما أدى إلى إصابة
- استخدام ترفين 6 مم للجرح وسط القرنية. اختراق ظهارة وسدى الأمامي دون جرح سمك كامل من خلال القرنية كاملة.
ملاحظة: إذا كان يتم اختراق البطانة، سيتبين فقدان الضغط وتسرب السوائل. وفي هذه الحالة يجب أن يتم تجاهل العين. - ترفين في وسط القرنية، تدويره 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة وعقارب الساعة 5 x (في كل مرة يتم تغيير الاتجاه أنه سيتم حساب كمرة واحدة) أثناء تطبيق الضغط الخفيف لتعميق الجرح.
ملاحظة: الآن يجب أن يكون الجرح عميق ما يكفي للسماح رفرف أنسجة برفع استخدام زوج من الملقط. إذا كان هذا ليس هو الحال تكرار الخطوة 1-3-2. - رفع رفرف من الحواف. في الوقت نفسه، أما باليد الأخرى أو مع شخص ثان، استخدم شفرة، خفض مواز للعالم لقطع الأنسجة كما الملقط الاستمرار في رفع قبالة القرنية الأمامية ضمن الهامش الجرح. وفي ختام هذه الخطوة ينبغي أن يكون هناك جرح دائري يقع في مركز القرنية (انظر الشكل 3 جيم، 3D).
- استخدام ترفين 6 مم للجرح وسط القرنية. اختراق ظهارة وسدى الأمامي دون جرح سمك كامل من خلال القرنية كاملة.
-
قطع وإزالة القرنية من أنحاء العالم
- عقد العين مع الأنسجة، جعل شق صغير 1 ملم بعيداً عن الحافة القرنية مع شفرة حيث يتم تضمين ليمبوس في ثقافة الجهاز.
- باستخدام الصغيرة، الوصول إلى مقص حاد شق بإنشائه في الخطوة السابقة قطع جميع أنحاء العالم، الاحتفاظ بهامش ملليمتر في جميع أنحاء القرنية للحفاظ ليمبوس سليمة.
- وضع القرنية في صحن 60 ملم مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، الجانب الجرح لأسفل حتى المتصاعدة.
-
تصاعد
- تأكد من أجار وصلت إلى درجة حرارة دافئة (حوالي 25 درجة مئوية).
- مع اثنين من أزواج من الملقط، إنشاء كوب بعقد الجانبان القرنية مع الجانب بطانية. إضافة حل أجار ارتفعت درجة حرارة تصل إلى القرنية باستخدام ماصة نقل عقيم حتى أنها كاملة.
- بعد أن يصلب أجار (عادة حوالي 30-45 ثانية) بعناية الوجه القرنية مع أجار إلى لوحة 60 ملم (رقم 3E). وتغطي بغطاء.
-
الحضانة
- إضافة 4 مل سفم إلى اللوحة، الحفاظ على القرنيات في واجهة الهواء السائل على الحدود حوفي في 5% CO2 في 37 درجة مئوية. تحديث وسائل الإعلام بعد 24 ساعة وبعد ذلك مرة كل يومين.
ملاحظة: إذا كان أداء تعداء داخل الجرح، حذف المضادات الحيوية حتى بعد تعداء. - الرطب على سطح القرنية مرة واحدة يوميا بإضافة 1 قطره سفم من وسائل الإعلام مكيفة في الطبق للحفاظ على رطوبة. لهذا، تأخذ الطبق خارج الحاضنة ووضعه تحت غطاء محرك السيارة، وإزالة غطاء صحن، الرطب السطح مع وسائل الإعلام من طبق استخدام ماصة معقمة، تغطية مرة أخرى ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
- للجينات ضربة قاضية، علاج الجرح باستهداف الجين أو التحكم في siRNA هو الرصاصية إلى ناقل بوساطة الدهن حسب تعليمات المورد (انظر أدناه).
- مزيج 5 ميليلتر (50 بمول) من siRNA إلى 50 ميليلتر من المصل خفض الحد الأدنى الوسائط الأساسية (على سبيل المثال.، غروب-الفنزويلية). ميكس 2 ميليلتر من تعداء الكاشف إلى 50 ميليلتر من المصل خفض وسائل الإعلام. ترك هذا الجلوس لمدة 5 دقائق وثم مزجها.
- إضافة 200 ميليلتر من الوسائط المصل خفض الحد الأدنى إلى خليط كاشف/siRNA.
- "الماصة؛" دروبويسي على الجرح واحتضانها ح 3.
- تغسل siRNA من سطح القرنية مع وسائل الإعلام في الطبق. تغيير الوسائط حضانة سفم + المضادات الحيوية (انظر الجدول للمواد). تستمر الحضانة كما ذكر سابقا (الخطوات 1.6.1-1.6.2).
- إضافة 4 مل سفم إلى اللوحة، الحفاظ على القرنيات في واجهة الهواء السائل على الحدود حوفي في 5% CO2 في 37 درجة مئوية. تحديث وسائل الإعلام بعد 24 ساعة وبعد ذلك مرة كل يومين.
2-علم الأنسجة: مقاطع البارافين وإيمونوستينينج
-
إعداد الأنسجة
- وبعد أسبوعين حضانة، إذا كان استخدام بعض الأنسجة لكمية الوقت الحقيقي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرة-PCR) التحليل، قبل تحديد، قص القرنية في النصف من خلال الجرح. مكان هذا النصف أو ¼ فقط (أما هو ما يكفي من الأنسجة) إلى استقرار كاشف حماية الجيش الملكي النيبالي.
- استخدام مجموعة أدوات قياسية عزلة، عزل الحمض النووي الريبي وأداء بكر قرة.
ملاحظة: وبدلاً من ذلك، الجزء الجرحى فقط يمكن عزل واختبار للتعبير الجيني. - مكان الآخر نصف القرنية في أشرطة علم أمراض الأنسجة، وتغرق في مثبت (10% فورمالين) لمدة 2-4 أيام في درجة حرارة الغرفة (RT).
- البارافين تضمين هذا نصف الجرحى القرنية باستخدام التقنيات القياسية.
ملاحظة: توجيه القرنية الجرحى لضمان أن تسفر تقطيع الأنسجة شريحة من القرنية.
-
إيمونوستينينج باستخدام 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB)
-
1 يوم
- تسمية الشرائح بشكل صحيح باستخدام قلم رصاص. دي بارافينيزي الأنسجة بوضع الشرائح في جرة مع مسح عامل (التغييرات 2، 10 دقيقة).
- ترطيب الأنسجة بنقل الشرائح إلى إيثانول في خفض تركيزات (100%، 100%، 70%، 50%، dH2س، dH20، 5 دقائق لكل تغيير).
- إجراء استرداد مستضد مايكرويف الشرائح في جرة بلاستيكية مع سترات المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 6.4) لمدة 5 دقائق. أولاً دورة 5 دقيقة بقوة 50%. إعادة ملء الجرة مع المخزن المؤقت لسترات وتكرار. يبرد لمدة 10 دقائق.
- أغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني، 2 دقيقة. بيرميبيليزي الأنسجة مع % 1 X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 10 دقيقة في كتلة الرايت الجزأين مع 3% الماعز العادي المصل (خ ع) ح 1 في RT في الغرفة الرطبة.
- احتضان الأنسجة بجسم الأولية (1: 100 أو كما يوحي المورد) في 3% خ ع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (300 ميليلتر كل شريحة).
-
2 يوم
- شطف الشرائح x 3 مع ببست (برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1% 20 توين)، 2 دقيقة. وضع الشرائح في 3 ٪ ح2س2 ل 10 دقيقة لكتلة البيروكسيديز الذاتية. أغسل x 3 مع ببست، 2 دقيقة. احتضان الأقسام مع جسم الثانوي (1: 250) برنامج الصحة الإنجابية في 3% خ ع عن ح 1 في الرايت (300 ميليلتر كل شريحة).
- تغسل شرائح 3 x PBST، 2 دقيقة. التعامل مع الشرائح مع عدة الدأب. إضافة 300 ميليلتر/الشريحة للحد الأدنى 3 يغسل الشرائح مع dH2س 2 x (الانخفاضات السريعة).
- كونتيرستين مع توضع ليغسل س. 20 الشريحة مع dH2س 2 x (الانخفاضات السريعة). وصمة عار مع وكيل لالتشطيب شطف س. 20 درهم2س للأنسجة ديهيدراتي س. 20 بوضع الشرائح في زيادة تركيزات إيثانول (50%، 70%، 100%، 100%، جميع الانخفاضات السريعة).
- الجاف للشرائح على منشفة ورقية تحت غطاء محرك السيارة لمدة 10-20 دقيقة.
- تحميل الشرائح باستخدام 1 قطره من تركيب وسائط، الغطاء مع ساترة. التسمية ومخزن في الرايت
- صورة الشرائح تحت مجهر، والتحديد الكمي لإشارة البث الإذاعي الرقمي مع إيماجيج7 (انظر القسم 4).
-
1 يوم
-
إيمونوستينينج: الأسفار
- في يوم 1 اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 2.2.1. نفذ الخطوات التالية في اليوم 2.
- شطف الشرائح x 3 في ببست لكل 2 دقيقة. احتضان الأقسام مع معلم fluorophore جسم الثانوية في 3% خ ع (1: 200) ح 1 في الرايت
- أغسل 3 x في ببست، 2 دقيقة. تحميل الشرائح باستخدام 1 قطره 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) تركيب وسائل الإعلام وتغطية مع ساترة. الجافة في منشفة ورقية تحت غطاء محرك السيارة للحد الأدنى 30 مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية حتى تصوير الأسفار.
-
تحديد مقدار استخدام "ي الصورة"
- تحميل إصدار "فيجي" إيماجيج، التي تشمل الإضافات اللازمة للبث الإذاعي الرقمي تلطيخ القياس الكمي.
- فتح صورة في فيجي وحدد صورة ← لون ← Deconvolution اللون.
- حدد "ح ربت" كوصمة عار وثم انقر فوق موافق. وسوف تظهر ثلاث صور جديدة. حدد الصورة التي تحتوي على تلطيخ الدأب فقط.
- لتحديد مقدار stromal تلطيخ فقط، استخدم الدالة ممحاة ImageJ لإزالة صورة الدأب الظهارة.
- حدد تحليل ← قياس (أو Ctrl + M) وسجل القيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إيمونوهيستوتشيميستري هو الفحص الأولية المستخدمة لتحليل نجاح السابقين فيفو الجرح تجربة الشفاء. ويصور الشكل 4 ظهارة وسدى الأمامي في الأنسجة التحكم (الشكل 4A, 4B). ست ساعات بعد إصابة، الظهارة كان غائبا (الشكل 4، 4 د). ستة أيام بعد إصابة كما هو متوقع، قد ريجروون الظهارة (الرقم 4E، 4F). وكان هذا النسيج إيمونوستينيد للعضلات الملساء ألفا أكتين (α-SMA)، التعبير الذي يميز ميوفيبروبلاستس. وهناك زيادة هائلة في إيمونوستينينج α-SMA في ستروما كما الكشف عنها بواسطة اللونية الدأب الركازة. وكانت هناك أيضا زيادة في مفاعليه الظهارية التي قد توحي EMT الانتقال7 (انظر المناقشة). وتجلى الفوضى في ظهارة وسدى. تظهر تجربة جرح في التكبير أقل ومع إيمونوستينينج الفلورسنت بدلاً من الدأب (الشكل 4، ح 4). الهامش الجرح مرئياً فضلا عن رج myofibroblasts النشطة من الأمامي إلى الخلفي سدى.
على الرغم من أن يتم التعبير عن علامات تليفية بأسبوع واحد (الشكل 4)، للحصول على تنمية متسقة وموثوق بها من علامات fibrotic، تم اختيار نقطة وقت أسبوعين. ويتجلى في الشكل 5 فحص استخدام تطبيق مرة واحدة من عنصر التحكم أو siRNA استهداف الجينات لفحصها لتعزيز شفاء التجدد. وفي هذه الحالة، كان siRNA الاستهداف ل USP10، ديوبيكويتيناسي. ميوفيبروبلاستس المرضية أظهر الالتصاق المتزايد من خلال تراكم αv-إينتيجرينس في تنسيق الالتصاقات21. دراساتنا السابقة قد أظهرت أن αvβ1 و αvβ5 إينتيجرينس تليفية هامة في الشفاء stromal القرنية7. إينتيجرينس ربط إدارة المحتوى في المؤسسة خارج الخلية ومعا أنهم يتم استيعابه. إنتغرين المدخلة هو أوبيكويتيناتيد وأرسلت للتدهور في يحلول أو تتم إزالة العلامة ubiquitin ديوبيكويتيناسي (لقب) وانتغرين المعاد تدويرها إلى سطح الخلية. فقد اكتشفنا أن زيادة التعبير الجيني من لقب (USP10) زيادة معدل إزالة أوبيكويتين من إنتغرين مفارز β1 و β5 مما أدى إلى إلى تراكم الناتجة من αv/β1/β5، على سطح الخلية، مع تنشيط TGFβ اللاحقة وتحريض علامات تليفية7. ضربة قاضية ل USP10 في ثقافة الجهاز القرنية يمنع ظهور علامات تليفية7. ويرد مثال على هذه النتائج في الشكل 5. أعلاه، تستخدم α-SMA كعلامة للحصول على ميوفيبروبلاستس. وثمة مؤشر آخر تندب هو فيبرونيكتين-إيدا (FN-إيدا)، متغير لصق في الجبهة الوطنية الذي يحتوي على إدارات، αv إنتغرين ملزمة المجال22،،من2324. أنه أيضا يسمى FN الخلوية (ج-الجبهة الوطنية). هو بمثابة علامة تليفية رئيسية منذ إيدا FN ليس في تعميم البلازما ولكن بدلاً من ذلك فقط أعرب ويفرز من الخلايا تحت ظروف تليفية25. ويرد في الشكل 5A-إيمونوستينينجج 5 ل α-SMA. مقارنة المعافين (الشكل 5A)، إصابة بالإضافة إلى مراقبة siRNA (الشكل 5B) أظهرت زيادة هائلة في التعبير البروتين α-SMA، بينما إضافة USP10 siRNA7 انخفاضا هائلا التعبير في سدى و ظهارة. وبالمثل، مقارنة المعافين (الشكل 5)، مما أدى إلى إصابة بالإضافة إلى مراقبة siRNA (الشكل 5E) أظهرت زيادة هائلة في التعبير البروتين فيبرونيكتين-إيدا مقارنة بالمعاملة مع siRNA USP10 (الرقم 5F). واستخدمت إيمونوهيستولوجي للبروتين الهدف (في هذه الحالة، USP10) لإثبات نجاح ضربة قاضية7. وبالإضافة إلى ذلك، أن أؤكد لأداء بكر qRT ضربة قاضية الجينات في الأنسجة أو أيضا الاعتداء الأخرى علامات تليفية7. يمكن استخدام إيماجيج لقياس الإشارات في ستروما فقط أو مجموع الإشارات (الشكل 5). ينبغي أن تستخدم القرنيات مالا يقل عن 3 لكل شرط يجري اختبار لقياس إيمونوستاينينج لتوليد دلالة إحصائية كما لدينا هو موضح هنا، ونشر قبل7. البروتينات الأخرى التي استخدمت بشكل روتيني لعلامات تليفية هي التعبير الثالث الكولاجين وزيادة إنتغرين التعبير1،26.
في الشكل 6، يتضح الاستخدام السابقين فيفو القرنية الثقافة مقايسة علم السموم. في هذه التجربة، كانت القرنية أما اليسار المعافين (الشكل 6A) وجرح (الشكل 6B)، أو أصيب بجروح وتعامل مع 10 ميكرون سبوتين-127، التي أضيفت إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية لزيادة فترات من الوقت قبل غسل ( 6 الرقم-6F). سبوتين-1 هو دواء الذي يستهدف غير تحديداً USP1027. بسبب نجاحنا مع USP10 siRNA، تم اختبار المعاملة سبوتين لفعاليتها في منع تندب. على عكس siRNA، كان سبوتين في هذا التركيز السمية للأنسجة. زيادة الوقت مع سبوتين-1 في الثقافة حالت دون إعادة ابيثيلياليزيشن وأسفر عن موت الخلايا النوعية ومصفوفة غير منظم واللحمية vacuoles مما يوحي بأن سبوتين-1 عدم التئام الجروح بتركيز جزيئي. يمكن أن تستخدم فحوصات نسيجية القياسية لتحديد حجم انتشار الخلايا أو المبرمج.
الشكل 1 : المقطع العرضي للعين البشرية مع عرض موسع للقرنية. في الرئيسات والدجاج، والأشيع هناك خمس طبقات متميزة: ظهارة بومان في غشاء وسدى، ديسيمينت للغشاء، والبطانة،من2829. في جميع الثدييات الأخرى، الغشاء في بومان غير مرئي الأشيع. المستوى المجهري الإلكترون انتقال، يلاحظ غشاء الطابق السفلي فصل ظهارة القرنية وسدى في جميع القرنيات بما في ذلك مع غشاء بومان. بومان سليمة للغشاء أو الغشاء يفصل الظهارة ستروما ضروري لمنع تندب في جميع الثدييات. طبع الصور مع الإذن من AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مخطط الأحداث الخلوية التي تؤدي إلى تندب القرنية. ويصور هذا الرسم التخطيطي الأحداث الأساسية التي تتكشف في القرنية الأمامية بعد إصابة. (أ) تصوير الظهارة الغشاء، ستروما وهادئة الخلايا المضمنة في سدى، أي، كيراتوسيتيس. (ب) المثلث الأحمر يصور جرح، التي يمكن أن تكون ميكانيكية، وقرحة، والفيروسات، أو الإصابة باستمرار. (ج) بعد إصابة، وفي الذي يتم انتهاكه بومان أو الغشاء الطابق السفلي، والخلايا حول أبوبتوسي الجرح. (د وه) تدفق الخلايا repopulate الجرح من كيراتوسيتيس المقيم أو الليفية المشتقة من نخاع العظم والانتقال إلى تنشيط الخلايا الليفية أو مباشرة إلى ميوفيبروبلاستس. Myofibroblasts المرضية (F) هذه ملتصقة إنشاء حلقة autocrine لتنشيط TGFβ وإفراز مصفوفة تليفية مشوش يعزز تكوين الضباب وندبة القرنية. في ريجينيراتيفيلي تلتئم الجراح، myofibroblasts تظهر ولكن قد أبوبتوسيد في الأنسجة تلتئم6،،من2930. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تلقي ومعالجة القرنيات لثقافة الجهاز. خنزير (A) ترد العيون مع أغطية لحماية القرنية أثناء الشحن. (ب) صورة من أنحاء العالم بعد إزالة الأنسجة. (ج) صورة ترفين 6 مم. (د) إصابة القرنية المركزية مع ترفين. (ه) صورة القرنية المحمل بعد إزالة من أنحاء العالم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : أنسجة القرنية بعد إصابة. تحليل إيمونوهيستولوجيكال المعافين (تحكم) أو القرنيات الجرحى. خنزير القرنيات غادر المعافين (تحكم) أو أصيب بجروح. وكانت أقسام الأنسجة إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة للعضلات الملساء ألفا أكتين (α-SMA) لتحديد ميوفيبروبلاستس. (أ و ب) عنصر التحكم، المعافين. (ج ود) جرحى وثابتة في ح 6 بعد إصابة. ظهارة هو إزالة (السهم). (E و F) جرحى وثابتة في 6 أيام بعد إصابة. ستروما قد شغلها في وقد ريجروون الظهارة (رأس السهم). تتم الإشارة إلى الممثل myofibroblasts المنشط مع العلامات النجمية (*). (ز، ح) انخفاض الصور التكبير من α SMA immunostaining 2 أسابيع بعد إصابة: α-SMA (أحمر)، DAPI (أزرق). الصور تم التقاطها باستخدام مجهر تستقيم الأسفار/برايتفيلد مع كاميرا CCD. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (أ، ج، ه)؛ 50 ميكرومتر (ب، د، و). 200 ميكرومتر (ز، ح). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . اختبار عوامل الشفاء التجدد. خنزير القرنيات كانت أما (أ ود) المعافين (مراقبة)، (باء و هاء) بجروح، وتعامل مع siRNA التحكم، أو (C و F) بجروح، وتعامل مع USP10 siRNA. إيمونوستينينج (أ-ج) α-SMA أو (د-و) فيبرونيكتين-للغوص. بعد العلاج مع USP10 siRNA، α-SMA بمقدار 2.2 ± 0.6 إضعاف * * * ف < 0.001 وإضعاف الجبهة الوطنية-إيدا 3.3 ± 1.2 * * ف < 0.01. الصور تم التقاطها باستخدام مجهر تستقيم الأسفار/برايتفيلد مع كاميرا CCD. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ز) القرنية stromal تلطيخ حسب الكمية التي إيماجيج. وحسب دلالة إحصائية ب ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار بونفيروني. الشكل قد تم تكييفه مع إذن من غيليسبي et al.7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : اختبار وكلاء للآثار في ريبيثيلياليزيشن-دراسات علم السموم. إيمونوستينينج أجل α-SMA. وكانت القرنيات خنزير المعافين (A)، و (ب) بجروح. (ج-F) جرح القرنية والمحتضنة مع 10 ميكرون سبوتين-1. مثبط غسلها والاستعاضة عنه بوسائل الإعلام بعد (ج) أيام 2، (د) 4 أيام، (ه) 6 أيام، (و) 14 يوما. وشملت جميع التغييرات الوسائط أثناء فترة الحضانة سباوتين كما هو مبين. جميع القرنيات ثابتة وجزءاً لا يتجزأ من البارافين بعد أسبوعين في الثقافة. الصور تم التقاطها باستخدام مجهر تستقيم الأسفار/برايتفيلد مع كاميرا CCD. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول نموذج لدراسة التئام الجروح في بيئة ثلاثية الأبعاد طبقية طبيعية. استخدام جهاز الثقافة كوسيط بين الخلية والثقافة والدراسات المجراة في يقلل كثيرا من التكاليف، فضلا عن الحد من الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الحية. 3D نماذج أخرى قد تم فائدة كبيرة في الميدان بما في ذلك ذاتية توليف الكولاجين المواد الهلامية مصنوعة من الابتدائي الليفية القرنية البشرية2 أو هذه الخلايا نفسها جزءا لا يتجزأ من المواد الهلامية مصنوعة من collagens المستمدة من الحيوانات31. النظام النموذجي ثقافة الجهاز مفيد بشكل خاص لاختبار عوامل الشفاء المفترضة حيث يتم ترجمة الجرح وهكذا هناك فارق واضح بين أنسجة المصابين وغير جرحى في القرنية نفسها (الشكل 4). وباﻹضافة إلى ذلك، جرح ترفين ميكانيكية يسمح بالوصول المباشر إلى سدى، وممتاز لإدارة سيرناس في الجرح (الشكل 5). على الرغم من أنه لا يظهر هنا، تم توصيل الفيروسية في أنسجة القرنية في ثقافة الجهاز أيضا أظهر32،،من3334. وسيكون التقليب آخر من هذا التحليل لتصيب القرنية مع بنية مراسل من مصلحة وصورة التعبير الجيني في الوقت الحقيقي بعد إصابة. من حيث الترجمة للدراسات المجراة في، يمكن أن يتم هذا الإجراء نفسه في الأرانب35 وهكذا ثقافة الجهاز على الإنسان، خنزير، أو القرنيات أرنب يمكن مقارنتها بالنتائج المجراة. في تجربتنا، ترجمت البيانات التي حصلنا عليها باستخدام نموذج الثقافة الجهاز مع العلاج siRNA إلى نفس النتائج التي توصل إليها في فيفو (بيانات غير منشورة). نظراً لنقص القرنيات ثقافة الجهاز المفرج حوفي وظيفية، والدموع، والخلط المائي، يجب تقييم كل محقق إذا كان هذا سوف يكون نموذجا مفيداً لدراستهم. التنشيط المقيمين من الخلايا المناعية وقد ثبت، ولكن التوازي الدقيق للدراسات المجراة في ليست واضحة1.
خطوة أساسية في البروتوكول لم تخترق القرنية بجرح عميق جداً. وهذا سوف يكون واضحا كما سوف تسرب السائل الغرفة الأمامية في هذه الحالة. في حالة حدوث ذلك، يجب أن يتم تجاهل العالم. لإنتاج جرحا حتى ميكانيكية، قبضة الشفة الأنسجة ترسيمها داخل منطقة تريفينيد مع فورسيب ثم قم بنقل بليد الجراحية موازية لسطح القرنية قطع الأنسجة بعيداً داخل حدود ترفين الجرح. ينبغي أن لا الجفاف على سطح القرنية وبالتالي نحن نوصي بعد صنع الجرح والاستغناء عن القرنية من أنحاء العالم، ووضع القرنية الوجه لأسفل في برنامج تلفزيوني حتى يصبح الخليط أجار في درجة الحرارة الصحيحة. التأكد من أن أجار ليس حار جداً سوف تجنب الضرر بطانية.
حد من هذا النموذج هو أن استخدام ترفين لإنتاج جرح غير متكافئ، ولا يمكن استنساخها مطابق تماما من القرنية بالقرنية مقارنة بالجروح التي يسببها الليزر36. ومع ذلك، بطبيعة الحال الجروح التي تحدث لا يعادل كل شيء في العمق ومجموعة كبيرة من البيانات تشير إلى أن أي خرق في غشاء الطابق السفلي يولد التنمية أرومية والضباب في ستروما، بينما التجدد الغشاء الطابق السفلي ويؤدي إلى تقلص تندب37،،من3839. هذا نموذج الثقافة الجهاز القرنية خنزير توظف جرح شديدة التي تتم إزالة الغشاء الطابق السفلي داخل المنطقة ترفين. تم تطوير ميوفيبروبلاستس وعلامات تليفية في سدى القرنية دائماً وإمكانية تكرار نتائج تحقيقها باستخدام هذا النظام النموذجي. بعض تلطيخ الظهارية يتجلى عادة أن يظلم في ظهارة الجرحى وريجروون. هذا قد تجلى في الأخرى تقارير الجهاز القرنية الثقافة40 لكن غائبة في معظم القرنيات من الماوس في فيفو وارنب دراسات41،42. بيد أن دراسة أجريت في نموذج كلاب المجراة في أظهر قوية الظهارية α-SMA تلطيخ في ظهارة بعد إصابة43. SiRNA التي تعزز الشفاء التجدد في دراساتنا أيضا إلى حد كبير تخفيض هذا immunostaining الظهارية، مما يوحي بأن الظهارة قد يخضع EMT (ندبات تليفية) عندما كان ريجرووس في ثقافة الجهاز. وبالإضافة إلى ذلك، أدى إغفال جسم الأولية في بروتوكول المصبوغة القرنية الجرحى الغياب التام لتلطيخ7 مما يدل على أن إيمونوستينينج محددة. المقاطع المجمدة (غير معروضة) شبيهة البارافين المقاطع في هذا الصدد. ومع ذلك، نظراً للخلفية طفيف لكنه متغير تلطيخ في الظهارة، لدينا مختبر فقط كمياً تلطيخ stromal، التي يبدو أن لديها أي خلفية نسيجية قضايا7.
إذا كانت إصابة القرنيات البشرية، قد يكون الحصول على القرنيات لا تستخدم لزرع بدلاً من الكرات الكاملة40أكثر فعالية من حيث التكلفة. وفي هذه الحالة، سوف إصابة القرنية دون مساعدة الضغوط التي تتيحها في أنحاء العالم. قد تتضمن استراتيجيات إضافية مما أدى إلى إصابة القرنية بيرنز، الذي قد استخدمت على نطاق واسع الحية لإنتاج ندبة42.
باختصار، هو مزايا هذا النظام لجرح أنسجة 3D شفاء المقايسة في إمكانية تكرار نتائج ووفورات التكاليف مع الاحتياجات من المعدات القياسية فقط، مما يجعل من مصدر ممتاز لمراقبة وقياس آثار وكلاء على شفاء الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها EY024942 R01 نيي المعاهد الوطنية للصحة، البحوث "منع العمى"، شمال ولاية الطبية جامعة غير المقيد أموال البحث، ومنطقة الليونز 20-يوسف مجهرية وتحليل الصور من مقاطع البارافين أجريت في "صميم مجهرية" و إعداد شرائح نسيجية أنجز في بيوريبوسيتوري وعلم الأمراض الأساسية في "مدرسة الطب آيكان" في جبل سيناء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100x |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100x |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100x |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100x |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200x |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10 mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera |
References
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
- Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
- Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
- Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
- Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
- Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
- Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
- Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
- Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
- Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
- Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
- White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
- Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
- Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
- Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
- Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
- Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
- Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
- Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
- Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
- Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).
