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Medicine

创面愈合研究的前活体角膜器官培养模型

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

介绍了一种适用于伤口愈合研究的体外角膜器官培养模型的方案。该模型系统可用于评估药物在有组织的3d 多细胞环境中促进再生愈合或药物毒性的效果。

Abstract

角膜已被广泛用作研究伤口愈合的模型系统。在二维 (2d) 和三维培养中产生和利用原代哺乳动物细胞的能力, 不仅产生了大量关于角膜生物学的信息, 而且还产生了大量关于伤口愈合、肌成纤维细胞生物学和一般疤痕的信息。.该方案的目标是一个检测系统, 用于定量肌成纤维细胞的发展, 其特点是疤痕。我们展示了一个角膜器官培养的体外模型使用猪眼。在这个前角膜切除术伤口, 角膜仍然在地球上受伤的圆形刀片称为树状。大约 1, 1 的角膜前部的塞子被切除, 包括上皮, 基底膜, 和前部的间质。受伤后, 角膜从地球上被切割, 安装在胶原蛋白基地, 并在补充血清游离培养基中培养两周, 并具有稳定的维生素 c, 以增加细胞增殖和细胞外基质分泌的居住性成纤维细胞。肌成纤维细胞在角膜愈合中的激活是明显的。该模型可用于检测创面闭合、肌成纤维细胞和纤维化标志物的发育以及毒理学研究。此外, 小分子抑制剂以及脂介导的 sirna 转染对基因敲除的影响可以在该系统中进行测试。

Introduction

由于受伤、外伤或感染而导致的角膜损伤会导致虚弱的不平衡和永久性视力下降。因此, 迫切需要确定可针对治疗干预的途径。目前的治疗选择有限, 主要包括角膜移植, 世界各地的病人都无法获得角膜移植。人 (图 1) 和动物角膜都可用于2d 和3d 细胞培养研究1,2。不适合移植的人体尸体角膜可以从眼库或中央组织库 (国家疾病研究相互交流 (ndri)) 获得, 动物眼睛可以从屠宰场获得。原代角膜上皮细胞、基质成纤维细胞以及最近的内皮细胞, 可以从这些组织中分离和培养, 用于伤口愈合和毒理学研究 3,4,5。除了了解致盲眼病的分子基础、组织的可获得性和培养原代细胞的能力外, 角膜也是重要的研究模型系统。角膜是理想的测试剂对疤痕的影响, 因为正常角膜是透明的, 某些类型的伤口造成不透明或纤维化疤痕 (回顾在 6)。几种体内角膜伤口愈合模型也被广泛用于疤痕研究1。利用较少的是体外角膜伤口愈合模型7,8 , 这里详细描述。该方法的目的是量化在三维多细胞角膜外模型系统中由纤维化的制造商所特有的疤痕结局。

角膜上皮伤, 不违反上皮基底膜通常关闭在 24-72 h9。受伤后不久, 上皮边缘的细胞开始扩散并迁移到上皮自由表面, 以重建上皮屏障功能。这一活动随后依次激活角膜基底细胞增殖, 并在稍后阶段, 前驱细胞位于外缘膜区, 以实现上皮细胞质量的恢复 10,11.这些伤口往往愈合而没有疤痕。然而, 穿透基底膜进入间质的伤口往往会导致疤痕形成1。角膜间质损伤后, 间质由多个来源的细胞组成, 包括分化的常驻间质细胞以及骨髓源性纤维细胞 12,13,14。纤维化疤痕的特点是肌成纤维细胞在愈合伤口的持久性。这些病理性肌成纤维细胞表现出增加的粘附通过整合整合在局灶性粘连, 收缩α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma) 应力纤维, 并局部激活细胞外基质 (ecm) 隔离后期转化的生长因子-β (tgfβ)。上皮细胞的分化, 称为上皮间充质转变 (emt), 也可能有助于瘢痕的形成 6.

细胞分化和损伤后细胞凋亡之间存在微妙的平衡。由于基底膜的断裂, 生长因子, 如血小板衍生生长因子 (pdgf) 和 tgfβ的生长因子, 如血小板衍生生长因子 (pdgf) 和 tgfβ, 由于眼泪和上皮沐浴的间质, 诱导肌成纤维细胞分化, 一个持续的自体循环 tgfβ, 和分泌不组织的纤维化 ecm15,16。肌成纤维细胞在愈合的伤口中的持续存在会促进角膜的雾霾和疤痕 (图 2)。然而, 在再生愈合的伤口, 虽然肌成纤维细胞的发展, 他们凋亡, 因此是缺席或明显减少的数量在愈合的组织 (回顾在参考6,10)。因此, 对纤维化疤痕的研究至少在一定程度上集中在靶向分子上, 以防止肌成纤维细胞过度发育或肌成纤维细胞持久性17,18。由于肌成纤维细胞的持久性在所有组织19中都有疤痕和纤维化疾病的特点, 角膜可能是研究纤维化的一般细胞机制的模型系统。

在我们的模型系统中, 角膜在地球上的时候被一个称为树状的圆柱形刀片击伤。人和猪角膜可以用6或7毫米的头孢菌伤;对于兔角膜是首选6毫米树状。猪角膜的大小与人角膜相似。因为猪角膜具有成本效益, 而且数量广泛, 因此通常用于器官培养。此外, 与人发生反应的抗体和 sirna 一直与猪7交叉反应。伤人后, 角膜被切割出地球与石灰完整, 并安装在琼脂胶原蛋白基地。角膜在无血清介质中培养, 并加入稳定的维生素 c, 以模拟成纤维细胞增殖和 ecm 沉积20。诱导肌成纤维细胞形成均不需要血清的添加和生长因子.在经过两周的培养后, 角膜定期固定和处理组织学。对于基因敲除, 或测试药物对伤口愈合的影响, 伤口可在伤后用 sirna 治疗, 伤后7人, 或可在培养基中添加可溶性剂, 分别为 8。

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Protocol

1. 器官文化

  1. 准备
    1. 准备琼脂解决方案, 如下所示。在一个小烧瓶中, 在 dmem-f12 中制备1% 琼脂和 1 mgml 牛胶原蛋白, 最高可达20毫升。在热盘上煮沸。将溶液放入50毫升的锥形管中。将管子放在热水澡中的热板上, 以防止溶液凝固。
    2. 根据材料表中提供的成分准备补充的无血清介质 (ssfm)。
      请注意:要准备的 ssfm 的必要数量取决于要处理的角膜数量。通常30毫升是足够的4角膜的介质。
  2. 夹层
    请注意:在解剖罩或化学罩中执行此步骤。眼睛上装着仍然贴在单独袋子里的盖子, 以保护球体。
    1. 在乙醇清洗的切菜板上使用直边手术刀片去除盖子上的球体。使用刀片或小剪刀从眼睛中取出多余的脂肪组织 (图 3 a, 3A)。
    2. 从盖子上取下地球后, 用钳子向后固定地球, 并立即将眼睛浸入磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中。快速将其浸入10% 碘的 3倍 (100 毫升烧杯)。在 pbs 中快速下降 2倍 (在烧杯中约100毫升, 频繁更换 pbs)。
    3. 使用干净的毛巾或组织, 用足够的压力环视包裹眼睛, 使角膜表面紧绷, 以便用皮下平切割。
      注: 注意防止毛巾或组织接触角膜。
  3. 伤
    1. 使用6毫米的树状水缠绕角膜的中心。穿透上皮和前间质, 而不使整个角膜完全厚度的伤口。
      请注意:如果内皮被穿透, 将看到压力损失和泄漏液体。在这种情况下, 眼睛应该丢弃。
    2. 将树状液放置在角膜中心, 顺时针旋转180°和逆时针旋转 5倍 (每次方向改变时, 它将计入一次), 同时施加光压加深伤口。
      请注意:伤口现在应该足够深, 可以用一对钳子解除组织瓣。如果不是这种情况, 请重复步骤1.3.2。
    3. 从边缘提起皮瓣。同时, 无论是与另一只手或与第二个人, 使用刀片, 切割平行于地球, 以切断组织, 因为钳子继续解除前角膜在伤口边缘。在这一步结束时, 角膜中心应该有一个圆形伤口 (见图 3c, 3C)。
  4. 从地球上切割和去除角膜
    1. 用纸巾抱着眼睛, 用刀片在离角膜边缘1毫米远的地方做一个小切口, 这样, 利姆布就包括在器官培养中。
    2. 使用小的, 尖锐的剪刀进入在前一步创建的切口切割全球, 保持毫米边缘整个角膜, 以保持石灰完整。
    3. 将角膜放入60毫米的盘子中, 带1毫升的 pbs, 伤口侧向下, 直到安装。
  5. 安装
    1. 确保琼脂的温度达到了温暖 (约 25°c)。
    2. 用两对钳子, 通过将角膜的两侧与内皮侧向上固定, 创建一个杯。使用无菌转移移液器将加热后的琼脂溶液加入角膜, 直到其充满。
    3. 琼脂变硬 (通常约 30-45秒) 后, 用琼脂小心地将角膜翻转成60毫米板 (图 3e)。盖上盖子。
  6. 孵化
    1. 在板上加入4毫升 ssfm, 在37°c 的情况下, 在 5% co2 的角膜缘保持角膜.24小时后刷新媒体, 此后每隔一天刷新一次。
      请注意:如果对伤口进行转染, 在转染后省略抗生素。
    2. 每天将角膜表面弄湿一次, 在盘子中的调理介质中加入1滴 ssfm, 以保持水分。为此, 将盘子从孵化器中取出, 放置在引擎盖下, 取出盘子盖, 用无菌移液器从盘子中用介质弄湿表面, 再次盖上盖子, 放回孵化器。
    3. 对于基因敲除, 请按照供应商的指示 (见下文), 用基因靶向或控制 sirna 来治疗伤口, sirna 与脂质介导的载体相复合 (见下文)。
    4. 将 5μl (50 pmol) sirna 混合到50μl 的血清最低必要培养基 (例如, opti-mem) 中。将转染试剂的2μl 混合到50μl 的降血血清培养基中。让这个坐 5分钟, 然后混合它们。
    5. 在 reagents/sirna 混合物中加入200μl 的降血最低培养基。
    6. 移液器滴在伤口上, 孵育3小时。
    7. 用盘子里的介质从角膜表面洗出 sirna。将培养介质更改为 ssfm + 抗生素 (请参阅材料表)。如前所述 (步骤 1.6.1-1.6.2) 继续孵育。

2. 组织学: 石蜡切片和免疫染色

  1. 准备组织
    1. 经过两周的培养, 如果使用部分组织进行定量实时聚合酶链反应 (qrt-pcr) 分析, 在固定之前, 通过伤口将角膜切割成一半。将这一半或只有---------------------------------------------------------------
    2. 使用标准的隔离试剂盒, 分离 rna 并执行 qrt-pcr。
      请注意:或者, 受伤的部分只能被分离并进行基因表达测试。
    3. 将角膜的另一半放入组织病理盒, 并在室温下 (rt) 下 2天 (10% 福尔拉林) 淹没在固定剂中2-4。
    4. 石蜡用标准技术嵌入了这一半的角膜受伤。
      请注意:将受伤的角膜定向, 以确保组织切片将产生角膜的横截面。
  2. 使用 3, 3 '-二氨基苯并嗪 (dab) 进行免疫保存
    1. 第1天
      1. 使用铅笔正确地标记幻灯片。将滑块放入带清除剂的罐子中, 使组织脱焦 (2个变化, 每次 10分钟)。
      2. 通过将滑块转移到乙醇中, 以降低浓度 (100%、100%、70%、50%、dh 2o、dh2o, 每次变化5分钟) 将组织补充水分。
      3. 用柠檬酸缓冲液 (10 mm, ph 6.4) 在塑料罐中对幻灯片进行5分钟的抗原回收。第一周期 5分钟, 50% 的功率。用柠檬酸缓冲液填充罐子, 然后重复。冷却10分钟。
      4. 用 pbs 清洗 3倍, 每次2分钟。在 rt. 块切片中, 用 1% triton x-100 在 rt 块切片中, 在湿腔用3% 的正常山羊血清 (ngs) 进行1小时的渗透。
      5. 在 4°c (每张幻灯片 300μl) 下, 用原生抗体 (1:100 或供应商建议) 隔夜在3% 的 ngs 中培养组织。
    2. 第2天
      1. 用 pbst (pbs 加 1% tween 20) 冲洗幻灯片 3x, 每次2分钟。将滑块放入 3% h2o2 10分钟, 以阻断内源性过氧化物酶.用 pbst 清洗 3倍, 每次2分钟。用 hrp 二级抗体 (1:250) 在3% 的 ngs 中培养部分, 在 rt (每张幻灯片 300μl) 下1小时。
      2. 清洗幻灯片 3x pbst, 每张2分钟。使用 dab 工具包处理幻灯片。加入 300μl/幻灯片 3分钟, 用 dh 2x 2x(快速浸渍) 清洗幻灯片。
      3. 用血红素进行20次染色, 用 dh2o2x (快速浸渍) 清洗幻灯片。用蓝剂染色 20秒, 用 dh2o冲洗 20秒, 通过将滑块放入不断增加的乙醇浓度 (50%、70%、100%、100%, 所有快速浸渍) 中脱水组织。
      4. 在引擎盖下的纸巾上擦干滑块10-20。
      5. 使用1滴安装介质安装幻灯片, 盖上盖板。在 rt 标签和存储。
      6. 在显微镜下对幻灯片进行成像, 并使用 imagej7量化dab 信号 (见第4节)。
  3. 免疫染色: 荧光
    1. 第1天, 请按照步骤2.2.1 中描述的步骤进行操作。在第2天执行以下步骤。
    2. 在 pbst 中冲洗 3 x, 每次2分钟。在3% 的 ngs (1:200) 中用荧光标记的二级抗体培养一段, 在 rt 中培养1小时。
    3. 在 pbst 中清洗 3倍, 每次2分钟。使用1滴 4 ', 6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi) 安装介质和盖板覆盖。在引擎盖下擦干纸巾 30分钟, 在4°c 的黑暗中储存, 直到荧光成像。
  4. 使用图像 j 进行量化
    1. 下载 imagej 的 "斐济" 版本, 其中包括 dab 染色定量所需的插件。
    2. 在斐济中打开图像, 然后选择"图像→颜色→颜色反褶积"。
    3. 选择 "h dab" 作为污渍, 然后单击 "确定"。将出现三个新图像。选择仅包含 dab 染色的图像。
    4. 要只量化间质染色, 请使用 imagej 橡皮擦功能从 dab 图像中去除上皮。
    5. 选择"分析" → "测量" (或 ctrl + m) 并记录值。

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Representative Results

免疫组织化学是分析体外创面愈合实验成功的主要方法。图 4显示对照组织中的上皮和前间质 (图 4a, 4A)。受伤6小时后, 上皮无 (图 4c, 4C)。如预期的伤势后六天, 上皮已重新生长 (图 4e, 4E)。该组织对α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma) 进行免疫抑制, 其表达特征是肌成纤维细胞。比色 dab 底物检测到的滤过层间质α-sma 免疫染色显著增加。也增加了上皮反应, 这可能表明 emt 过渡7 (见讨论)。上皮和间质的紊乱是明显的。用较低的放大倍率和荧光免疫染色代替 dab 进行损伤实验 (图 4g, 4G)。伤口边缘是可见的, 以及从前间质的活性肌成纤维细胞梯度。

虽然纤维化标记物表达一周 (图 4), 但为了获得纤维化标记物的一致和可靠的发展, 选择了两周的时间点。在图5中, 证明了一种使用一次性应用控制或基因靶向 sirna 进行测试以促进再生愈合的方法。在这种情况下, 靶向 sirna 适用于 usp10, 一种去泛素酶。病理肌成纤维细胞通过在局灶性粘连21中的α-整合素积累而表现出增加的粘附。我们以前的研究表明, αvβ1和αvβ5是角膜间质愈合7的重要纤维化整合素。integrins 将 ecm 结合在细胞外部, 并将其内部化。内化的整合素是泛素, 并被送往降解在溶酶体或泛素标记被去泛素酶 (dub 酶) 和整合到细胞表面。我们发现, dub (usp10) 基因表达的增加增加了从整合子单位β1和β5中去除泛素的比率, 从而导致α-β5在细胞表面的积累, 随后 tgfβ激活和诱导纤维化标记7。在角膜器官培养中, usp10 的击倒阻止了纤维化标志物7的出现。这些结果的示例如图 5所示。如上所述, α-sma 被用作肌成纤维细胞的标记。疤痕的另一个指标是 fn 的一个接合变量, 包含 rgd, α整合素结合域 22,23, 24.它也被称为细胞 fn (c-fn)。它作为一个关键的纤维化标记, 因为 f1-eda 不是在循环血浆, 而是只由细胞表达和分泌在纤维化条件下 25.图5a-5c α-sma 免疫染色如下。与未受伤者 (图 5a) 相比, 损伤加控制 sirna (图 5A) 显示α-sma 蛋白表达急剧增加, 而 usp10 sirna 7 的添加显著降低了间质和上皮。同样, 与未受伤者 (图 5d) 相比, 伤人加控制 sirna (图 5D) 显示, 与 usp10 sirna 治疗相比, 纤维检测-eda 蛋白表达显著增加 (图 5D)。目标蛋白 (在这种情况下, usp10) 的免疫组织学被用来证明成功击倒 7.此外, 执行 qrt-pcr 可以保证组织中的基因敲除, 也可以检测其他纤维化标记 7.imagej 可用于量化仅在间质中的信号或总信号 (图 5g)。对于每个被测试的疾病, 至少有3个角膜应该用来量化免疫染色, 以产生统计意义, 正如我们在这里所显示的, 并在以前发表了7。其他经常用于纤维化标记的蛋白质是胶原蛋白 iii 表达和整合素表达的增加1,26。

在图 6中, 使用体内角膜培养物被证明是一种毒理学检测。在这个实验中, 角膜要么没有受伤 (图 6a), 要么受伤 (图 6A), 并接受 10μm spautin-127 的治疗, 在洗出之前, 角膜被添加到细胞培养培养基中的时间越来越长 (图 6c-6f).Spautin-1 是一种非专门针对 usp1027的药物。由于我们在 usp10 sirna 方面的成功, spautin 治疗被测试为有效地防止疤痕。与 sirna 不同的是, 在这种浓度下的 spautin 对组织是有毒的。随着 Spautin-1 在培养中的时间的增加, 防止了重新上皮化, 并导致定性细胞死亡, 无组织的基质和间质液泡表明, spaututin-1 不会促进愈合在浓度检测。标准组织学检测可用于量化细胞增殖或凋亡。

Figure 1
图 1: 人眼的横截面, 角膜的扩大视图.在灵长类动物和鸡, 组织学上有五个不同的层: 上皮, 鲍曼的膜, 间质, 装饰的膜, 和内皮 28,29。在所有其他哺乳动物中, 鲍曼的膜在组织学上是不可见的。在透射电子显微镜层, 观察到基底膜分离角膜上皮和间质的所有角膜, 包括那些与鲍曼的膜。一个完整的鲍曼的膜或基底膜分离上皮从间质是必要的, 以防止疤痕的所有哺乳动物。经 AllAboutVision.com com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm) 许可转载的图像。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 导致角膜疤痕的细胞事件图.这张图描绘了受伤后在前角膜中展开的基本事件。(a) 描述上皮、基底膜、基质和嵌于基质中的静止细胞, 即角质细胞。(b) 红色三角形描述的伤口, 可以是机械的, 溃疡, 病毒, 或持续感染。(c) 在伤人受伤后, 在其中鲍曼或基底膜被破坏, 伤口周围的细胞凋亡。(d和e) 从常驻角质细胞或骨髓产生的成纤维细胞重新填充伤口, 并过渡到活化成纤维细胞或直接转化为肌成纤维细胞。(f) 这些粘附的病理肌成纤维细胞形成 tgfβ激活的自体循环和不组织的纤维化基质分泌, 促进角膜雾霾和疤痕的形成。在再生愈合的伤口中, 肌成纤维细胞出现, 但在愈合的组织中出现凋亡6,29,30。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 接收和处理器官培养角膜.(a) 猪眼睛收到盖子, 以保护角膜在运输过程中。(b) 组织被移除后的地球图像。(c) 6 毫米树状的图像。(d) 用树状的方法对中心角膜进行撞击。(e) 从地球上移除后安装的角膜的图像。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 受伤后的角膜组织.未受伤 (对照) 或受伤角膜的免疫组织学分析。猪角膜要么没有受伤 (控制), 要么受伤。组织切片免疫抑制与抗体α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma), 以确定肌成纤维细胞。(a和b) 控制, 没有受伤。(c和d) 受伤后6小时受伤和固定。上皮被移除 (箭头)。(e及f) 受伤后6天受伤及固定。骨髓有填充物, 上皮已再生 (箭头头)。有代表性的活化肌成纤维细胞用星号表示 (*)。(G, H)α-sma 免疫染色在伤后2周的低放大倍率图像: α-sma (红色)、dapi (蓝色)。图像是用垂直荧光显微镜-明亮场显微镜和 ccd 摄像机拍摄的。刻度杆 = 100μm (a、c、e);50μm (b、d、f);200微米 (g, h)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5.检测再生治疗剂.猪角膜要么 (a和d) 未受伤 (对照), (b和e) 受伤, 用对照 sirna 治疗, 要么 (c和f) 受伤, 用 usp10 sirna 治疗。免疫染色为 (a-c)α-sma 或 (d-f)纤维肌动蛋白 eda。用 usp10 sirna 处理后, α-sma 减少 2.2±0.6倍 * * * p < 0.001 和 f1-eda 3.3±1.2 倍 * * p < 0.01。图像是用垂直荧光显微镜-明亮场显微镜和 ccd 摄像机拍摄的。标度条 = 50μm. (g) 由 imagej 量化的角膜间质染色。用邦费罗尼试验的单向方差分析计算了统计意义。经 g级 espie 等人许可, 对图进行了改编。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 影响再上皮化的检测剂-毒理学研究.α-sma 的免疫染色。猪角膜没有受伤, (b) 受伤。(C-F)角膜受伤, 用 10μm spautin-1 孵育。抑制剂在 (c) 2天、(d) 4天、(e) 6天、(f) 14天后被冲走并更换.潜伏期内的所有培养基变化都包括如图所示的 spautin。所有角膜在培养2周后都固定并嵌入石蜡中。图像是用垂直荧光显微镜-明亮场显微镜和 ccd 摄像机拍摄的。刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

该协议描述了一个模型, 用于研究在自然分层三维环境中的伤口愈合。使用器官培养作为细胞培养和体内研究之间的中间体, 大大降低了成本, 也减少了活体动物的程序。其他3d 模型对该领域有很大的好处, 包括由原代人类角膜成纤维细胞 2或这些相同的细胞嵌入在由动物衍生胶原蛋白31制成的凝胶中的自合成胶原蛋白凝胶.器官培养模型系统对于测试假定的治疗剂特别有用, 因为伤口是局部的, 因此在同一角膜的受伤和非受伤组织之间有明显的边缘 (图 4)。此外, 机械树状伤口允许直接进入间质, 这对于将 sirna 用于伤口非常有利 (图 5)。虽然它没有显示在这里, 病毒转导到角膜组织在器官培养也被证明 32,33,34。该方法的另一个排列方法是在伤后实时感染角膜, 并实时进行有意义的 c一片结构和图像基因表达。在体内研究的翻译方面, 同样的程序可以在兔子35 中完成, 因此可以将人、猪或兔角膜上的器官培养与体内结果进行比较。根据我们的经验, 我们使用 sirna 治疗的器官培养模型获得的数据已经转化为体内类似的发现 (未公布的数据)。由于器官培养角膜缺乏功能性角膜血管, 眼泪和水幽默, 每个调查员必须评估, 如果这将是一个有用的模型, 为他们的研究。免疫细胞的居民激活已经被证明, 但与体内研究的确切相似之处尚不清楚1。

协议中的一个关键步骤是不要因伤得太深而穿透角膜。这将是显而易见的, 因为在这种情况下, 前房液体会泄漏。如果发生这种情况, 应丢弃地球。要产生均匀的机械伤口, 用强制抓住树状区域内被划伤的组织的唇, 然后将手术刀片平行于角膜表面, 将组织切断在树状伤口的边界内。角膜表面不应干燥, 因此我们建议, 在使伤口和切割出角膜从地球上, 把角膜脸朝下在 pbs, 直到琼脂混合物在正确的温度。确保琼脂不太热, 可以避免内皮损伤。

这种模式的一个局限性是, 使用树突产生伤口是不均匀的, 不能复制相同的角膜从角膜到角膜相比, 激光诱导的伤口 36.然而, 自然发生的伤口并不都是相当的深度, 大量的数据表明, 基底膜中的任何突破都会导致基质中肌成纤维细胞的发育和雾霾, 而基底膜的再生会导致减少疤痕37,38,39。这种猪角膜器官培养模型采用了严重的伤口, 在这种伤口中, 基底膜被切除在树状的区域内。该模型系统在角膜基质中的肌成纤维细胞和纤维化标志物的发展是一致和重现性的。一些上皮染色通常是明显的, 在受伤和再生上皮变暗。这已经在其他角膜器官培养报告40证明, 但在大多数角膜是不存在的, 从体内小鼠和兔子研究41,42。然而, 在体内犬模型中进行的一项研究显示, 43 人受伤后上皮上皮中的强上皮α-sma 染色。在我们的研究中促进再生愈合的 sirna 也显著降低了这种上皮免疫染色, 这表明上皮可能正在接受 emt (纤维化疤痕) 时, 它在器官培养中再生。此外, 在角膜损伤的染色协议中忽略一个主要抗体导致完全没有染色7表明免疫染色是特异性的。在这方面, 冷冻部分 (未显示) 与石蜡部分相似。然而, 由于上皮的轻微但可变的背景染色, 我们的实验室只量化了间质染色, 这似乎没有背景组织学问题7。

如果伤害人角膜, 获得不用于移植而不是全球体的角膜可能更具成本效益.在这种情况下, 如果没有全球提供的压力, 角膜将受伤。其他伤人策略可能包括角膜烧伤, 角膜烧伤已被广泛用于体内产生疤痕 42.

总之, 该系统的优点是它的再现性和成本节约, 只有标准的设备需要, 使它成为一个优秀的资源, 观察和量化剂对组织愈合的影响。

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Disclosures

提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作得到了 nih-nei r01 ey024942、预防失明研究、州立医科大学无限制研究基金和狮子区20-y 的支持, 在显微镜核心进行了石蜡切片的显微镜和图像分析。组织学幻灯片的准备工作是在西奈山伊坎医学院的生物存储和病理核心进行的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

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References

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创面愈合研究的前活体角膜器官培养模型
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Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

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