Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo роговицы орган культуры модель для заживления ран исследований

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Протокол для ex vivo роговицы орган культуры модель полезна для заживления ран исследований описано. Эта модель система может использоваться для оценки воздействия агентов для ускорения регенеративных заживления или токсичности препарата в организованной среде 3D многоклеточных.

Abstract

Роговицы широко используется как модель системы для изучения заживление ран. Способность создавать и использовать основной mammalian клеток в двух размеров (2D) и три трехмерные (3D) культуры вызвало большой объем информации не только о роговицы биологии, но и о рану исцеление, Миофибробласт биологии и в целом рубцов . Целью протокола является системой пробирного для количественной оценки развития Миофибробласт, который характеризует рубцов. Мы демонстрируем роговицы орган культуры ex vivo модель с помощью свинья глаза. В этом передней кератэктомия раны с дисковой пилы, называемый трепаном являются ранения роговицы до сих пор в мире. Вилка примерно 1/3 передней роговицы удаляется, включая эпителия, базальной мембраны и передней частью стромы. После ранения, роговицу вырезанные из шара, смонтирован на базе коллагена/агар и культивируемых на две недели в дополнение сыворотка бесплатно средний с стабилизированный витамин C дополнить пролиферации клеток и внеклеточного матрикса секреции от резидентов фибробластов. Активация миофибробласты в передней стромы проявляется в исцелил роговицы. Эта модель может использоваться для анализа закрытия РАН, развитие миофибробласты и фиброзных маркеры и токсикологических исследований. Кроме того последствия малых молекул ингибиторов, а также липидов опосредованной siRNA трансфекции за нокдаун гена может испытываться в этой системе.

Introduction

Рубцов в результате травмы, травмы или инфекции роговицы может привести к изнурительной помутнения и потере постоянного зрения. Таким образом есть острую необходимость определения путей, которые могут быть направлены для терапевтического вмешательства. Текущие параметры лечения ограничены и состоят в основном из операций по пересадке роговицы, которые не являются доступными для пациентов по всему миру. Человека (рис. 1) и животных роговицы может быть использован для 2D и 3D клеточной культуры исследования1,2. Не подходит для пересадки роговицы человека труп можно получить от глаз банков или централизованной тканевых банков (национальных болезни исследования обмена (НДРИ)), и животное глаза могут быть получены из скотобойни. Первичный роговицы эпителиальных клеток, фибробласты стромы и совсем недавно, эндотелиальные клетки, можно изолированные культивированный из этих тканей для заживления ран и токсикология изучает3,4,5. Помимо важности понимания молекулярные основы слепоте глазных болезней доступность ткани и способность к первичной культуре клеток сделал роговицы систему важной моделью для изучения. Роговицы идеально подходит для тестирования влияния агентов на рубцы, как нормальные роговицы является прозрачным и некоторых видов РАН создавать помутнения или фиброзных рубцов (обзор в6). Несколько в vivo роговицы рану исцеления модели широко использовались также для рубцов исследований1. Меньше использовать был ex vivo роговицы раны исцеления модель7,8 , опишите подробно здесь. Цель этого метода заключается в количественном определении рубцов результаты характеризуются фиброзных создателей в 3D многоклеточных роговицы ex vivo модели системы.

Роговицы эпителиальных ранения, которые не нарушают эпителиальных базальной мембраны обычно закрывается в течение 24-72 ч9. Вскоре после ранения, клетки на краю эпителия начать распространение и мигрируют в свободной поверхности эпителия, чтобы восстановить эпителиальные барьерную функцию. Эта деятельность последовательно следуют активации роговицы базально-клеточной пролиферации, первый и, в более поздней стадии, расположенные в зоне внешней послабляющие добиться восстановления эпителиальных клеток массы10,11клеток-предшественников. Часто эти раны заживают без рубцов. Однако рана, которая проникает стромы базальной мембраны часто приводит к шрам формирования1. После ранения роговицы стромы, строма заполняется с ячейками нескольких происхождения, включая дифференцированных резидентов стромальных клеток, а также костный мозг производные фиброциты12,,1314. Фиброзных рубцов характеризуется сохранением миофибробласты в заживления раны. Эти патологические миофибробласты продемонстрировать увеличение адгезии через накопление интегринов в фокуса спайки, сократительная α-гладких мышц актина (α-SMA) стресс волокон и локальная активация внеклеточного матрикса (ECM)-поглощенных латентный преобразование фактор роста бета (TGFβ). Дифференцировки эпителия производные клеток, известный как эпителиального мезенхимальных перехода (EMT), может также способствовать шрам формирования6.

Существует тонкий баланс между дифференцировки клеток и апоптоз после ранения. Из-за нарушения в базальной мембраны, факторы роста, такие, как тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и TGFβ от слез и эпителия купаться стромы, вызывая Миофибробласт дифференциации, устойчивый Аутокринный петля TGFβ активации и секрецию дезорганизованы фиброзных ECM15,16. Сохранением миофибробласты в зарубцевавшиеся раны способствует дымки и рубцов в роговице (рис. 2). Однако, в регенеративным зарубцевавшиеся раны хотя миофибробласты развиваются, они apoptose и таким образом отсутствуют или значительно сокращена в номер в зарубцевавшиеся ткани (обзор в ссылка6,10). Таким образом по крайней мере в части исследования по фиброзных рубцов уделялось ориентации молекул, которые препятствуют чрезмерной Миофибробласт развития или Миофибробласт сохранение17,18. Потому что Миофибробласт сохранение характеризует рубцов и фиброзных болезни всех тканей19, роговицы может быть полезным в качестве модельной системы для изучения общих клеточных механизмов фиброза.

В нашей модели системы с лезвием цилиндрические, называемый трепаном еще в мире ранения роговицы. Человека и свинья роговицы может быть ранен с либо 6 или 7 мм трепанации; для кролика роговицы трепаном 6 мм является предпочтительным. Свинья роговицы аналогичные по размеру человека роговицы. Потому что они являются экономически эффективным и легко доступны в больших количествах, свинья роговицы обычно используются для органной культуры. Кроме того антитела и малые интерферирующие РНК, сделал реагировать с человека последовательно cross-reacted с свинья7. После ранения, роговицы, вырезанные из шара с лимба нетронутыми и смонтирован на базы агар/коллагена. Роговицы культивировали в сыворотке свободных СМИ плюс стабилизированный витамин С для моделирования распространения фибробластов и ECM осаждения20. Добавлением сыворотки ни факторы роста необходимо побудить Миофибробласт формирования7. Роговицы обычно закрепляются и обрабатываются для гистологии после двух недель культуры. Нокдаун гена, или для проверки воздействия агента на заживление ран рану можно лечить с помощью малых интерферирующих РНК в рану после ранения7 или растворимые агента могут быть добавлены к средствам массовой информации, соответственно8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. орган культура

  1. Подготовка
    1. Готовят раствор Агар следующим образом. В небольшой флакон, подготовить 1% агар и бычьего коллагена 1 мг/мл в среде DMEM-F12 до 20 мл. Доведите до кипения на горячей плите. Положите раствор в 50 мл Конические трубки. Место труб в водяной бане на горячей плите сохранить решение от застывающих.
    2. Подготовьте дополненный сыворотки свободных СМИ (SSFM) по составу, представлена в Таблице материалов.
      Примечание: Необходимое количество SSFM должен быть подготовлен зависит количество роговицы для обработки. 30 мл обычно достаточно средств массовой информации для 4 роговицы.
  2. Рассечение
    Примечание: Выполните этот шаг в рассечение капот или химические вытяжки. Глаза поставляются с крышками, по-прежнему придает в отдельные пакеты для защиты глобусы.
    1. Удалите глобусы с крышками с линейка хирургическое лезвие на разделочную доску, этанол очищены. Удалите избыток жировой ткани из глаз с помощью лезвия или маленькие ножницы (рис. 3A, 3B).
    2. После удаления шара из крышки, удерживайте миру кзади пинцетом и сразу окунуть глаз в фосфат амортизированное saline (PBS). Быстро окунуть его 3 x 10% йода (в 100 мл стакан). Быстро окуните 2 x в PBS (~ 100 мл в стакан, изменения PBS част).
    3. С помощью чистое полотенце или ткань, оберните глаз окружности с достаточное давление, чтобы иметь подтянутый поверхность роговицы отрезать с трепан.
      Примечание: позаботьтесь, чтобы предотвратить обращение роговицы полотенцем или салфеткой.
  3. Ранение
    1. Используйте 6 мм трепаном ранить центр роговицы. Проникать эпителия и передней стромы без делать полный толщина рану через весь роговицы.
      Примечание: Если проникли эндотелия, будет рассматриваться потеря давления и электролита. В этом случае глаз должен быть уничтожен.
    2. Место трепаном в центре роговицы, повернуть его на 180° по часовой стрелке и против часовой стрелки 5 x (каждый раз меняется направление будет считаться как один раз) при применении давления света углубить рану.
      Примечание: Раны теперь должно быть достаточно глубоко, чтобы позволить лоскут ткани будут отменены с помощью пары щипцов. Если это не дело повторите шаг 1.3.2.
    3. Поднимите откидную крышку от краев. В то же время с другой стороны или с вторым человеком, используйте лезвие, резка параллельна земной шар, чтобы отрезать ткани как щипцы продолжают подъема передней роговицы в полях рану. По завершении этого шага должна быть круговой рану, расположенный в центре роговицы (см. рис. 3 C, 3D).
  4. Вырезание и удаление роговицы из мира
    1. Держа глаз с ткани, Сделайте небольшой надрез 1 мм от края роговицы с лезвием, так что лимба включен в органной культуры.
    2. Использование малых, острые ножницы доступ разрез, созданный в предыдущем шаге сократить во всем мире, сохраняя миллиметр разницы во всем сохранить нетронутыми лимба роговицы.
    3. Место роговицы в 60 мм блюдо с 1 мл PBS, стороны раны вниз до монтажа.
  5. Монтаж
    1. Убедитесь, что агар пришел к теплой температуры (примерно 25 ° C).
    2. С двумя парами щипцы создайте чашку, удерживая обе стороны роговицы с эндотелиальной стороной. Добавьте агар подогретый раствор в роговицы с помощью пипетки стерильные передачи до тех пор, пока он полностью.
    3. После того, как агар затвердевает (обычно около 30-45 s) тщательно флип роговицы с агар в 60 мм пластины (рис. 3E). Накройте крышкой.
  6. Инкубация
    1. Добавить 4 мл SSFM к пластине, поддержание роговицы в воздухе жидкость интерфейс послабляющие в на границе 5% CO2 при 37 ° C. Обновите СМИ после 24 h и после этого каждый день.
      Примечание: Если эффективность трансфекции в рану, опустите антибиотики после transfection.
    2. Влажная поверхность роговицы, один раз в день, добавляя 1 капля SSFM с кондиционером СМИ в блюдо, чтобы сохранить влагу. Для этого возьмите блюдо из инкубатора, поместить его под капот, крышку блюдо, мокрой поверхности с СМИ от блюдо с помощью стерильной пипеткой, охватывают снова и положил его обратно в инкубаторе.
    3. Нокдаун гена лечить раны с таргетингом на ген или управлять siRNA complexed липидов опосредованной перевозчику согласно инструкциям поставщика (см. ниже).
    4. Mix 5 мкл (50 пмоль) интерферирующей РНК в 50 мкл сокращение сыворотке минимальных основных СМИ (например., Opti-MEM). Смешайте 2 мкл Реагента трансфекции в 50 мкл сокращение сыворотке средств массовой информации. Пусть это сидеть в течение 5 мин и затем смешивать их.
    5. Добавьте 200 мкл сокращение сыворотке минимальных средств массовой информации в смеси реагентов/siRNA.
    6. Пипетка каплям на рану и Инкубируйте 3 h.
    7. Промойте siRNA от поверхности роговицы с СМИ в блюдо. Измените инкубации СМИ SSFM + антибиотики (см. Таблицу материалов). Продолжать инкубации как упоминалось ранее (шаги 1.6.1-1.6.2).

2. Гистология: Парафиновых срезах и иммуноокрашивания

  1. Подготовка ткани
    1. После инкубации две недели, если использовать некоторые из ткани для количественных реального времени полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) анализа, до фиксации, вырезать роговицы в половине через рану. Поместите эту половину или только ¼ (либо это достаточно ткани) в стабилизации РНК защищать реагента.
    2. Используя набор стандартных изоляции, изолировать РНК и выполнить qRT-PCR.
      Примечание: Кроме того часть раненых только может быть изолированы и проверяются на экспрессии генов.
    3. Поместите другой половины роговицы в ткань патологии кассеты и погружаться в фиксатор (10% формалин) для 2-4 дней при комнатной температуре (RT).
    4. Парафин внедрить это половина раненых роговицы с использованием стандартных методов.
      Примечание: Ориент раненых роговицы для обеспечения что разрезания ткани будет производить различных слоев роговицы.
  2. Иммуноокрашивания, с помощью 3, 3'-диаминобензидин (DAB)
    1. 1 день
      1. Лейбл скользит, должным образом с помощью карандаша. Исключения из paraffinize ткани, поместив слайды в банку с очистки агента (2 изменения, 10 мин).
      2. Увлажняет ткань путем передачи слайды в этанол на снижение концентрации (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 минут для каждого изменения).
      3. Выполните поиск антигена, микроволновой печи слайды в пластиковый сосуд с буфера цитрата (10 мм, pH 6.4) за 5 мин. Первый цикл 5 минут при 50% мощности. Пополнение банка с буфера цитрата и повторить. Остыть в течение 10 мин.
      4. Вымойте 3 x с PBS, 2 мин. Разрушения тканей с 1% тритон X-100 в PBS 10 мин на RT. блок сечения с 3% нормальной козьего сыворотки (НГС) за 1 ч на RT в влажной камере.
      5. Инкубировать ткани с основного антитела (1: 100 или как поставщик предполагает) в 3% NGS на ночь при 4 ° C (300 мкл каждого слайда).
    2. День 2
      1. Промыть слайды 3 x с PBST (PBS плюс 1% анимации 20), 2 мин. Место слайды в 3% H2O2 за 10 минут, чтобы блокировать эндогенной пероксидазы. Вымойте 3 x с PBST, 2 мин. Инкубировать секции с ПХ вторичное антитело (1: 250) в 3% NGS за 1 час на RT (300 мкл каждого слайда).
      2. Вымойте слайды 3 x PBST, 2 мин. Лечить слайды с комплектом DAB. Добавить 300 мкл/слайд 3 мин мыть слайды с dH2O 2 x (быстрый провалы).
      3. Counterstain с гематоксилином для 20 s. мыть слайд с dH2O 2 x (быстрый провалы). Пятно с воронение агентом для 20 s. промыть в dH2O для 20 s. Dehydrate ткани, поместив слайды в повышение концентрации этанола (50%, 70%, 100%, 100%, все быстро провалы).
      4. Сухой слайды на бумажное полотенце под капотом на 10-20 мин.
      5. Смонтируйте слайды с помощью 1 капля монтажа СМИ, крышка с coverslip. Метка и магазина на RT.
      6. Изображения слайдов под микроскопом и количественно DAB сигнал с ImageJ7 (см. раздел 4).
  3. Иммуноокрашивания: флуоресцирования
    1. На 1 день выполните шаги, описанные в шаге 2.2.1. Выполните следующие шаги на день 2.
    2. Промыть слайды 3 x в PBST на 2 мин. Инкубировать секции с меткой Флюорофор вторичное антитело в 3% NGS (1: 200) за 1 ч на RT.
    3. Вымойте 3 x в PBST, 2 мин. Смонтируйте слайды с помощью 1 капля 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) монтажа СМИ и крышка с coverslip. Сухая на бумажном полотенце под капотом на 30 мин магазина в темноте при 4 ° C до флуоресценции изображений.
  4. Количественная оценка с использованием изображений J
    1. Скачайте версию «Фиджи» ImageJ, который включает в себя необходимые плагины для DAB, окрашивание количественной оценки.
    2. Открыть изображение в Фиджи и выберите изображение → цвета → цветовой деконволюция.
    3. Выберите «H DAB» как пятно и затем нажмите кнопку ОК. Появятся три новых изображений. Выберите изображение, которое содержит только ТЫКАТЬ пятнать.
    4. Для количественного определения стромальные окрашивание только, используйте функцию ImageJ Ластик для удаления эпителия из образа DAB.
    5. Выберите анализировать → мера (или Ctrl + M) и запишите значение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Иммуногистохимия является основным методом используются для анализа успех ex vivo раны исцеления эксперимент. Рисунок 4 изображает эпителия и передней стромы в управления ткани (рис. 4A, 4B). Шесть часов после ранения, эпителий отсутствовал (рис. 4 c, 4 D). Через шесть дней после ранения, как ожидается, эпителий regrown (Рисунок 4E, 4F). Эта ткань была immunostained для альфа гладких мышц актина (α-SMA), выражение которого характеризует миофибробласты. Существует резкое увеличение иммуноокрашивания α-SMA в стромы, как определяется колориметрические DAB субстрата. Существует также увеличение эпителиальных реактивности, что может предложить EMT переход7 (см. обсуждение). Очевидно, дезорганизацию в эпителий и стромы. Ранение эксперимент на нижней увеличения и с флуоресцентной иммуноокрашивания вместо DAB показано (рис. 4 g, 4 Ч). Маржа раны видна а также градиента активного миофибробласты от передней к задней стромы.

Хотя фиброзных маркеры выражаются на одну неделю (рис. 4), чтобы получить согласованное и надежное развитие фиброзных маркеров, был выбран точка две недели времени. На рисунке 5 показана assay с помощью одноразового применения управления или гена таргетинг siRNA проверяется для содействия регенерации исцеления. В этом случае нацеленности siRNA был для USP10, deubiquitinase. Патологических миофибробласты продемонстрировал увеличение адгезии через накопление αv интегринов в фокуса спайки21. Наши предыдущие исследования показали, что αvβ1 и αvβ5 являются важными фиброзных интегринов роговицы стромальные исцеления7. Интегринов связывают ECM вне клетки, и вместе они учитываются. Интернализированных Интегрин является убиквитинированных и направлен для деградации в Лизосома или убиквитин тег удаляется путем deubiquitinase (DUB) и Интегрин перерабатывается на поверхности клеток. Мы обнаружили, что увеличение экспрессии генов DUB (USP10) увеличил ставку убиквитин удаления от Интегрин субблоков β1 и β5 приводит к результирующей накопление αv/β1/β5, на поверхности клеток, с последующим TGFβ активации и индукции 7фиброзных маркеры. Нокдаун USP10 в роговицы органной культуре предотвратить появление фиброзных маркеры7. На рисунке 5показан пример этих результатов. Как и в случае выше, α-SMA используется в качестве маркера для миофибробласты. Еще одним показателем рубцов является фибронектин-EDA (FN-EDA), соединитель вариант FN, содержащий РСЗ, αv Интегрин привязки домена22,23,24. Это также называется сотовой FN (c-FN). Он служит ключевым фиброзных маркер с FN-EDA находится не в циркулирующей плазмы, но вместо этого только выражается и выделяется клетками при фиброзных условий25. В Рисунок 5A-5 C иммуноокрашивания для α-SMA показано. По сравнению с разматывать (Рисунок 5A), ранив плюс управления малых интерферирующих РНК (Рисунок 5B) показал резкое увеличение в выражении протеина α-SMA, тогда как дополнение USP10 siRNA7 резко сократилось выражение в стромы и эпителий. Аналогичным образом по сравнению с разматывать (рис. 5 d), ранив плюс управления малых интерферирующих РНК (Рисунок 5E) продемонстрировали резкое увеличение фибронектин EDA выражения протеина, по сравнению с обработки с siRNA USP10 (Рисунок 5F). Immunohistology для целевого белка (в данном случае, USP10) был использован для демонстрации успешной нокдаун7. Кроме того выполняя qRT-PCR может заверить knockdown гена в ткани, или также для анализа других фиброзных маркеры7. ImageJ может использоваться для количественного определения сигнал в строме только или общее (рис. 5 g). По крайней мере 3 роговицы для каждого условия испытания должны использоваться для количественного определения иммуноокрашивания для генерации статистической значимости, как мы показали здесь и ранее опубликована7. Другие белки, которые обычно использовались для фиброзных маркеры являются коллаген III выражение и увеличение Интегрин выражение1,26.

На рисунке 6это продемонстрировано использование ex vivo роговицы культуры как assay токсикологии. В этом эксперименте, либо были роговицы левого разматывать (Рисунок 6A), раненых (Рисунок 6B), или раненых и относились с 10 мкм Spautin-127, который был добавлен к средствам культуры клеток для увеличения периодов времени до промывают ( Рисунок 6 c-6F). Spautin-1 является препарат, не специально предназначенном USP1027. Из-за наш успех с USP10 siRNA Spautin лечения была протестирована на эффективность в деле предотвращения рубцов. В отличие от малых интерферирующих РНК Spautin при этом концентрации был токсичным для ткани. Увеличение времени с Spautin-1 в культуре помешали эпителизация и привели к качественной клеточной гибели, дезорганизованы матрицы и стромы вакуолей, предполагая, что Spautin-1 не способствует заживлению на концентрацию assayed. Стандартный гистологические анализы могут использоваться для количественного определения клеточной пролиферации и апоптоза.

Figure 1
Рисунок 1 : Сечение человеческого глаза с расширенное представление роговицы. Гистологически приматов и кур, существует пять различных слоев: эпителий, боуменова мембрана, стромы, Decement мембраны и эндотелий28,29. В всех других млекопитающих боуменова мембрана видна не гистологически. На микроскопическом уровне передачи электронов базальной мембраны наблюдается разделение эпителия роговицы и стромы в всех роговицы, в том числе с боуменова мембрана. Нетронутыми боуменова мембрана или базальной мембраны, отделяя эпителия от стромы является необходимым для предотвращения рубцевания у всех млекопитающих. Изображение печатается с разрешения от AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Диаграмма сотовой событий, которые приводят к роговицы рубцов. Эта диаграмма изображает основные события, которые разворачиваются в передней роговицы после ранения. (A) изображение эпителия, базальной мембраны, стромы и покоя клетки, встроенных в строме, т.е., кератиноцитах. ()B) красный треугольник изображает рану, которая может быть механической, язвы, вирус или персистирующей инфекции. (.C) после ранения, в который стрелок или базальной мембраны, нарушается, клетки вокруг раны apoptose. (D и E) приток клеток населить рану от резидентов кератиноцитах или костного мозга-производные фибробластов и переход в активированных фибробластов или непосредственно в миофибробласты. (F) эти приверженца патологических миофибробласты создать Аутокринный петля TGFβ активации и секрецию дезорганизованы фиброзных матрицы, что способствует роговицы дымка и шрам формирования. В регенеративным зарубцевавшиеся раны миофибробласты появляются но apoptosed в зарубцевавшиеся ткани6,29,30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Получение и обработка роговицы для органной культуры. (A) свиньи, глаза, полученные с крышки для защиты роговицы во время транспортировки. (B) изображение земного шара после удаления ткани. (C) изображение трепаном 6 мм. (D) Wounding Центральной роговицы с трепанации. (E) изображения монтируется роговицы после удаления из всему миру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Ткани роговицы после ранения. Иммуногистохимического анализа разматывать (управления) или ранения роговицы. Свинья роговицы были либо левый разматывать (управления) или ранены. Разделах ткани были immunostained с антителами к альфа гладких мышц актина (α-SMA) для выявления миофибробласты. (A и B) контроля, разматывать. (C и D) раненых и фиксируется на 6 ч после ранения. Эпителий — удалены (стрелка). (E и F) раненых и фиксируется на 6 дней после ранения. Строма заполненный и эпителия regrown (голова стрелка). Представитель активированные миофибробласты обозначаются звездочками (*). (G, H) Низкий масштаб изображения иммуноокрашивания α-SMA 2 недели после ранения: α-SMA (красный), DAPI (синий). Изображения были пойманы с помощью микроскопа вертикальном флуоресценции/brightfield с ПЗС-камеры. Шкалы бар = 100 мкм (A, C, E); 50 мкм (B, D, F); 200 мкм (G, H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Регенеративные исцеления агентам тестирования. Свинья роговицы были либо (A и D) разматывать (контроль), (B и E) раненых и относились с управления малых интерферирующих РНК, или (C и F) раненых и лечение с USP10 siRNA. Иммуноокрашивания (A-C) (D-F) или α-SMA фибронектин EDA. После обработки с USP10 siRNA, α-SMA был сокращен в 2,2 раза ± 0,6 *** p < 0,001 и 3.3 FN-ЭПУ ± 1,2 раза ** p < 0.01. Изображения были пойманы с помощью микроскопа вертикальном флуоресценции/brightfield с ПЗС-камеры. Шкалы бар = 50 µm. (G) роговицы стромальные окрашивание как количественно ImageJ. Статистическая значимость рассчитывалась путем односторонний дисперсионный анализ с Бонферрони в тест. Рисунок был адаптирован с разрешения Гиллеспи et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Тестирование агентов для воздействия на reepithelialization - токсикологических исследований. Иммуноокрашивания для α-SMA. Свинья роговицы были разматывать (A) и (B) получили ранения. (C-F) Роговицы были ранены и инкубировали с 10 мкм Spautin-1. Ингибитор промывают и заменены СМИ после (C) 2 дня, (D) 4 дня, (E) 6 дней, (F) 14 дней. Все средства массовой информации изменения во время инкубационного периода включали Spautin, как указано. Все роговицы были исправлены и заливали в парафин после 2 недель в культуре. Изображения были пойманы с помощью микроскопа вертикальном флуоресценции/brightfield с ПЗС-камеры. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает модель для изучения заживления ран в природных слоистых 3D-среде. Использование органной культуры в качестве посредника между клеточной культуры и в естественных условиях исследования значительно снижает затраты, а также сокращения процедуры на живых животных. Другие 3D модели большую пользу на местах, включая самостоятельно синтезировать коллагеновые гели из первичных роговицы фибробластов2 или эти же клетки внедряются в гели, сделанные из животных, полученных коллагены31. Система модель культуры органов особенно полезен для тестирования предполагаемым исцеления агентов, так как рана локализован и таким образом нет четкой разницы между раненых и не ранен ткани в том же роговицы (рис. 4). Кроме того механические трепаном рану обеспечивает прямой доступ к стромы, которая отлично подходит для отправления малые интерферирующие РНК в рану (рис. 5). Хотя он здесь не показан, вирусный трансдукции в ткани роговицы в органной культуры был также продемонстрировали32,,3334. Еще одна перестановка этот assay будет заразить роговицы с конструкцией репортер интерес и имидж экспрессии генов в режиме реального времени после ранения. С точки зрения перевода в vivo исследований эта же процедура может быть выполнена в кроликов35 и таким образом органной культуры человека, свиньи, или кролик роговицы можно сравнить с результатами в естественных условиях. По нашему опыту данные, которые мы получили с siRNA лечения с использованием модели культуры орган перевели на аналогичные выводы в vivo (неопубликованные данные). Поскольку орган культуры роговицы не хватает функциональной послабляющие сосудистую, слезы и водянистой, каждый следователь должен оценить, если это будет полезной моделью для их исследования. Была продемонстрирована резидентов активации иммунных клеток, но точную параллель в vivo исследований еще не ясно,1.

Ключевым шагом в протоколе не должна проникать роговицы, ранив слишком глубоко. Это будет очевидным, как в этом случае будет вытекать жидкость передней камеры. Если это происходит, шара должен быть уничтожен. Производить даже механические раны, сцепление губы разграниченные тканей в области trephined с forcep, а затем переместите хирургическое лезвие параллельно поверхности роговицы, чтобы срезать ткани в границах трепаном раны. Поверхности роговицы не должна высыхать таким образом, мы рекомендуем после раны и вырезания роговицы от шара, место роговицы лицом вниз в PBS, пока смесь агар при правильной температуре. Убедившись, что агар не слишком жарко будет избежать повреждения эндотелия.

Ограничение этой модели заключается в том, что использование трепаном производить раны является неравномерным и не могут быть воспроизведены одинаково роговицы роговицы по сравнению с лазерно индуцированным раны36. Однако естественно происходя раны не эквивалентны все в глубине и большой объем данных показывают, что любое нарушение в базальной мембраны создает Миофибробласт развития и туманы в стромы, тогда как регенерации базальной мембраны приводит к уменьшилась рубцов37,,3839. Эта модель культуры свинья роговицы орган использует тяжелые раны, в котором базальной мембраны удаляются в пределах области трепанации. Разработка миофибробласты и фиброзных маркеров в строме роговицы были последовательно и воспроизводимость достигается с помощью этой модели системы. Некоторые эпителиальных пятнать обычно проявляется, темнеет в эпителии раненых и отросшими. Это было продемонстрировано в другие культуры роговицы органа докладов40 , но отсутствует в большинстве роговицу от мыши в естественных условиях и кролик исследования41,42. Однако исследования, проведенного в в естественных условиях собак модели продемонстрировали сильные эпителиальных α-SMA окрашивание эпителия после ранения43. Малых интерферирующих РНК, что способствует регенерации исцеление в наших исследованиях также значительно сократить этот эпителиальных иммуноокрашивания, предполагая, что эпителий может проводиться EMT (фиброзных рубцов) когда он отрастает в органной культуры. Кроме того бездействие основное антитело пятная протоколе ранения роговицы привело к полное отсутствие пятнать7 , предполагая, что иммуноокрашивания является конкретным. Замороженные разделы (не показан) были похожи на парафин разделы в этом отношении. Однако потому что небольшое, но переменная фон, окрашивание эпителия, наша лаборатория только количественно стромальные окрашивание, которая, как представляется, не фон гистологические вопросов7.

Если ранения человека роговицы, получение роговицы не используется для трансплантации вместо полный глобус может быть более экономически эффективным40. В этом случае будет ранения роговицы без помощи давления, обеспечиваемой земного шара. Дополнительные ранив стратегии могут включать в себя ожоги роговицы, которые широко использовались в естественных условиях производить шрам42.

Таким образом преимущества этой системы для 3D ткани ранозаживляющее пробирного является его воспроизводимости и экономии с потребностями только стандартное оборудование, что делает его отличным ресурсом для наблюдения и количественной оценки воздействия агентов на заживления тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH-неи R01 EY024942, исследования, чтобы предотвратить слепоту, Upstate медицинского университета неограниченный исследовательских фондов, и львы район 20-ю. микроскопия и анализ изображений парафиновых срезах были исполнены на ЯДРЕ микроскопии и Гистологические слайд подготовка была исполнена на Biorepository и основной патологии в школе медицины Icahn на горе Синай.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

Медицина выпуск 144 роговицы рубцы фиброз Миофибробласт Ex vivo органной культуры
Ex Vivo роговицы орган культуры модель для заживления ран исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro, N., Gillespie, S. R.,… More

Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter