Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Abstract

Het hoornvlies is gebruikt uitgebreid als een modelsysteem om te studeren wondgenezing. De mogelijkheid om te produceren en gebruiken van primaire cellen van zoogdieren in twee dimensionale (2D) en drie dimensionale (3D) cultuur heeft geleid tot een schat aan informatie niet alleen over hoornvlies biologie, maar ook over de wond genezing, myofibroblast biologie, en littekens in het algemeen . Het doel van het protocol is een assay-systeem voor het kwantificeren van de ontwikkeling van de myofibroblast, die kenmerkend is voor littekens. We tonen een hoornvlies orgel cultuur ex vivo model met behulp van varken ogen. In deze voorste keratectomy wond, zijn cornea's nog steeds in de hele wereld gewond met een cirkelvormige mes genaamd een trephine. Een stekker van ongeveer 1/3 van het anterieure hoornvlies wordt verwijderd met inbegrip van het epitheel, de kelder-membraan en het voorste deel van het stroma. Na verwonding, hoornvlies gesneden uit de hele wereld, gemonteerd op basis van de collageen/agar en gekweekte voor twee weken in de gratis medium aangevuld-serum met gestabiliseerde vitamine C uitbreiden van celproliferatie en afscheiding van de extracellulaire matrix door fibroblasten resident. Activering van myofibroblasts in het anterieure stroma is duidelijk in het hoornvlies genezen. Dit model kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van wond sluiting, de ontwikkeling van myofibroblasts en fibrotische markeringen, en toxicologische studies. Daarnaast kunnen de effecten van klein molecuul remmers evenals lipide-gemedieerde siRNA transfectie voor gene knockdown worden getest in dit systeem.

Introduction

Littekens in het hoornvlies als gevolg van letsel, trauma of infectie kan leiden tot slopende opaciteit en permanente visie verlies. Er is dus dringend behoefte om te identificeren van de trajecten die voor therapeutische interventie kunnen worden gericht. Huidige behandelingsopties zijn beperkt en bestaat voornamelijk uit het hoornvlies transplantaties, die niet toegankelijk voor patiënten over de hele wereld zijn. Zowel de mens (Figuur 1) en de dierlijke hoornvlies kunnen worden gebruikt voor 2D en 3D-celkweek studies1,2. Menselijke cadaver hoornvlies niet geschikt is voor transplantatie kunnen worden verkregen van eye banken of gecentraliseerd weefselbanken (nationale ziekte onderzoek Interchange (NDRI)), en dierlijke ogen kunnen worden verkregen in een abattoir. Primaire hoornvlies epitheliale cellen, stromale fibroblasten en meer recentelijk, endotheliale cellen, kunnen worden geïsoleerd en gekweekt uit deze weefsels voor wondgenezing en toxicologische studies3,4,5. Naast het belang van inzicht in de moleculaire basis van verblindende oogziekte, heeft de toegankelijkheid van weefsel en de mogelijkheid om cultuur primaire cellen gemaakt het hoornvlies een belangrijk model-systeem voor studie. Het hoornvlies is ideaal voor het testen van de effecten van agenten op littekens als het normale hoornvlies transparant is en bepaalde soorten wonden maken opaciteit of fibrotische littekens (herzien in6). Verschillende in vivo hoornvlies wond genezing modellen hebben ook uitgebreid gebruikt voor studies1littekens. Minder gebruikt is geweest de ex vivo hoornvlies wond genezing model7,8 die in detail hier is beschrijven. Het doel van deze methode is te kwantificeren littekens resultaten gekenmerkt door fibrotische beleidsmakers in een 3D meercellige hoornvlies ex vivo modelsysteem.

Hoornvlies epitheliale verwonding die geen inbreuk op de epitheliale kelder membraan normaal vormt sluit binnen 24-72 h9. Kort na de verwonding beginnen de cellen aan de rand van het epithelium verspreiden en migreren naar de epitheliale vrije oppervlakte, te herstellen van epitheliale barrièrefunctie. Deze activiteit wordt opeenvolgend gevolgd door activering van hoornvlies basale celproliferatie, ten eerste en in een later stadium, van voorlopercellen attractiepark van de buitenste limbal zone tot herstel van de epitheliale cellen massa10,11. Deze wonden genezen vaak zonder littekens. Een wond die het membraan van de kelder in het stroma vaak doordringt resulteert echter in litteken vorming1. Na het hoornvlies stromale verwonden, is het stroma gevuld met cellen van verschillende oorsprong, met inbegrip van gedifferentieerde resident stromale cellen, alsmede het beenmerg-afgeleide fibrocytes12,13,14. Fibrotische littekens wordt gekenmerkt door de persistentie van myofibroblasts in een genezende wond. Deze pathologische myofibroblasts tonen verhoogde hechting door de accumulatie van verschijnsel in focal verklevingen, contractiele α-smooth actine (α-SMA) stress spiervezels en lokaal activeren van extracellulaire matrix (ECM)-afgezonderd latente-transformeren groeifactor-beta (TGFβ). De differentiatie van epitheliale-afgeleide cellen, bekend als epitheliale mesenchymale overgang (EMT), kan ook bijdragen tot litteken vorming6.

Er is een delicaat evenwicht tussen celdifferentiatie en apoptosis na verwonding. Wegens de breuk in het membraan van de kelder, groeifactoren zoals bloedplaatjes afkomstige groei factor (PDGF) en TGFβ van tranen en het epithelium baden de stroma, inducerende myofibroblast differentiatie, een lus van de duurzame autocrine van TGFβ de activering, en de secretie van ongeorganiseerd fibrotische ECM15,16. De persistentie van de myofibroblasts in de genezen wond bevordert haze en littekens in het hoornvlies (Figuur 2). Echter, in regeneratively genezen wond hoewel myofibroblasts ontwikkelen, ze neutrophil en aldus zijn afwezig of aanzienlijk verminderd in aantal in het genezen weefsel (herzien in verwijzing6,10). Zo heeft onderzoek focuste fibrotische littekens op zijn minst gedeeltelijk zich op gericht op moleculen die voorkomen buitensporige myofibroblast ontwikkeling of myofibroblast persistentie17,18 dat. Omdat myofibroblast persistentie zowel littekens en fibrotische ziekte in alle weefsels19 kenmerkt, kan het hoornvlies zinvol zijn als een modelsysteem om te studeren van algemene cellulaire mechanismen van fibrose.

In ons modelsysteem, wordt het hoornvlies verwond met een cilindrische mes genaamd een trephine terwijl nog steeds in de hele wereld. Mens en varken hoornvlies kunnen worden verwond met beide een 6 of 7 mm trephine; voor konijn hoornvlies heeft een 6 mm trephine de voorkeur. Het varken hoornvlies is gelijkaardig in grootte aan het menselijke hoornvlies. Omdat ze kosteneffectief en beschikbaar in grote aantallen zijn, worden varken hoornvlies routinematig gebruikt voor orgel cultuur. Bovendien hebben antilichamen en siRNAs gemaakt om te reageren met mens consequent cross-reacted met varken7. Na de verwonding, hoornvlies worden gesneden uit de hele wereld met de limbus intact en gemonteerd op een agar/collageen basis. Het hoornvlies zijn gekweekt in serumvrij media plus gestabiliseerde vitamine C ter simulering van de fibroblast proliferatie en ECM afzetting20. De toevoeging van serum noch groeifactoren zijn nodig voor het opwekken van de myofibroblast formatie7. Hoornvlies worden routinematig vast en verwerkt voor histologie na twee weken van cultuur. Voor gen knockdown of voor het testen van de effecten van een agent op de wondgenezing, de wond kan worden behandeld met siRNA in de wond na verwonding7 of een oplosbare agent kan worden toegevoegd aan de media, respectievelijk8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. orgel cultuur

  1. Voorbereidingen
    1. Bereid agar-oplossing als volgt. In een kleine kolf, bereiden 1% agar en 1 mg/mL boviene collageen in DMEM-F12 tot 20 mL. Breng aan de kook op een verwarmingsplaat. Zet de oplossing in een conische buis van 50 mL. Plaats de buis in een waterbad op een hete plaat om te voorkomen dat de oplossing stollen.
    2. Bereiden aangevuld serumvrij media (SSFM) volgens de samenstelling die in de Tabel van materialen.
      Opmerking: De benodigde hoeveelheid SSFM voorbereid te zijn, is afhankelijk van het aantal hoornvlies te verwerken. Meestal is 30 mL voldoende media voor 4 hoornvlies.
  2. Dissectie
    Opmerking: Voer deze stap in een dissectie kap of een chemische kap. De ogen worden geleverd met deksels nog vastzit in individuele zakken om te beschermen de globes.
    1. Verwijder globes van deksels met een straight-edge chirurgische mes op een snijplank ethanol-gereinigd. Verwijder overtollige vetweefsel van het oog met een mes of een kleine schaar (figuur 3A, 3B).
    2. Na het verwijderen van de hele wereld van de deksel, houden van de hele wereld posteriorly met een tang en onmiddellijk Dompel het oog in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Snel duik het 3 x in de 10% jodium (in een bekerglas van 100 mL). Duik snel 2 x in PBS (~ 100 mL in een bekerglas van verandering PBS vaak).
    3. Met behulp van een schone handdoek of een tissue, wikkel het oog omtrek met genoeg druk om te hebben een strak hoornvlies oppervlak te snijden met de trephine.
      Nota: zorg om te voorkomen dat de handdoek of weefsel contact opnemen met het hoornvlies.
  3. Verwonding
    1. Gebruik een 6 mm trephine om de wond van het midden van het hoornvlies. Doordringen het epitheel en anterieure stroma zonder het maken van een full-dikte wond door middel van het hele hoornvlies.
      Opmerking: Als het endotheel is doorgedrongen, zal een verlies van druk en lekkende vloeistof blijken. In dit geval moet het oog worden weggegooid.
    2. Plaats de trephine in het midden van het hoornvlies, draait 180° rechtsom en linksom 5 x (telkens de richting is veranderd het zal tellen één keer) tijdens het toepassen van lichte druk aan het verdiepen van de wond.
      Opmerking: Nu moet de wond diep genoeg om een flap van weefsel worden opgeheven met behulp van een paar pincet. Als dit niet het geval is Herhaal stap 1.3.2.
    3. Til de klep van de randen. Op hetzelfde moment, met de andere hand, hetzij met een tweede persoon, gebruik een mes, snijden parallel aan de hele wereld om te knippen het weefsel zoals de verlostang blijven til van het anterieure hoornvlies binnen de marge van de wond. Aan het einde van deze stap moet er een cirkelvormige wond, gelegen in het centrum van het hoornvlies (Zie Figuur 3 C, 3D).
  4. Snijden en het hoornvlies te verwijderen uit de hele wereld
    1. Houd het oog met het weefsel en maken een kleine snede 1 mm vanaf de rand van het hoornvlies, met een mes zodat de limbus is opgenomen in de cultuur van het orgel.
    2. Met kleine, scherpe schaar toegang krijgen tot de incisie gemaakt in de voorgaande stap te snijden rond de bol, de marge van een millimeter in het hoornvlies te houden de limbus intact te houden.
    3. Leg het hoornvlies in een schotel van 60 mm met 1 mL PBS, wond kant naar beneden tot montage.
  5. Montage
    1. Zorg ervoor dat de agar is gekomen om een warme temperatuur (ongeveer 25 ° C).
    2. Met twee paar pincet, maken een kopje door het ingedrukt houden van twee zijden van het hoornvlies met de endothelial kant omhoog. Voeg de opgewarmde agar-oplossing in het hoornvlies met behulp van een steriele overdracht precisiepipet totdat deze vol is.
    3. Nadat de agar verhardt (meestal ongeveer 30-45 s) zorgvuldig het spiegelen van het hoornvlies met de agar in 60 mm plaat (de 3E figuur). Bedek met een deksel.
  6. Incubatie
    1. 4 mL SSFM toevoegen aan de plaat, behoud van hoornvlies bij een lucht-vloeistof-interface aan de limbal grens in 5% CO2 bij 37 ° C. Refresh media na 24 uur en daarna om de andere dag.
      Opmerking: Als het uitvoeren van een transfectie in de wond, weglaten de antibiotica tot na de transfectie.
    2. Natte het hoornvlies oppervlak eenmaal daags door 1 druppel SSFM toe te voegen van de geconditioneerde media in de schotel te houden van vocht. Hiervoor nemen de schotel uit de incubator, plaats deze onder de motorkap en verwijder het deksel van de schotel, nat van het oppervlak met media van schotel met behulp van een precisiepipet steriele, dekking weer en zet het terug in de incubator.
    3. Voor gen knockdown, behandeling van de wond met gentargeting of besturen van siRNA thats complexvorm aan een lipide-gemedieerde vervoerder volgens instructies van de leverancier (zie hieronder).
    4. Meng 5 µL (50 pmol) van siRNA in 50 µL van verminderd-serum minimale essentiële media (bv., Opti-MEM). Meng 2 µL van transfectiereagens in 50 µL van verminderd-serum media. Laat deze zitten voor 5 minuten en dan meng ze.
    5. Voeg 200 µL van verminderd-serum minimale media aan het reagens/siRNA mengsel.
    6. Pipetteer ontkleuring op de wond en incubeer gedurende 3 uur.
    7. Wassen van siRNA van hoornvlies oppervlak met media in de schotel. Wijzig de incubatie media SSFM + antibiotica (Zie de Tabel van de materialen). Blijven incubatie zoals eerder vermeld (stappen 1.6.1-1.6.2).

2. Histologie: Paraffine secties en immunokleuring

  1. Voorbereiding van het weefsel
    1. Na een twee weken durende incubatie, als met behulp van enkele van het weefsel voor kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie (qRT-PCR) analyse, vóór de vaststelling van, het hoornvlies gesneden in de helft via de wond. Plaats deze helft of enige ¼ (ofwel is genoeg weefsel) in het stabiliseren van de RNA-beschermen reagens.
    2. Met behulp van een standaard isolatie kit, isoleren van RNA en qRT-PCR uit te voeren.
      Opmerking: U kunt ook kan het gewonde deel alleen worden geïsoleerd en getest op genexpressie.
    3. Plaats de andere helft van het hoornvlies in weefsel pathologie cassettes en onderdompelen in fixeer (10% formaline) voor 2-4 dagen bij kamertemperatuur (RT).
    4. Paraffine insluiten deze de helft van de gewonde hoornvlies met standaardtechnieken.
      Opmerking: Oriënteren de gewonde hoornvlies om ervoor te zorgen dat het weefsel afdelen een dwarsdoorsnede van het hoornvlies produceren zal.
  2. Immunokleuring met behulp van 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
    1. Dag 1
      1. Label dia's goed met behulp van een potlood. -Paraffinize het weefsel door het plaatsen van dia's in een pot met de clearing agent (2 wijzigingen, elke 10 min).
      2. Hydrateren het weefsel door de overdracht van de dia's in ethanol (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 min voor elke wijziging) PM10.
      3. Herwinning van het antigeen door de dia's in een plastic pot met citraat buffer (10 mM, pH 6.4) gedurende 5 minuten magnetron uitvoeren Eerste cyclus 5 min op 50% kracht. Vullen van de pot met citraat buffer en herhaal. Afkoelen gedurende 10 minuten.
      4. Wassen 3 x met PBS, elke 2 min. Permeabilize weefsel met 1% Triton X-100 in PBS 10 min op RT. blok met 3% normale geit serum (NGS) gedurende 1 uur bij RT in vochtige kamer afdelingen.
      5. Incubeer weefsel met primair antilichaam (1:100 of zoals de leverancier al doet vermoeden) in 3% NGS overnacht bij 4 ° C (300 µL per dia).
    2. Dag 2
      1. Spoelen dia's 3 x met PBST (PBS, vermeerderd met 1% Tween 20), elke 2 min. Dia's in 3% H2O2 voor 10 min voor het blokkeren van endogene peroxidase plaatsen. Wassen 3 x met PBST, elke 2 min. Incubeer secties met HRP secundair antilichaam (1:250) in 3% NGS gedurende 1 uur bij RT (300 µL per dia).
      2. Wassen van dia 3 x PBST, elke 2 min. Behandelen van dia's met de DAB-kit. Toevoegen van 300 µL/dia 3 min. Wash dia's met dH2O 2 x (snel dips).
      3. Counterstain met haematoxyline voor 20 s. Wash de dia met de dH2O 2 x (snel dips). Vlek met blauwsel agent voor 20 s. spoeling in dH2O voor 20 s. Dehydrate weefsel door het plaatsen van dia's in de toenemende concentraties van ethanol (50%, 70%, 100%, 100%, alle snelle dips).
      4. Droge dia's op een papieren handdoek onder de motorkap voor 10-20 min.
      5. Mount dia's met behulp van 1 druppel montage media, cover met een dekglaasje aan. Label en winkel op RT.
      6. Beeld van de dia's onder een microscoop en kwantificeren van DAB signaal met ImageJ7 (zie punt 4).
  3. Immunokleuring: fluorescentie
    1. Voer de stappen uit die zijn beschreven in stap 2.2.1 op dag 1 . Voer de volgende stappen uit op dag 2.
    2. Spoelen dia's 3 x in PBST voor elke 2 min. Incubeer secties met fluorophore-gelabeld secundair antilichaam in 3% NGS (1:200) voor 1 h op RT.
    3. 3 x wassen in PBST, elke 2 min. Mount dia's 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) montage media en dekking 1 druppel met een dekglaasje aan. Droog op papier handdoek onder de motorkap voor 30 min. Store in het donker bij 4 ° C tot fluorescentie imaging.
  4. Kwantificering met behulp van Image J
    1. Download de versie van "Fiji" voor ImageJ, waarin de nodige plugins voor DAB kleuring kwantificering.
    2. Een afbeelding openen in Fiji en selecteer beeld → → Color kleur deconvolutie.
    3. Selecteer "H schar" als de vlek en klik vervolgens op OK. Drie nieuwe beelden wordt weergegeven. Selecteer de afbeelding die alleen DAB kleuring bevat.
    4. Om te kwantificeren stromale alleen kleuring, de functie ImageJ gum het epitheel van de DAB-afbeelding verwijderen.
    5. Selecteer analyseren → maatregel (of Ctrl + M) en de waarde opnemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunohistochemistry is de primaire assay gebruikt voor het analyseren van het succes van de ex vivo wond genezing experiment. Figuur 4 toont de epitheel en anterieure stroma in controle weefsel (figuur 4A, 4B). Zes uur na de verwonding, was het epithelium afwezig (figuur 4C, 4 D). Zes dagen na de verwonding, zoals verwacht, had het epithelium regrown (figuur 4E, 4F). Dit weefsel was immunostained voor alpha-gladde spier actine (α-SMA), de uitdrukking van die kenmerkend myofibroblasts. Er is een dramatische toename van de α-SMA immunokleuring in het stroma opgespoord door colorimetrische DAB substraat. Er was ook een toename van de epitheliale reactiviteit die kan wijzen EMT overgang7 (Zie de bespreking). Desorganisatie in het epitheel en stroma bleek. Een verwonding experiment bij lagere vergroting en met fluorescerende immunokleuring in plaats van DAB is (Figuur 4 g, 4 H) komt te staan. De marge van de wond is zichtbaar en een helling van actieve myofibroblasts vanuit de anterior naar posterior stroma.

Hoewel fibrotische markeringen worden uitgedrukt door één week (Figuur 4), met het oog op een consistente en betrouwbare ontwikkeling van fibrotische markers, werd een twee weken durende tijdstip gekozen. In Figuur 5 wordt een bepaling met behulp van een eenmalige toepassing van controle of gentargeting siRNA worden getest voor de bevordering van regeneratieve genezing aangetoond. In dit geval was de targeting siRNA voor USP10, een deubiquitinase. Pathologische myofibroblasts aangetoond hogere hechting door de accumulatie van αv-verschijnsel in focal verklevingen21. Onze eerdere studies is gebleken dat αvβ1 en αvβ5 belangrijke fibrotische verschijnsel in hoornvlies stromale helende7. Integrins binden ECM buiten de cel en samen zijn ze geïnternaliseerd. De verinnerlijkte integrine is ubiquitinated en verzonden voor afbraak in het lysosoom of het ubiquitin-label is verwijderd door een deubiquitinase (DUB) en het integrine wordt gerecycleerd aan het celoppervlak. We hebben ontdekt dat een toename van de genexpressie van de DUB (USP10) steeg het aantal ubiquitin verwijdering uit het integrine subeenheden β1 en β5 leiden tot een resulterende opeenstapeling van αv/β1/β5, op het celoppervlak, met latere TGFβ activering en inductie van fibrotische markeringen7. Knockdown van USP10 in hoornvlies orgel cultuur voorkomen het uiterlijk van fibrotische markeringen7. Een voorbeeld van deze resultaten is afgebeeld in Figuur 5. Als wordt boven, α-SMA gebruikt als een marker voor myofibroblasts. Een andere indicator van de littekens is fibronectine-EDA (FN-EDA), een splice variant van FN waarin een RGD, αv integrine bindend domein22,23,24. Het heet ook cellulaire FN (c-FN). Het dient als een belangrijke fibrotische marker aangezien FN-EDA niet in plasma circuleren maar in plaats daarvan is alleen uitgedrukt en door cellen onder fibrotische voorwaarden25 uitgescheiden. In figuur 5A- wordt5 C immunokleuring voor α-SMA weergegeven. Vergeleken met gewonde (figuur 5A), verwonding plus controle siRNA (figuur 5B) toonde een dramatische toename in α-SMA eiwit expressie, overwegende dat de toevoeging van USP10 siRNA7 drastisch verminderd expressie in het stroma en epitheel. Op dezelfde manier vergeleken met gewonde (figuur 5D), verwonding plus controle siRNA (figuur 5E) aangetoond een dramatische toename van de fibronectine-EDA eiwituitdrukking in vergelijking met de behandeling met USP10 siRNA (figuur 5F). Immunohistology voor de proteïne van de doelgroep (in dit geval USP10) werd gebruikt om aan te tonen van succesvolle vechtpartij7. Bovendien kan uitvoeren qRT-PCR verzekeren gene knockdown in het weefsel of ook assay voor andere fibrotische markeringen7. ImageJ kan worden gebruikt om te kwantificeren signaal in het stroma alleen of totale signaal (Figuur 5 g). Ten minste 3 hoornvlies voor elke voorwaarde wordt getest moeten worden gebruikt voor het kwantificeren van immunokleuring voor het genereren van statistische significantie, zoals we hebben hier aangetoond en eerder gepubliceerd7. Andere eiwitten die routinematig voor fibrotische markeringen gebruikt hebben zijn collageen III expressie en een toename van integrine expressie1,26.

In Figuur 6blijkt het gebruik van ex vivo hoornvlies cultuur als een test van de toxicologie. In dit experiment, hoornvlies waren ofwel links gewonde (figuur 6A), gewond (figuur 6B), of gewond en behandeld met 10 µM Spautin-127, die werd toegevoegd aan de cel voedingsbodems voor het verhogen van de perioden vóór het wassen uit ( Figuur 6 c-6F). Spautin-1 is een drug die zich richt op niet-specifiek USP1027. Vanwege ons succes met USP10 siRNA, werd Spautin behandeling getest op effectiviteit bij het voorkomen van littekens. In tegenstelling tot de siRNA was de Spautin op deze concentratie giftig voor het weefsel. Steeds meer met Spautin-1 in cultuur opnieuw epithelialization voorkomen en resulteerde in kwalitatieve celdood, ongeorganiseerd matrix en stromale vacuolen die suggereren dat Spautin-1 doet niet genezing te bevorderen in de concentratie bepaald. Standaard histologische testen kunnen worden gebruikt om te kwantificeren celproliferatie of apoptosis.

Figure 1
Figuur 1 : Dwarsdoorsnede van een menselijk oog met een uitgebreide weergave van de cornea. Histologisch in primaten en kippen, zijn er vijf verschillende lagen: epitheel, Bowman membraan, stroma, Decement het membraan en endotheel28,29. In alle andere zoogdieren is membraan van Bowman niet zichtbaar histologisch. De transmissie elektronen microscopische niveau, wordt een kelder membraan waargenomen scheiding van de cornea epitheel en stroma in alle hoornvlies met inbegrip van die met een Bowman membraan. Een intact Bowman membraan of kelder membraan scheiden van het epitheel van het stroma is een noodzakelijke om littekens in alle zoogdieren te voorkomen. Afbeelding herdrukt met toestemming van AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Diagram van de cellulaire gebeurtenissen die tot littekenvorming van de cornea leiden. Dit diagram toont de elementaire gebeurtenissen die in de voorste hoornvlies na verwonding ontvouwen. (A) afbeelding van de epitheel, kelder membraan, stroma en de zwakke cellen ingebed in de stroma, dat wil zeggen, keratocytes. ()B) de rode driehoek toont een wond, die mechanische worden kan, een maagzweer, virus of hardnekkige infectie. (C) na verwonding, in die van de Boogschutter of kelder membraan wordt geschonden, de cellen rond de wond neutrophil. (D en E) een toestroom van cellen repopulate de wond van ingezetene keratocytes of beenmerg-afgeleide fibroblasten en overgang in geactiveerde fibroblasten of rechtstreeks in de myofibroblasts. (F) deze aanhanger pathologische myofibroblasts Maak een lus van de autocrine van de TGFβ activering en secretie van ongeorganiseerd fibrotische matrix die hoornvlies haze en litteken vorming bevordert. In een regeneratively genezen wond, myofibroblasts verschijnen maar hebben apoptosed in de genezen weefsel6,29,30. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Ontvangen en verwerken van hoornvlies voor orgel cultuur. (A) varken ogen worden ontvangen met deksels aan het hoornvlies te beschermen tijdens het transport. (B) beeld van de wereld nadat weefsel is verwijderd. (C) afbeelding van een 6 mm trephine. (D) Wounding van het centrale hoornvlies met een trephine. (E) afbeelding van de gekoppelde hoornvlies na verwijdering uit de hele wereld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Hoornvlies weefsel na verwonding. Immunohistological analyse van gewonde (control) of gewonde hoornvlies. Varken hoornvlies waren ofwel links gewonde (control) of verwond. Weefselsecties waren immunostained met antilichaam aan alpha-gladde spier actine (α-SMA) te identificeren myofibroblasts. (A en B) controle, gewonde. (C en D) Wounded en vastgesteld op 6 h na verwonding. Epitheel is verwijderd (pijl). (E en F) Wounded en vastgesteld op 6 dagen na verwonding. Stroma heeft ingevuld en het epithelium heeft regrown (pijl hoofd). Representatieve geactiveerde myofibroblasts worden aangeduid met een sterretje (*). (G, H) Lage vergroting beelden van immunokleuring van de α-SMA 2 weken na verwonding: α-SMA (rood), DAPI (blauw). Beelden werden gemaakt met behulp van een rechtop fluorescentie/helderveld Microscoop met een CCD-camera. Schaal bar = 100 µm (A, C, E); 50 µm (B, D, F); 200 µm (G, H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Regeneratieve helende agenten testen. Varken hoornvlies waren ofwel (A en D) gewonde (control), (B en E) gewond en behandeld met controle siRNA, of (C en F) gewond en behandeld met USP10 siRNA. Immunokleuring voor (A-C) α-SMA of (D-F) fibronectine-EDA. Na behandeling met USP10 siRNA, α-SMA werd verminderd met 2.2 ± 0,6 vouwen *** p < 0.001 en FN-EDA 3.3 ± 1,2 fold ** p < 0,01. Beelden werden gemaakt met behulp van een rechtop fluorescentie/helderveld Microscoop met een CCD-camera. Schaal bar = 50 µm. (G) hoornvlies stromale kleuring zoals gekwantificeerd door ImageJ. Statistische significantie werd berekend door one-way ANOVA met Bonferroni van test. Figuur is aangepast met toestemming van Gillespie et al.7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Testen van agenten voor effecten op de reepithelialization - toxicologische studies. Immunokleuring voor α-SMA. Varken hoornvlies waren gewonde (A) en (B) gewond. (C-F) Hoornvlies waren gewond en geïncubeerd met 10 µM Spautin-1. De Inhibitor van de omwenteling werd weggespoeld en vervangen door media na (C) 2 dagen, (D) 4 dagen, (E) 6 dagen, (F) 14 dagen. Alle wijzigingen van de media tijdens de incubatieperiode opgenomen Spautin zoals aangegeven. Alle hoornvlies werden vastgesteld en ingebed in paraffine na 2 weken in cultuur. Beelden werden gemaakt met behulp van een rechtop fluorescentie/helderveld Microscoop met een CCD-camera. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een model voor het bestuderen van de wondgenezing in een natuurlijke gestratificeerd 3D-omgeving. Gebruik van orgel cultuur als een intermediair tussen de celcultuur en in vivo onderzoek reduceert kosten alsmede vermindering procedures op levende dieren. Andere 3D-modellen hebben van groot nut zijn voor het veld inclusief zelf de synthese van collageen gels gemaakt van primaire menselijke hoornvlies fibroblasten2 of deze dezelfde cellen ingebed in gels gemaakt van dierlijke collagens31. Het orgel cultuur modelsysteem is met name handig voor het testen van vermeende helende agenten omdat de wond is gelokaliseerd en er dus een duidelijke marge tussen gewonden en niet-gewonde weefsel in het dezelfde hoornvlies (Figuur 4 is). Bovendien, biedt een mechanische trephine wond directe toegang tot de stroma, dat is uitstekend geschikt voor beheer van siRNAs in de wond (Figuur 5). Hoewel het is niet hier getoond, is virale signaaltransductie in hoornvlies weefsel in orgel cultuur ook aangetoond dat32,33,34. Een ander permutatie van deze test zou zijn om het infecteren van hoornvlies met een verslaggever constructie van belang en beeld genexpressie in real-time na verwonding. Op het gebied van vertaling naar in vivo onderzoek, deze zelfde procedure kan worden bereikt in konijnen35 en aldus orgel cultuur op mens, varken, of konijn hoornvlies kunnen worden vergeleken met de resultaten van in vivo. In onze ervaring, zijn de gegevens die we verkregen met behulp van het orgel cultuur model met siRNA behandeling vertaald in soortgelijke bevindingen in vivo (niet-gepubliceerde gegevens). Aangezien het orgel cultuur hoornvlies een functionele limbal therapieën, tranen en aqueous humor ontbreken, moet elke onderzoeker beoordelen of dit zal een nuttig model voor hun studies. Resident activering van immuuncellen is aangetoond, maar de exacte parallel aan in vivo onderzoek is nog niet duidelijk1.

Een belangrijke stap in het protocol is niet te doordringen van het hoornvlies door verwonding te diep. Dit zal duidelijk worden als de voorste kamer vloeistof in dit geval zal lekken. Als dit gebeurt, moet de hele wereld worden weggegooid. Voor de productie van een zelfs mechanische wond, greep de lip van het afgebakende weefsel binnen de doorboorde gebied met een forcep en verplaats vervolgens de chirurgische blade parallel aan het hoornvlies oppervlak om het weefsel weggesneden binnen de grenzen van de wond trephine. Het hoornvlies oppervlak moet niet uitdrogen waardoor we aanbevelen die na het maken van de wond en het uitsnijden van het hoornvlies uit de hele wereld, het hoornvlies bedrukte zijde naar beneden in PBS plaatsen totdat het mengsel agar is op de juiste temperatuur. Om ervoor te zorgen dat de agar niet te warm is zal endothelial schade voorkomen.

Een beperking van dit model is dat het gebruik van een trephine tot een wond ongelijk is en kan niet worden gereproduceerd identiek van hoornvlies te hoornvlies ten opzichte van laser-geïnduceerde wonden36. Echter natuurlijk voorkomende wonden zijn niet allen equivalent in diepte en een grote hoeveelheid gegevens suggereren dat enige inbreuk in het membraan van de kelder myofibroblast ontwikkeling en haze genereert in het stroma, overwegende dat regeneratie van het membraan kelder leidt tot littekens37,38,39afgenomen. Dit varken hoornvlies orgel cultuur model maakt gebruik van een ernstige wond waarbij de kelder membraan binnen het gebied van de trephine is verwijderd. Ontwikkeling van myofibroblasts en fibrotische markers in het hoornvlies stroma consequent geweest en reproduceerbaarheid bereikt met behulp van dit modelsysteem. Sommige epitheliale kleuring is meestal duidelijk dat donkerder in het epithelium gewonden en regrown. Dit is aangetoond in andere hoornvlies orgel Cultuur verslagen40 maar is afwezig in de meeste hoornvliezen van in vivo muis en konijn4241,studies. Een studie uitgevoerd in een in vivo canine model blijkt echter sterke epitheliale α-SMA vlekken in het epithelium na verwonding43. SiRNA die gepromoveerd regeneratieve genezing in onze studies ook aanzienlijk verminderd dit epitheliale immunokleuring, suggereren dat het epithelium EMT (fibrotische littekens) kan ondergaan wanneer het verrot in orgel cultuur. Daarnaast resulteerde weglating van een primair antilichaam in het protocol van de kleuring van een gewonde hoornvlies in de totale afwezigheid van7 suggereert dat de immunokleuring specifieke is kleuring. Bevroren secties (niet afgebeeld) waren vergelijkbaar met paraffine secties in dit opzicht. Echter, omdat de kleine maar variabele achtergrond in het epithelium kleuring, ons lab heeft alleen gekwantificeerd de stromale kleuring, die lijkt te hebben geen achtergrond histologische kwesties7.

Als menselijke hoornvlies verwonden, verkrijgen van hoornvlies niet gebruikt voor transplantatie in plaats van volledige globes mogelijk meer kosteneffectieve40. In dit geval zal het hoornvlies gewond worden zonder de hulp van de druk die worden geboden door de hele wereld. Extra verwonden strategieën kunnen omvatten hoornvlies burns, die al uitgebreid in vivo gebruikt hebben te produceren een litteken42.

Kortom, de voordelen van dit systeem voor een 3D weefsel wond genezing assay is de reproduceerbaarheid en kostenbesparingen met alleen standaard uitrusting behoeften, waardoor het een uitstekend middel voor het observeren en kwantificeren van de effecten van agenten op de genezing van weefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de NIH-NEI R01 EY024942, onderzoek te voorkomen blindheid, Upstate medische universiteit onbeperkte middelen voor onderzoek, en Lions District 20-Y. microscopie en beeldanalyse van paraffine secties werden uitgevoerd in de kern van de microscopie en histologische prepareren van objectglaasjes werd uitgevoerd in het Biorepository en de pathologie kern aan de School of Medicine van Icahn op de berg Sinaï.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

Geneeskunde kwestie 144 hoornvlies littekens fibrose Myofibroblast Ex vivo orgel cultuur
Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro, N., Gillespie, S. R.,… More

Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter