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Medicine

Ex Vivo, modèle de Culture d’organes cornéenne pour la cicatrisation des études

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole pour un ancien modèle de culture de cornée orgue vivo utile pour la cicatrisation des études est exposée. Ce système de modèle peut servir à évaluer les effets des agents pour favoriser la guérison régénératrice ou toxicité des médicaments dans un environnement 3D organisé de multicellulaire.

Abstract

La cornée a été utilisée intensivement comme système modèle pour étudier la cicatrisation des plaies. La capacité de générer et d’utiliser des cellules primaires de mammifères en deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) culture a généré une mine de renseignements non seulement sur la biologie de la cornée, mais aussi sur la plaie, guérison, myofibroblastes biologie et la cicatrisation en général . L’objectif du protocole est un système de dosage pour quantifier les myofibroblastes développement, qui caractérise la cicatrisation. Nous démontrons un cornée orgue ex vivo modèle de culture à l’aide des yeux de cochon. Dans cette kératectomie antérieure enroulé, cornées encore dans le monde sont blessées avec une lame circulaire appelée un trépan. Un bouchon d’environ 1/3 de la cornée antérieure est supprimé y compris l’épithélium, la membrane basale et la partie antérieure du stroma. Après la blessure, cornées sont coupées du monde, montées sur un socle de collagène/agar et cultivées pendant deux semaines en milieu sans sérum complétée de vitamine c stabilisée pour augmenter la prolifération cellulaire et la sécrétion de la matrice extracellulaire par les fibroblastes résidents. Activation des myofibroblastes dans le stroma antérieur est évidente dans la cornée cicatrisée. Ce modèle peut être utilisé pour doser la fermeture de la plaie, le développement des myofibroblastes et marqueurs fibreuses et pour les études de toxicologie. En outre, les effets des inhibiteurs de petites molécules comme la transfection de siARN médiée par les lipides pour de gène peuvent être testées dans ce système.

Introduction

Cicatrisation de la cornée résultant de la blessure, un traumatisme ou une infection peut conduire à débiliter des opacités cornéennes et une cécité permanente. Ainsi, il y a un besoin essentiel d’identifier les voies qui peuvent être ciblés pour une intervention thérapeutique. Les options thérapeutiques actuelles sont limitées et consistent principalement en des greffes de cornée, qui ne sont pas accessibles aux patients à travers le monde. Tant humaines (Figure 1) et cornées animales peuvent être utilisées pour la 2D et la culture cellulaire 3D études1,2. Cornées de cadavre humain ne convient pas pour la transplantation peuvent être obtenues auprès de banques de le œil ou banques de tissus centralisé (National Disease Research Interchange (NDRI)), et animaux yeux peut provenir d’un abattoir. Cellules épithéliales cornéennes primaires et plus récemment, les cellules endothéliales, fibroblastes stromales peuvent être isolées et cultivées de ces tissus pour la cicatrisation des plaies et des études de toxicologie3,4,5. En plus de l’importance de comprendre les bases moléculaires de l’aveuglement des maladies oculaires, l’accessibilité des tissus et la capacité de cellules primaires de la culture a fait de la cornée un important système modèle pour l’étude. La cornée est idéale pour tester les effets des agents sur la cicatrisation de la cornée normale est transparente et de certains types de blessures créent opacités ou cicatrices fibreuses (évaluées à6). Aussi, plusieurs en vivo plaie cornéenne, modèles guérison ont été largement utilisés pour cicatrices études1. Moins utilisé a été l’ex vivo cornée plaie guérison modèle7,8 qui est décrit en détail ici. Cette méthode vise à quantifier les résultats cicatrisation caractérisées par les responsables fibreuses dans une 3D multicellulaires cornée ex vivo système de modèle.

Blessant épithéliale cornéenne qui ne viole pas la membrane basale épithéliale normalement ferme dans les 24 à 72 h9. Bientôt après la blessure, les cellules au bord de l’épithélium commencent à répandre et migrer vers la surface épithéliale et libre, pour rétablir la fonction barrière épithéliale. Cette activité est suivie dans l’ordre d’activation de la prolifération de la cornée Baso-cellulaire tout d’abord et, à un stade ultérieur, de cellules précurseurs situé dans la zone limbique extérieure pour obtenir la récupération de cellules épithéliales masse10,11. Ces blessures guérissent souvent sans laisser de cicatrices. Cependant, une blessure qui pénètre la membrane de sous-sol dans le stroma souvent traduit par cicatrice formation1. Après la blessure de stroma cornéen, le stroma est rempli avec des cellules de plusieurs origines, y compris les cellules stromales résidents différenciés ainsi que dérivés de la moelle osseuse des fibrocytes12,13,14. Cicatrices fibreuses se caractérise par la persistance des myofibroblastes dans une plaie de guérison. Ces myofibroblastes pathologiques démontrent une adhérence accrue grâce à l’accumulation des intégrines en focales, fibres de stress contractile musculaire lisse α actine (α-SMA) et activation locale de la matrice extracellulaire (ECM)-séquestré latente-transformant le facteur de croissance-bêta (TGFβ). La différenciation des cellules épithéliales dérivées, sous le titre épithéliales transition mésenchymateuse (EMT), peut-être aussi contribuer à6de la formation de cicatrices.

Il y a un équilibre délicat entre la différenciation cellulaire et l’apoptose après la blessure. En raison de la violation dans les membranes basales, les facteurs de croissance comme facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) et de TGFβ de larmes et de l’épithélium baignent le stroma, induisant la différenciation des myofibroblastes, une boucle autocrine soutenue d’activation de TGFβ, ainsi que la sécrétion de désorganisé fibrotique ECM15,16. La persistance des myofibroblastes dans la blessure guérie favorise la brume et la cicatrisation de la cornée (Figure 2). Cependant, en régénération guéri plaie bien que développent des myofibroblastes, ils apoptose et donc sont absents ou significativement réduite en nombre dans les tissus cicatrisés (revu en référence6,10). Ainsi, les recherches sur les cicatrices fibreuses portent au moins en partie sur le ciblage des molécules qui empêchent le développement excessif de myofibroblastes ou myofibroblastes persistance17,18. Parce que la persistance de myofibroblastes caractérise les cicatrices et fibrose maladie dans tous les tissus19, la cornée peut être utile comme système modèle pour étudier les mécanismes cellulaires généraux de la fibrose.

Dans notre système de modèle, la cornée est blessée avec une lame cylindrique appelée un trépan tout en restant dans le monde entier. Humaine et cornées de porc peuvent être blessées avec soit un trépan mm 6 ou 7 ; pour les cornées de lapin un trépan de 6 mm est préférable. La cornée de cochon est similaire en taille à la cornée humaine. Parce qu’ils sont rentables et facilement disponibles en grand nombre, des cornées de porc sont couramment utilisées pour la culture de l’orgue. En outre, les anticorps et siRNAs fait réagir avec l’homme ont constamment réagissent avec porc7. Après la blessure, cornées sont découpées dans le monde entier avec le limbe intactes et monté sur une base de gélose/collagène. Les cornées sont cultivées dans un milieu sans sérum plusent stabilisé de vitamine C pour simuler la prolifération des fibroblastes et ECM dépôts20. L’ajout de sérum ni facteurs de croissance sont nécessaires pour induire la formation de myofibroblastes7. Cornées sont systématiquement fixes et transformées pour histologie après deux semaines de culture. Pour de gène, ou pour tester les effets d’un agent sur la cicatrisation des plaies, la plaie peut être traitée avec des siARN dans la plaie après la blessure de7 ou un agent soluble peut être ajouté aux médias, respectivement8.

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Protocol

1. organe Culture

  1. Préparations
    1. Préparer la solution d’agar comme suit. Dans un petit ballon, préparer 1 % d’agar et de collagène d’origine bovine en DMEM-F12 1 mg/mL à 20 mL. Porter à ébullition sur une plaque chauffante. Mettre la solution dans un tube conique de 50 mL. Placer le tube dans un bain d’eau sur une plaque chauffante pour empêcher la solution de solidification.
    2. Préparer supplémenté médias sans sérum (SSFM) selon la composition fournie dans la Table des matières.
      Remarque : La quantité nécessaire du SSFM à préparer dépend du nombre de cornées à traiter. 30 mL est habituellement assez pour 4 cornées.
  2. Dissection
    Remarque : Effectuez cette étape dans une hotte de dissection ou une hotte chimique. Les yeux sont livrés avec couvercles encore attachées en sachets individuels pour protéger les globes.
    1. Retirez les globes de couvercles avec une lame chirurgicale de droites sur une planche à découper nettoyé à l’éthanol. Retirer les excès de tissu graisseux de le œil à l’aide d’une lame ou une petite paire de ciseaux (Figure 3 a, 3 b).
    2. Après avoir retiré le globe du couvercle, tenir le monde entier vers l’arrière avec une pince et plonger immédiatement le œil dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Tremper rapidement elle x 3 à 10 % d’iode (dans un bécher de 100 mL). Tremper rapidement 2 x dans du PBS (~ 100 mL dans un bécher, PBS de changer fréquemment).
    3. À l’aide d’une serviette propre ou un mouchoir, envelopper l’oeil sur sa circonférence avec suffisamment de pression pour avoir une surface cornéenne tendue à couper avec le trépan.
      Remarque : prendre soin de prévenir la serviette ou un mouchoir en contact avec la cornée.
  3. Blessant
    1. Utilisez un trépan de 6 mm à blesser le centre de la cornée. Pénètrent dans l’épithélium et le stroma antérieur sans faire une plaie pleine épaisseur à travers la cornée entière.
      Remarque : Si l’endothélium est pénétrée, on constatera une perte de pression et le liquide qui fuirait. Dans ce cas, le œil doit être jetée.
    2. Placez le trépan dans le centre de la cornée, tourner 180° dans le sens horaire et anti-horaire 5 x (chaque fois que la direction est modifiée il comptera comme une fois) tout en appliquant une légère pression pour approfondir la plaie.
      Remarque : La plaie doit être maintenant assez profonde pour permettre un lambeau tissulaire à soulever à l’aide d’une paire de pinces. Si ce n’est pas le cas Répétez l’étape 1.3.2.
    3. Soulevez le rabat sur les bords. Dans le même temps, soit avec l’autre main une seconde personne, utilisez une lame, coupe parallèle au monde entier à découper le tissu comme la pince continue de soulever la cornée antérieure dans la marge de la plaie. À l’issue de cette étape, il devrait y avoir une plaie circulaire située au centre de la cornée (voir la Figure 3C, 3D).
  4. Couper et retirer le Globe de la cornée
    1. Maintenant le œil avec le tissu, faire une petite incision de 1 mm du bord de la cornée avec une lame afin que le limbe est inclus dans la culture de l’orgue.
    2. Ciseaux pointus à l’aide de petits, accéder à l’incision créée à l’étape préalable à la Coupe du monde, gardant une marge de millimètre tout au long de la cornée afin de préserver le limbe.
    3. Placez la cornée dans un plat de 60 mm avec 1 mL de PBS, à côté de la plaie vers le bas jusqu’au montage.
  5. Montage
    1. Veillez à ce que l’agar est venu à une température chaude (environ 25 ° C).
    2. Avec deux paires de pinces, créer une tasse en levant les deux côtés de la cornée et la face endothéliale. Ajouter la solution d’agar réchauffé dans la cornée à l’aide d’une pipette stérile jusqu'à ce qu’il est plein.
    3. Après l’agar durcit (habituellement environ 30 à 45 s) Retournez soigneusement la cornée avec la gélose dans la plaque (Figure 3E) de 60 mm. Couvrir avec un couvercle.
  6. Incubation
    1. Ajouter 4 mL de SSFM à la plaque de maintien des cornées à l’interface air-liquide à la frontière limbique dans 5 % CO2 à 37 ° C. Actualiser les médias après 24 h et par la suite tous les deux jours.
      Remarque : Si vous effectuez une transfection dans la plaie, omettre les antibiotiques jusqu'à ce qu’après la transfection.
    2. Mouiller la surface cornéenne, une fois par jour en ajoutant 1 goutte du SSFM depuis les milieux conditionnés dans le plat pour maintenir l’humidité. Pour ce faire, prendre le plat hors de l’incubateur, placez-le sous le capot, enlever le couvercle plat, mouiller la surface avec les médias de plat à l’aide d’une pipette stérile, couvrir à nouveau et remettre en place à l’incubateur.
    3. Pour l’inactivation du gène, traiter la plaie avec ciblage de gène ou contrôler les siARN qui est complexée à un transporteur lipide-négociée selon les instructions du fournisseur (voir ci-dessous).
    4. Mix 5 µL (50 pmol) de siARN dans 50 µL de sérum réduit minimal médias essentiels (p. ex.., Opti-MEM). Mélanger 2 µL de réactif de transfection dans 50 µL de sérum réduit-médias. Laisser ce reposer pendant 5 min et puis mélangez-les.
    5. Ajouter 200 µL de sérum réduit minimal médias au mélange réactif/siARN.
    6. Pipette goutte à goutte sur la plaie et incuber pendant 3 h.
    7. Lavent siRNA de surface de la cornée avec les médias dans le plat. Changer le milieu d’incubation au SSFM + antibiotiques (voir la Table des matières). Continuer d’incubation comme mentionné précédemment (pas 1.6.1-1.6.2).

2. histologie : Sections de paraffine et Immunostaining

  1. Préparer le tissu
    1. Après une incubation de deux semaines, si vous utilisez certains des tissus pour quantitative polymérase PCR (qRT-PCR) analyse en temps réel, avant de fixer, coupée de la cornée en deux par le biais de la plaie. Placez cette moitié ou seulement ¼ (soit est assez tissu) en stabilisant réactif RNA-protect.
    2. À l’aide d’un kit d’isolation standard, isoler l’ARN et exécuter qRT-PCR.
      Remarque : Sinon, la partie blessée seulement peut être isolée et testée pour l’expression des gènes.
    3. Placer l’autre moitié de la cornée en cassettes de pathologie des tissus et immergez-la dans le fixateur (formol à 10 %) pour 2 à 4 jours à température ambiante (RT).
    4. Paraffine cela incorporez la moitié de la cornée blessée selon les techniques habituelles.
      Remarque : Orienter la cornée blessée pour s’assurer que le sectionnement des tissus va produire un échantillon représentatif de la cornée.
  2. Immunomarquage à l’aide de 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
    1. Jour 1
      1. Étiquette glisse correctement à l’aide d’un crayon. Hors paraffinize le tissu en plaçant des diapositives dans un bocal avec agent (2 changements, 10 min chacun) de compensation.
      2. Réhydrater les tissus en transférant les diapositives dans l’éthanol à la baisse des concentrations (100 %, 100 %, 70 %, 50 %, dH2O, dH20, 5 min pour chaque modification).
      3. Effectuer des recherche d’antigène par micro-ondes des diapositives dans un pot en plastique avec tampon citrate (10 mM, pH 6,4) pendant 5 min. 5 min à 50 % de puissance de premier cycle. Remplissez le bocal avec tampon citrate et répéter. Refroidir pendant 10 min.
      4. Laver 3 fois avec du PBS, 2 min de chaque. Permeabilize tissu avec 1 % X-100 Triton en PBS 10 min au bloc RT. coupes avec 3 % de sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h à RT en chambre humide.
      5. Incuber le tissu avec l’anticorps primaire (au 1/100 ou comme l’indique le fournisseur) dans 3 % NGS pour la nuit à 4 ° C (300 µL par lame).
    2. Jour 2
      1. Rincer les lames 3 x avec PBST (PBS plus 1 % Tween 20), 2 min de chaque. Placer les lames dans 3 % H2O2 pendant 10 min bloquer la peroxydase endogène. Laver 3 fois avec PBST, 2 minutes chacun. Incuber les sections avec l’anticorps secondaire de HRP (1/250) dans 3 % NGS pendant 1 h à RT (300 µL par lame).
      2. Les lames 3 x PBST, 2 minutes chacun. Traiter les diapositives avec le kit DAB. Ajouter 300 µL/lame pendant 3 min. laver les lames avec dH2O 2 x (dips rapides).
      3. Contre-coloration à l’hématoxyline pour lavage s. 20 la diapositive avec dH2O 2 x (dips rapides). Tache avec agent de bleuissement pour 20 s. rinçage en dH2O pour 20 s. Dehydrate tissu en plaçant se glisse dans l’augmentation des concentrations d’éthanol (50 %, 70 %, 100 %, 100 %, tous les trempettes rapides).
      4. Sécher les diapositives sur une serviette en papier sous le capot pour 10-20 min.
      5. Monter des diapositives en utilisant 1 goutte de montage multimédia, recouvrir d’une lamelle couvre-objet. Étiqueter et stocker à température ambiante.
      6. Image des diapositives sous un microscope et quantifier le signal DAB avec ImageJ7 (voir la section 4).
  3. Immunomarquage : Fluorescence
    1. Le jour 1 suivez la procédure décrite à l’étape 2.2.1. Effectuez les opérations suivantes sur 2 jours.
    2. Rincer les lames 3 x dans le PBST pour 2 min de chaque. Incuber les sections avec l’anticorps secondaire fluorophore-tag dans 3 % NGS (1 : 200) pendant 1 h à température ambiante.
    3. Laver 3 x dans le PBST, 2 minutes chacun. Montage de diapositives à 1goutte de 4′, supports de montage 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et le couvercle avec une lamelle. Sécher sur un essuie-tout sous le capot pour 30 min. magasin dans l’obscurité à 4 ° C jusqu’en imagerie de fluorescence.
  4. Quantification à l’aide d’Image J
    1. Télécharger la version « Fidji » d’ImageJ, qui comprend les plugins nécessaires pour DAB quantification de coloration.
    2. Ouvrir une image dans les îles Fidji et sélectionnez Image → couleurs → couleur déconvolution.
    3. Sélectionnez « H DAB » comme la tache et puis cliquez sur OK. Trois nouvelles images seront affiche. Sélectionnez l’image qui contient la seule coloration de DAB.
    4. Afin de quantifier stromales coloration uniquement, utilisez la fonction de gomme de ImageJ pour éliminer l’épithélium de l’image DAB.
    5. Sélectionnez analyser → mesure (ou Ctrl + M) et relever la valeur.

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Representative Results

Immunohistochemistry est le test principal utilisé pour analyser le succès de l’ex vivo plaie expérience de guérison. La figure 4 illustre l’épithélium et le stroma antérieur en tissu témoin (Figure 4 a, 4 b). Six heures après la blessure, l’épithélium est absente (Figure 4, 4D). Six jours après la blessure comme prévu, l’épithélium avait augmenté (Figure 4E, 4F). Ce tissu a été immunomarquées pour l’actine musculaire lisse alpha (α-SMA), dont l’expression caractérise les myofibroblastes. Il y a une augmentation spectaculaire de le α-SMA immunomarquage dans le stroma tel que détecté par colorimétrie substrat DAB. Il y avait aussi une augmentation de la réactivité épithéliale qui peut suggérer l’EMT de transition7 (voir la Discussion). Désorganisation dans l’épithélium et le stroma était évidente. Une expérience blessant un grossissement inférieur et avec un immunomarquage fluorescent au lieu de DAB s’affiche (Figure 4, 4 H). La marge de la plaie est visible ainsi que d’un gradient de myofibroblastes active de l’antéro-postérieur stroma.

Bien que les marqueurs de fibrosants sont exprimés d’une semaine (Figure 4), pour obtenir le développement cohérent et fiable des marqueurs de fibrosants, un point dans le temps de deux semaines a été choisi. Dans la Figure 5 démontre un essai utilisant une seule demande de contrôle ou des siARN ciblant les gènes pour être testés pour promouvoir la guérison régénératrice. Dans ce cas, le siARN ciblant prévoyait USP10, un deubiquitinase. Myofibroblastes pathologique a démontré une adhérence accrue grâce à l’accumulation de αv-intégrines dans des adhérences focales21. Nos études antérieures ont montré que αvβ1 et αvβ5 sont des intégrines fibreux importants dans la guérison stroma cornéen7. Les intégrines lient ECM à l’extérieur de la cellule et ensemble ils sont internalisées. L’intégrine intériorisé est ubiquitinées et envoyé pour dégradation dans le lysosome ou la balise de l’ubiquitine est supprimée par un deubiquitinase (DUB) et l’intégrine est recyclé à la surface des cellules. Nous avons découvert qu’une augmentation de l’expression du gène de la DUB (USP10) augmente le taux de suppression d’ubiquitin de l’intégrine sous-unités β1 et β5 conduisant à une accumulation qui en résultent de αv/β1/β5, sur la surface des cellules, avec ultérieures TGFβ activation et l’induction de marqueurs de fibrose7. Précipitation d’USP10 en culture organotypique cornée a empêché l’apparition des marqueurs fibrotique7. Un exemple de ces résultats est illustré à la Figure 5. Comme ci-dessus, α-SMA est utilisé comme marqueur des myofibroblastes. Un autre indicateur de cicatrices est la fibronectine-EDA (FN-EDA), une variante de l’épissure du FN qui contient un RGD, αv intégrine liaison domaine22,23,24. Il est aussi appelé FN cellulaire (c-FN). Il sert comme un marqueur fibrotique FN-EDA n’étant pas dans la circulation plasmatique mais plutôt est seulement exprimé et sécrétée par les cellules sous conditions fibrotiques25. Dans la Figure 5 a-5C immunostaining pour α-SMA est montré. Non blessés (Figure 5 a), blessant plus de siARN contrôle (Figure 5 b) montrait à une augmentation spectaculaire dans l’expression de la protéine α-SMA, tandis que l’addition de USP10 siARN7 réduit considérablement l’expression dans le stroma et épithélium. De même, par rapport aux non blessés (Figure 5), blessant plus de siARN contrôle (Figure 5E) ont démontré une augmentation spectaculaire de l’expression protéique de la fibronectine-EDA par rapport au traitement avec siARN USP10 (Figure 5F). Immunohistologie pour la protéine cible (dans ce cas, USP10) a servi à démontrer avec succès le7. En outre, effectuer qRT-PCR peut-elle knockdown de gène dans le tissu ou encore d’analyser d’autres marqueurs fibrotique7. ImageJ peut être utilisé pour quantifier le signal dans le stroma seulement ou total (Figure 5). Au moins 3 cornées pour chaque condition testée doivent être utilisées pour quantifier immunostaining pour générer la signification statistique que nous avons montré ici et déjà publié7. Autres protéines qui ont été régulièrement utilisés pour les marqueurs de fibrosants sont collagène III expression et une augmentation de l’expression de l’intégrine1,26.

Dans la Figure 6, l’utilisation des ex vivo la culture cornée est démontrée comme un test de toxicologie. Dans cette expérience, cornées étaient soit gauche chemin (Figure 6 a), blessé (Figure 6 b), ou blessé et traité avec 10 µM Spautin-127, qui a été ajouté pour les milieux de culture cellulaire pour augmenter les périodes de temps avant lavage dehors ( Figure 6-6F). Spautin-1 est un médicament qui cible non spécifiquement USP1027. En raison de notre succès avec USP10 siRNA, Spautin traitement a été testé pour l’efficacité dans la prévention des cicatrices. À la différence des siARN, Spautin à cette concentration est toxique pour les tissus. Augmenter le temps avec Spautin-1 dans la culture empêché réépithélialisation et a abouti à la mort cellulaire qualitative, matrice désorganisée et vacuoles stromales suggérant que Spautin-1 ne favorise pas la guérison à la concentration mesurée. Les analyses histologiques standards peuvent être utilisées pour quantifier la prolifération cellulaire ou apoptose.

Figure 1
Figure 1 : Section transversale d’un œil humain avec une vision élargie de la cornée. Chez les primates et les poulets, sur le plan histologique, il y a cinq couches distinctes : l’épithélium, Bowman membrane, stroma, de Decement membrane et l’endothélium28,29. Dans tous les autres mammifères, membrane de Bowman n’est pas visible sur le plan histologique. À l’échelle microscopique de transmission électronique, une membrane basale est observée qui sépare l’épithélium de la cornée et le stroma dans toutes les cornées, y compris ceux avec la membrane de Bowman, un. D’un intact Bowman membrane ou membrane basale qui sépare l’épithélium du stroma est nécessaire pour empêcher la cicatrisation chez tous les mammifères. Image reproduite avec la permission de AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Diagramme des événements cellulaires qui mènent à la cicatrisation cornéenne. Ce diagramme décrit les événements de base qui se déroulent dans la cornée antérieure après la blessure. (A) représentation de l’épithélium, membrane basale, stroma et les cellules quiescentes incorporés dans le stroma, c’est à dire, keratocytes. ()B) le triangle rouge représente une plaie, qui peut être mécanique, un ulcère, un virus ou une infection persistante. (C) après la blessure, en qui pas une violation de l’archer ou membrane basale, les cellules autour de l’apoptose de la plaie. (D et E) un afflux de cellules repeupler la plaie des keratocytes résident ou de moelle osseuse de fibroblastes et de transition dans des fibroblastes activés ou directement dans les myofibroblastes. (F), ces adhérents myofibroblastes pathologiques créent une boucle autocrine d’activation de TGFβ et sécrétion de désorganisé matrice fibreuse qui favorise la formation de brume et cicatrice cornéenne. Dans une plaie cicatrisée après, myofibroblastes apparaissent mais ont apoptosed dans les tissus cicatrisés6,29,30. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Recevoir et de traiter les cornées pour culture organotypique. Cochon (A) yeux est reçus avec couvercles pour protéger la cornée lors de l’expédition. Image du globe après avoir retiré le tissu (B). (C) Image d’un trépan de 6 mm. Wounding (D) de la cornée centrale avec un trépan. Image (E) de la cornée montée après le retrait de la planète. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Tissu cornéen après la blessure. Immunohistological analyse de non blessé (contrôle) ou cornées blessées. Cornées de porc ont été laissées non blessé (contrôle) ou blessées. Des sections de tissu ont été immunomarquage avec un anticorps à l’actine muscle lisse-alpha (α-SMA) pour identifier les myofibroblastes. (A et B) contrôle, chemin. (C et D) blessés et fixé à 6 h après blessure. L’épithélium est supprimé (flèche). (E et F) blessés et fixée à 6 jours après la blessure. Stroma a rempli à l’arrivée et l’épithélium a augmenté (tête de flèche). Représentant des myofibroblastes activés sont signalées par des astérisques (*). (G, H) Images de grandissement de α-SMA immunomarquage à faible 2 semaines après la blessure : α-SMA (rouge), DAPI (bleu). Images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence/fond de clair verticale avec une caméra CCD. Echelle = 100 µm (A, C, E) ; 50 µm (B, D, F) ; 200 µm (G, H). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Les agents de guérison régénératrices test. Cornées de porc étaient soit (A et D), chemin (contrôle), (B et E) blessés et traitement avec le siARN contrôle, ou (C et F) blessés et traitement avec le siARN USP10. Immunomarquage (A-C) α-SMA ouD-Fla fibronectine-EDA. Après le traitement avec USP10 siRNA, α-SMA a été réduit de 2,2 ± 0,6 pli *** p < 0,001 et FN-EDA 3.3 ± 1,2 fois ** p < 0,01. Images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence/fond de clair verticale avec une caméra CCD. Echelle = 50 µm. (G) cornéen stromal coloration tel que quantifié par ImageJ. Signification statistique a été calculée en ANOVA à test de Bonferroni. La figure a été adaptée avec la permission de Gillespie Al.7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Effets sur la reepithelialization - études toxicologiques, les agents de test. Immunomarquage pour α-SMA. Cornées de porc étaient chemin (A) et (B) blessé. (C-F) Cornée ont été blessés et incubées en présence de 10 µM Spautin-1. L’inhibiteur est délavé et remplacé par médias après (C) 2 jours, (D) 4 jours, (E) 6 jours, (F), 14 jours. Toutes les modifications de médias au cours de la période d’incubation incluaient Spautin comme indiqué. Toutes les cornées ont été fixées et incorporées à la paraffine après 2 semaines de culture. Images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence/fond de clair verticale avec une caméra CCD. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit un modèle pour étudier la cicatrisation dans un environnement 3D stratifié naturel. Utilisation de la culture de l’orgue comme intermédiaire entre la culture cellulaire et études in vivo réduit considérablement les coûts ainsi que les procédures de réduction sur les animaux vivants. Autres modèles 3D ont été d’une grande utilité sur le terrain, y compris la synthèse des gels collagène fabriqués à partir de fibroblastes cornée humaine primaire2 ou ces mêmes cellules incorporées dans les gels de collagènes d’origine animale31. Le système de modèle de culture orgue est particulièrement utile pour tester des agents putatifs de guérison puisque la plaie est localisée et donc, il y a une marge nette entre les tissus blessés et non blessés dans la même cornée (Figure 4). En outre, une blessure mécanique trépan permet un accès direct à du stroma, qui est excellent pour l’administration de siARN dans la plaie (Figure 5). Bien qu’il n’est pas affichée ici, transduction virale dans le tissu de la cornée en culture d’organe a également été démontrée32,33,,34. Une autre permutation de ce test serait à infecter les cornées avec une construction de journaliste de l’expression génique intérêts et l’image en temps réel après la blessure. En termes de traduction à des études in vivo, cette même procédure peut être accomplie en lapins35 et ainsi, culture d’organes sur l’homme, porc ou cornées de lapin peuvent être comparées aux résultats in vivo. Dans notre expérience, les données que nous avons obtenus avec le modèle de la culture d’organes-traitement de siARN ont traduit en semblables résultats in vivo (données non publiées). Étant donné que les cornées de la culture d’organes n’ont pas une vascularisation fonctionnelle limbique, larmes et humeur aqueuse, chaque chercheur doit évaluer si ce sera un modèle utile pour leurs études. Résidente activation de cellules immunitaires a été démontrée, mais l’exact parallèle à des études in vivo n’est pas encore clair1.

Une étape clé dans le protocole ne doit pénétrer la cornée par blessure trop profondément. Ce sera évident que le fluide de la chambre antérieure fuira dans ce cas. Dans ce cas, la planète devrait être jetée. Pour produire une plaie même mécanique, tenez le rebord du tissu délimité au sein de la zone de trephined avec un instrument, puis déplacez la lame chirurgicale parallèle à la surface de la cornée pour couper le tissu dans les limites de la tréphine enroulé. La surface de la cornée doit s’assèchent pas ainsi, nous recommandons que, après avoir effectué la plaie et découpe de la cornée du globe, placer la cornée à l’envers dans du PBS jusqu'à ce que le mélange agar est à la bonne température. En s’assurant que l’agar n’est pas trop chaude évitera les lésions endothéliales.

Une limitation de ce modèle est que l’utilisation d’un trépan pour produire une plaie est inégale et ne peut être reproduite à l’identique de la cornée à la cornée par rapport aux blessures induite par laser36. Cependant, naturellement naturels plaies ne sont pas toutes équivalentes en profondeur et une grande masse de données donnent à penser que tout manquement dans les membranes basales génère des myofibroblastes développement et brume dans le stroma, alors que la régénération de la membrane basale mène à cicatrisation37,38,39a diminué. Ce modèle de culture d’organes cornée cochon emploie une blessure grave dans laquelle la membrane basale est enlevée dans le domaine de la tréphine. Développement des myofibroblastes et marqueurs fibreuses dans le stroma cornéen ont été systématiquement et reproductibilité obtenus à l’aide de ce système de modèle. Certains épithéliale de la coloration est généralement évidente qui s’assombrit dans l’épithélium blessé et régénérée. Cela a été démontré dans les autres organes cornéen culture rapports40 mais est absent dans la plupart des cornées de souris in vivo et lapin études41,,42. Cependant, une étude réalisée dans un modèle canin in vivo montré α-SMA épithélial forte coloration dans l’épithélium après la blessure de43. Le siARN favorisant la guérison régénératrice dans nos études également significativement réduite cette immunostaining épithélial, suggérant que l’épithélium peut être objet d’EMT (cicatrices fibreuses) quand il repousse en culture d’organes. En outre, l’omission d’un anticorps primaire dans le protocole de coloration d’une cornée blessée a entraîné l’absence totale de coloration7 suggérant que l’immunomarquage spécifique. Coupes congelées (non illustrés) étaient similaires aux sections de paraffine à cet égard. Toutefois, parce que le fond légère mais variable de coloration dans l’épithélium, notre laboratoire a chiffré seulement la coloration stromales, qui ne semble n’avoir aucun fond histologique questions7.

Si blessant cornées humaines, obtention des cornées ne pas utilisées pour la transplantation au lieu de globes complets peut être plus rentable40. Dans ce cas, la cornée va être blessée sans l’aide de la pression offerte par le monde. Stratégies blessantes additionnelles peuvent inclure la brûlure cornéenne, qui ont été largement utilisée in vivo pour produire une cicatrice42.

En résumé, les avantages de ce système pour un dosage de cicatrisation tissulaire 3D est sa reproductibilité et coût économies ayant des besoins d’équipement standard uniquement, ce qui en fait une excellente ressource pour observer et quantifier les effets des agents sur la guérison des tissus.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les NIH-NEI R01 EY024942, recherches pour prévenir la cécité, Upstate Medical University sans restriction Research Funds, et Lions District 20-y microscopie et analyse d’images de sections de paraffine ont été effectuées à la base de la microscopie et préparation histologique a été réalisée à la banque de tissus biologiques et le noyau de la pathologie à l’école de médecine de l’Icahn au mont Sinaï.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

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References

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Médecine numéro 144 cornée cicatrices fibrose myofibroblastes Ex vivo culture Organotypique
Ex Vivo, modèle de Culture d’organes cornéenne pour la cicatrisation des études
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Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

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