Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Abstract

הקרנית כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ריפוי הפצע. היכולת ליצור ולהשתמש תאים בתרבית של ראשי שני מימד (2D) ואת שלושת ממדי (3D) תרבות יצר שפע של מידע לא רק על ביולוגיה הקרנית, אלא גם על הפצע ריפוי, ביולוגיה myofibroblast, וצלקות באופן כללי . המטרה של הפרוטוקול היא מערכת assay לכימות myofibroblast פיתוח, המאפיינת הצטלקות. נדגים איברים הקרנית תרבות שמחוץ דגם באמצעות העיניים חזיר. ב- keratectomy הקדמי זה פצע, קרניות עדיין בתוך העולם פצועים עם להב מעגלית הנקראת trephine. פקק של 1/3 של הקרנית הקדמי הוא הסיר כולל האפיתל, קרום המרתף של החלק הקדמי של stroma. לאחר פציעתו, קרניות לחתוך מהגלוב, רכוב על בסיס קולגן/אגר, תרבותי במשך שבועיים במדיום בחינם בתוספת-סרום יחודיי מיוצב להעצמת התפשטות תאים והפרשת מטריצה חוץ-תאית על ידי fibroblasts תושב. הפעלה של myofibroblasts ב stroma הקדמי ניכרת הקרנית נרפא. מודל זה יכול לשמש כדי assay הפצע הסגר, ההתפתחות של myofibroblasts וסמנים שהותירה ולאחר ללימודי הרעלים. בנוסף, ההשפעות של מעכבי מולקולה קטנה, כמו גם בתיווך השומנים siRNA תקנים עבור גנים יכול להיבדק במערכת זו.

Introduction

הצטלקות הקרנית הנובע פציעה, טראומה או זיהום יכול להוביל מתישה opacities, אובדן ראייה קבועים. לפיכך, יש צורך קריטי כדי לזהות מסלולים אשר ניתן לפלח התערבות טיפולית. אפשרויות הטיפול הנוכחי מוגבל, מורכב בעיקר השתלות הקרנית, אשר אינם נגישים לחולים ברחבי העולם. האדם (איור 1) והן לקרנית בעלי חיים יכול להיות מנוצל עבור דו-ממדי ולומד תרבית תאים 3D1,2. ניתן להשיג לקרנית גווייה האנושית לא מתאימה להשתלה העין בנקים או רקמות מרכזי בנקים (לאומי מחלות מחקר מחלף (NDRI)), עיניים חייתיות ניתן להשיג בית-מטבחיים. ראשי תאים אפיתל הקרנית, סטרומה fibroblasts ועוד לאחרונה, תאי אנדותל, יכול להיות מבודדת ותרבותית של רקמות אלה לריפוי הפצע ולא של הרעלים לימודים3,4,5. מעבר לחשיבות של הבנת הבסיס המולקולרי של מסנוור מחלת עיניים, הנגישות של רקמות ואת היכולת תרבות ראשי תאים הפך הקרנית מערכת מודל חשוב למחקר. הקרנית הוא אידיאלי עבור בחינת השפעת סוכנים על צלקות כפי הקרנית נורמלי הוא שקוף וליצור סוגים מסוימים של פצעים אטימות או שהותירה צלקות (נבדקה ב6). מספר ויוו הפצע הקרנית הריפוי מודלים יש גם בהרחבה מנוצל עבור צלקות מחקרים1. פחות מנוצל היה לשעבר vivo הקרנית פצע ריפוי מודל7,8 המתארים בפירוט כאן. המטרה של שיטה זו היא לכמת את התוצאות הצטלקות מאופיין על-ידי עושי שהותירה ב- 3D multicellular הקרנית ex-vivo מודל המערכת.

הקרנית אפיתל ופצעו זה אינו מפר קרום המרתף אפיתל בדרך כלל סוגר תוך 24-72 h9. זמן קצר לאחר פציעתו, התאים בקצה של האפיתל להתחיל להפיץ ושל העברת לתוך השטח חינם אפיתל, להקים מחדש את פונקציית מחסום האפיתל. פעילות זו ברצף ואחריו הפעלה של התפשטות התאים הבזליים הקרנית קודם, בשלב מאוחר יותר, של תאים קודמן ממוקם באיזור limbal החיצונית כדי להשיג התאוששות של תאים אפיתל המונים10,11. הפצעים האלו לעיתים קרובות לרפא ללא צלקות. עם זאת, פצע חודר קרום המרתף stroma לעיתים קרובות גורמת היווצרות צלקת1. לאחר ופצעו סטרומה הקרנית, מאוכלסת stroma תאים של מקורות מרובים כולל תושב סטרומה תאים, כמו גם הנגזרות מח עצם fibrocytes12,13,14. שהותירה צלקות מאופיין על ידי ההתמדה של myofibroblasts פצע ריפוי. אלה myofibroblasts פתולוגית להדגים אדהזיה מוגבר באמצעות ההצטברות של אינטגרינים הדבקויות מוקד, סיבי סטרס אקטין (α-SMA) השריר α חלקה כויץ ו ההפעלה המקומי של מטריצה חוץ-תאית (ECM)-מבודד כמוס-צורה של גורם גדילה-בטא (TGFβ). הבידול של תאים אפיתל נגזר, המכונה אפיתל המעבר mesenchymal (אמבולנס), עשויים לתרום גם צלקת היווצרות6.

יש איזון עדין בין תאית התמיינות אפופטוזיס לאחר פציעתו. בגלל הקרע בתוך קרום המרתף, צמיחה גורמים כמו פקטורי גדילה נגזר טסית (דם PDGF) ואת TGFβ מרוב דמעות האפיתל להתרחץ stroma, גרימת myofibroblast בידול, לולאה autocrine מתמשכת של הפעלת TGFβ, ו הפרשת לא מאורגן שהותירה ECM15,16. התמדתו של myofibroblasts בתוך הפצע נרפא מקדם אובך, הצטלקות הקרנית (איור 2). עם זאת, ב- regeneratively נרפא פצע למרות myofibroblasts לפתח, הם apoptose, ובכך הם נעדרים או מספר מופחת באופן משמעותי ברקמה בריאה (נבדקה תוך התייחסות6,10). לפיכך, מחקר על שהותירה צלקות התמקדה לפחות בחלקו מיקוד מולקולות המונעים התפתחות myofibroblast מוגזמת או myofibroblast התמדה17,18. כי התמדה myofibroblast מאפיינת במחלה וצלקות וגם שהותירה רקמות כל19, הקרנית עשויה להועיל כמערכת מודל ללמוד כללי המנגנונים התאיים של פיברוזיס.

במערכת מודל שלנו, הקרנית פצוע עם להב גלילי המכונה trephine בעוד עדיין בתוך העולם. בני אדם ונפצעו חזיר לקרנית יכול להיות עם גם 6 או 7 מ מ trephine; ארנב לקרנית trephine 6 מ מ היא המועדפת. הקרנית חזיר דומה בגודל של הקרנית האנושית. כי הן חסכוניות וזמין במספרים גדולים, החזיר את הקרנית משמשים באופן שגרתי לתרבות איברים. יתר על כן, נוגדנים, siRNAs עשוי להגיב עם האדם יש בעקביות cross-reacted עם חזיר7. לאחר פציעתו, קרניות מנותקים מן העולם עם לימבוס ללא פגע, רכוב על אגר/קולגן הבסיס. קרניות הן בתרבית בתקשורת ללא סרום פלוס התייצב ויטמין C כדי לדמות פיברובלסט התפשטות ו- ECM התצהיר20. התוספת של סרום ולא גורמי גדילה לא נחוצים כדי לעודד היווצרות myofibroblast7. לקרנית באופן שגרתי קבוע, מעובד עבור היסטולוגיה לאחר שבועיים של תרבות. עבור גנים, או כדי לבדוק את ההשפעות של סוכן על ריפוי הפצע, הפצע יכולים להיות מטופלים עם siRNA בפצע לאחר ופצעו7 או סוכן מסיסים יכולים להתווסף לתקשורת, בהתאמה8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. איבר תרבות

  1. ההכנות
    1. להכין פתרון אגר כדלקמן. בבקבוקון קטן, להכין אגר 1% 1 מ"ג/מ"ל קולגן ב- DMEM-F12 עד 20 מ ל. להביא לרתיחה על פלטה חמה. לשים את הפתרון לתוך צינור חרוטי 50 מ. הצב צינור בתוך אמבט מים על פלטה חמה כדי למנוע את הפתרון שהשרף מתהווה.
    2. להכין שהושלם ללא סרום מדיה (SSFM) לפי ההרכב סיפק את הטבלה של חומרים.
      הערה: הסכום הדרוש של SSFM להיות מוכנים תלוי המספר של הקרנית יעובדו. בדרך כלל 30 מ ל הוא מספיק מדיה עבור 4 לקרנית.
  2. דיסקציה
    הערה: לבצע שלב זה ברדס לנתיחה או ברדס כימי. העיניים נשלחים בשלמותם עדיין מחוברת בשקיות נפרדות כדי להגן על גלובס.
    1. הסר גלובס העפעפיים עם להב כירורגי קצה ישר על לוח חוטב ניקיתי אתנול. להסיר רקמות שומן עודף של העין באמצעות סכין או מספריים קטנים (איור 3A, 3B).
    2. לאחר הסרת הגלובוס המכסה, להחזיק את העולם posteriorly עם מלקחיים, מיד לטבול את העין בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS). במהירות לטבול את זה ב 10% יוד (בתוך 100 מ ל)-x 3. טובלים במהירות 2 x ב- PBS (~ 100 מ בגביע, PBS שינוי בתדירות גבוהה).
    3. באמצעות מגבת נקייה או רקמות, לעטוף את העין circumferentially עם מספיק לחץ יש משטח הקרנית מתוח לחתוך עם trephine.
      הערה: לטפל כדי למנוע את המגבת או רקמות של פנייה אל הקרנית.
  3. ופצעו
    1. השתמש trephine 6 מ מ פצע את המרכז של הקרנית. לחדור את אפיתל ואת משתית הקדמי מבלי לבצע פצע מלא-עובי דרך הקרנית כולו.
      הערה: אם זה חדרו של אנדותל, אובדן הלחץ ואת הנוזל דולף יראו. במקרה זה צריך להיות מושלך העין.
    2. במקום את trephine במרכז הקרנית, לסובב אותו 180° נגד כיוון השעון ונגד 5 x (בכל פעם הכיוון השתנה זה ייחשב פעם אחת) תוך הפעלת לחץ קל להעמיק את הפצע.
      הערה: הפצע כעת אמור להיות עמוק מספיק כדי לאפשר דש רקמות יבוטל באמצעות זוג מלקחיים. אם זה לא המקרה חוזר שלב 1.3.2.
    3. הרם הכנף מהקצוות. במקביל, עם היד השנייה או עם אדם נוסף, השתמש להב חיתוך במקביל העולם כדי לשדר את הרקמה כמו המלקחיים להמשיך תמריא הקרנית הקדמי בתוך שולי הפצע. בתום שלב זה צריך להיות פצע עגול הממוקם במרכז הקרנית (ראה איור 3 ג', 3D).
  4. חיתוך והסרת הקרנית מהגלוב
    1. מחזיק את העין עם הרקמות, עושים חתך קטן 1 מ מ מהקצה של הקרנית עם להב כך לימבוס כלול בתרבות איבר.
    2. שימוש קטן, מספריים חדות לגשת החתך יצרת בשלב הקודם לחתוך ברחבי העולם, ושמירה על שוליים מילימטר לאורך הקרנית לשמור את לימבוס ללא פגע.
    3. מניחים את הקרנית בצלחת 60 מ מ עם 1 מ"ל ל- PBS, פצע בצד למטה עד הרכבה.
  5. הרכבה
    1. ודא שאגר הגיע לטמפרטורה חמה (כ 25 ° C).
    2. עם שני זוגות של מלקחיים, ליצור כוס על ידי מעכב את שני הצדדים של הקרנית עם הצד אנדותל. להוסיף הפתרון אגר להמציא חימם הקרנית באמצעות פיפטה סטרילי העברה של עד זה מלא.
    3. לאחר אגר מתקשה (בדרך כלל 30-45 s) בזהירות להעיף את הקרנית עם אגר לתוך צלחת 60 מ מ (איור 3E). מכסים עם מכסה.
  6. אינקובציה של רגשות
    1. להוסיף 4 מיליליטר SSFM לצלחת, שמירה על הקרנית-ממשק אוויר נוזלי בגבול limbal ב 5% CO2 ב 37 º C. רענן מדיה לאחר 24 שעות, לאחר מכן כל יום אחר.
      הערה: אם ביצוע תרביות של תאים בתוך הפצע, להשמיט את האנטיביוטיקה עד אחרי תרביות תאים.
    2. רטוב על פני הקרנית פעם ביום על-ידי הוספת 1 טיפת SSFM מהתקשורת ממוזגים בצלחת כדי לשמור על לחות. בשביל זה, קח את הצלחת מתוך החממה, להניחה מתחת למכסה המנוע, להסיר את המכסה מאכל, להרטיב את המשטח עם המדיה מן המנה באמצעות פיפטה סטרילי, לכסות שוב ותחזיר אותו בחזרה בחממה.
    3. עבור ג'ין נוק-אאוט, תוכלו לפנק את הפצע עם פילוח ג'ין או לשלוט siRNA זה הוא ומורכבת שליחויות בתיווך השומנים לפי ההוראות של הספק (ראו להלן).
    4. מיקס 5 µL (50 pmol) של siRNA לתוך µL 50 אמצעי חיוני מינימום מופחת-סרום (למשל., Opti-מ). לערבב 2 µL של תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 50 של מדיה מופחתת-סרום. . תן את זה לשבת במשך 5 דקות, ואז לערבב אותם.
    5. להוסיף 200 µL של התקשורת מינימום מופחת-סרום לתערובת ריאגנט/siRNA.
    6. פיפטה dropwise לתוך הפצע, תקופת דגירה של 3 שעות.
    7. לשטוף siRNA ממשטח הקרנית עם מדיה בצלחת. לשנות את המדיה דגירה SSFM + אנטיביוטיקה (ראה את הטבלה של חומרים). המשך הדגירה כפי שהוזכר קודם לכן (צעדים 1.6.1-1.6.2).

2. היסטולוגיה: שעוות פרפין סעיפים ו Immunostaining

  1. הכנת הרקמה
    1. לאחר שבועיים דגירה, אם באמצעות חלק מן הרקמה לניתוח כמותי בזמן אמת פולימראז תגובת שרשרת (לרביעיית-PCR), לפני תיקון, חיתוך הקרנית חצי דרך הפצע. החצי הזה או ¼ היחידה (הוא גם מספיק רקמה) לתוך ייצוב ריאגנט להגן על ה-RNA.
    2. באמצעות ערכת בידוד רגיל, לבודד את ה-RNA ולבצע לרביעיית-PCR.
      הערה: לחלופין, החלק הפצועים בלבד יכול להיות מבודד ונבדק על ביטוי גנים.
    3. המקום השני חצי של הקרנית לתוך רקמות פתולוגיה קלטות ויציפו לשבועיים (10% פורמלין) עבור 2-4 ימים בטמפרטורת החדר (RT).
    4. פרפין להטביע זה חצי של הקרנית הפצועים בטכניקות סטנדרטי.
      הערה: אוריינט הקרנית הפצועים כדי להבטיח כי רקמת חלוקתה יפיקו חתך רוחב של הקרנית.
  2. Immunostaining באמצעות 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
    1. יום 1
      1. תווית שקופיות כראוי באמצעות עיפרון. Paraffinize מבטל את הרקמה על ידי הצבת מגלשות לתוך צנצנת עם ניקוי הסוכן (2 שינויים, 10 דקות).
      2. נתרענן הרקמה על ידי העברת השקופיות לתוך אתנול בהפחתת ריכוזי (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 דקות על כל שינוי).
      3. לבצע אחזור אנטיגן על ידי במיקרוגל את השקופיות בתוך צנצנת פלסטיק עם מאגר ציטראט (10 מ מ, pH 6.4) במשך 5 דקות. מחזור ראשון 5 דקות ב- 50% חשמל. ממלאים את הצנצנת עם מאגר ציטראט וחזור. להתקרר למשך 10 דקות.
      4. רחץ 3 x עם PBS, 2 דקות כל אחד. Permeabilize רקמה עם 1% טריטון X-100 PBS 10 דקות-בלוק RT. חלקים עם סרום עז רגיל 3% (הגדרות) עבור h 1 RT בחדר לחים.
      5. דגירה רקמות עם נוגדן ראשוני (בטחונות או כפי הספק מרמז) ב 3% המיתרים בין לילה ב 4 ° C (300 µL לכל שקופית).
    2. יום 2
      1. שטיפה שקופיות 3 x עם PBST (PBS פלוס 1% Tween 20), 2 דקות כל אחד. מקום שקופיות2O 3% H2 10 דקות לחסום peroxidase אנדוגני. רחץ 3 x עם PBST, 2 דקות כל אחד. דגירה מקטעים עם נוגדנים משניים HRP (1:250) ב- 3% הגדרות עבור 1 h RT (300 µL לכל שקופית).
      2. לשטוף את השקופיות 3 x PBST, 2 דקות כל אחד. פנקו שקופיות עם ערכת DAB. להוסיף 300 µL/שקופית במשך 3 דקות לשטוף שקופיות ב- dH2O 2 x (מטבלים מהירה).
      3. Counterstain עם Hematoxylin עבור שטיפת ס' 20 השקופית ב- dH2O 2 x (מטבלים מהירה). הכתם עם סוכן הכחלת שטיפה ס' 20 ב- dH2O עבור 20-ס' Dehydrate רקמות על-ידי הצבת מחליק לתוך הגדלת ריכוזי אתנול (50%, 70%, 100%, 100%, כל מטבלים מהירה).
      4. יבש שקופיות על מגבת נייר מתחת למכסה המנוע למשך 10-20 דקות.
      5. הר השקופיות באמצעות טיפה 1 של הרכבה מדיה, לכסות עם coverslip. התווית ואת החנות RT.
      6. תמונה של שקופיות תחת מיקרוסקופ ולכמת DAB האות עם ImageJ7 (ראו סעיף 4).
  3. Immunostaining: קרינה פלואורסצנטית
    1. 1 יום בצע את הפעולות המתוארות בשלב 2.2.1. בצע את השלבים הבאים ביום2.
    2. שטיפה שקופיות 3 x ב- PBST למשך 2 דקות. דגירה מקטעים עם נוגדנים משניים מתויג fluorophore ב 3% המיתרים (1:200) עבור h 1-RT.
    3. רחץ 3 x ב- PBST, 2 דקות כל אחד. הר שקופיות באמצעות טיפה 1 של 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) הרכבה מדיית ומכסים עם coverslip. יבש על נייר מגבת מתחת למכסה המנוע במשך 30 דקות החנות בחושך ב 4 ° C עד זריחה הדמיה.
  4. כימות באמצעות תמונה J
    1. הורד את הגירסה "פיג'י" של ImageJ, הכולל את התוספים הנחוצים עבור DAB מכתים כמת.
    2. פתח תמונה בפיג'י ובחר תמונה → צבע ← Deconvolution צבע.
    3. בחר "H כי אמחה קלות" כמו הכתם ולאחר מכן לחץ על אישור. שלוש תמונות החדש יופיע. בחר את התמונה המכיל רק DAB מכתים.
    4. כדי לכמת סטרומה מכתים בלבד, השתמש בפונקציה המחק ImageJ להסרת האפיתל מהתמונה DAB.
    5. בחר לנתח ← מידה (או Ctrl + M) ולהקליט את הערך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימונוהיסטוכימיה הוא ראשיות וזמינותו מנוצל כדי לנתח את ההצלחה של האקס vivo פצע ריפוי הניסוי. איור 4 מתאר את אפיתל ואת משתית הקדמי ברקמת שליטה (איור 4A, 4B). שש שעות לאחר פציעתו, האפיתל היה נעדר (איור 4C, 4 D). שישה ימים לאחר ופצעו כצפוי, האפיתל היה המצמיח (איור 4E, 4F). רקמה זו היה immunostained עבור אקטין שריר חלק-אלפא (α-SMA), הביטוי אשר מאפיינת myofibroblasts. יש עלייה דרמטית בα-SMA immunostaining ב stroma כפי שזוהה על-ידי המצע DAB ערכי צבע מוחלטים. הייתה גם עלייה תגובתיות אפיתל זה יכול להציע החובשים מעבר7 (ראה את הדיון). חוסר ארגון אפיתל, משתית היה ניכר. ניסוי wounding בהגדלה נמוכה יותר ועם immunostaining פלורסנט במקום DAB מוצג (איור 4G, 4 שעות). שולי הפצע מוצגת כמו גם שיפוע של myofibroblasts פעיל מ הקדמי כדי משתית האחורי.

למרות סמני שהותירה באים לידי ביטוי בשבוע אחד (איור 4), כדי להשיג פיתוח עקבית ומהימנה של סמנים שהותירה, נקודת הזמן שבועיים נבחרה. באיור 5 assay בעזרת יישום חד פעמית של פקד או פילוח ג'ין siRNA להיבדק לקידום ההתחדשות ריפוי הוא הפגין. במקרה זה, siRNA מיקוד היה USP10, deubiquitinase. Myofibroblasts פתולוגית הפגינו אדהזיה מוגבר באמצעות ההצטברות של αv-אינטגרינים הדבקויות מוקד21. שלנו מחקרים קודמים הראו כי αvβ1 וαvβ5 הם חשובים אינטגרינים שהותירה ב הקרנית הריפוי סטרומה7. אינטגרינים לאגד ECM שנמצא מחוץ לתא, יחד הם הם הפנימו. אינטגרין למביטה הוא ubiquitinated ושלח השפלה ליזוזום או התג אוביקוויטין יוסר על ידי deubiquitinase (דאב) ולא אינטגרין מיחזורו אל פני השטח של התא. גילינו כי עלייה בביטוי הגן של דאב (USP10) הגדילו את שיעור אוביקוויטין להסרת אינטגרין subunits β1 ו β5 המוביל הצטברות תוצאות של αv/β1/β5, על פני התא, עם הפעלת TGFβ עוקבות, אינדוקציה של סמני שהותירה7. נוקאאוט של USP10 בתרבות איבר הקרנית מנעו את המראה של סמנים שהותירה7. דוגמה של תוצאות אלה מוצג באיור5. כמו לעיל, α-SMA מנוצל כמו סמן myofibroblasts. אינדיקטור נוסף של הצטלקות הוא Fibronectin-EDA (FN-EDA), גרסה אחוי של FN המכיל RGD, αv אינטגרין מחייב תחום22,23,24. זה נקרא גם הסלולר FN (c-FN). הוא משמש סמן שהותירה מפתח כיוון FN-EDA אינה במחזור פלזמה אבל במקום זאת הוא רק הביע מופרש על ידי תאי תחת תנאים שהותירה25. ב- 5A איור- מוצג5 C immunostaining עבור α-SMA. בהשוואה ל- unwounded (איור 5A), ופצעו פלוס siRNA שליטה (איור 5B) הראה עלייה דרמטית בביטוי חלבונים α-SMA, בעוד תוספת של USP10 siRNA7 מופחת באופן דרמטי ביטוי stroma, אפיתל. באופן דומה, בהשוואה ל- unwounded (איור 5D), ופצעו פלוס siRNA שליטה (איור 5E) הדגים עלייה דרמטית בביטוי חלבונים fibronectin-EDA לעומת טיפול עם siRNA USP10 (איור 5F). פראפין עבור החלבון היעד (במקרה זה, USP10) נעשה שימוש כדי להדגים תמונות ציפורים מוצלחת7. בנוסף, ביצוע לרביעיית-PCR יכול להבטיח נוקאאוט גנטי ברקמה או גם כדי assay שהותירה סמנים אחרים7. ImageJ ניתן לכמת האות stroma בלבד או אות סה כ (איור 5G). לקרנית לפחות 3 עבור כל תנאי נבדק אמור לשמש לכמת immunostaining כדי להפיק מובהקות סטטיסטית כפי יש המוצגת כאן ואנו שפורסמו קודם לכן7. לחלבונים אחרים כי כבר מנוצל באופן שגרתי עבור סמני שהותירה הם קולגן III ביטוי ועלייה אינטגרין ביטוי1,26.

איור 6, השימוש של ex-vivo קרנית תרבות הוא הפגין כמו assay טוקסיקולוגיה. בניסוי זה, קרניות היו גם שמאל unwounded (איור 6A), פצועים (איור 6B), או פצועים ו שטופלו 10 מיקרומטר Spautin-127, אשר נוספה למדיה תרבות תא להגדלת פרקי זמן לפני השטיפה החוצה ( איור 6C-6F). Spautin-1 הוא הסם הלא ספציפית מטרות USP1027. בגלל ההצלחה שלנו עם USP10 siRNA, טיפול Spautin נבדקה יעילות במניעת צלקות. בניגוד siRNA, Spautin בריכוז זה היה רעיל הרקמה. הגדלת זמן עם Spautin-1 בתרבות מנעה epithelialization מחדש וכתוצאה מוות תאי איכותי, מטריצה לא מאורגן, סטרומה וקואלות רומז כי Spautin-1 אינו מקדם ריפוי הריכוז לבדיקה. מבחני היסטולוגית רגיל יכול להיות מועסק לכמת התפשטות תאים או אפופטוזיס.

Figure 1
איור 1 : חתך רוחב של העין האנושית עם נוף המורחב של הקרנית. יונקים ועופות, בהיסטולוגיה ישנם חמש שכבות נפרדות: אפיתל של באומן ממברנה, משתית, של Decement ממברנה, אנדותל28,29. כל יונקים אחרים, הממברנה של באומן אינו גלוי בהיסטולוגיה. ברמת שידור אלקטרון מיקרוסקופיות, קרום המרתף הוא ציין הפרדת את אפיתל הקרנית ואת משתית ב כל לקרנית, כולל אלה בעלי הממברנה של באומן. ממברנה של באומן ללא פגע או קרום המרתף המפריד בין האפיתל של stroma הוא הכרחי כדי למנוע הצטלקות של כל היונקים. התמונה הודפס מחדש באישור של AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תרשים של האירועים הסלולר להוביל הצטלקות הקרנית. דיאגרמה זו מתארת האירועים הבסיסיים נפרשים הקדמי הקרנית לאחר פציעתו. תיאור (A) של האפיתל, קרום המרתף, משתית את התאים השבתה הדרגתית מוטבע stroma, כלומר, keratocytes. (B) מתארת המשולש האדום פצע, אשר יכול להיות מכני, אולקוס, וירוס, או זיהום מתמשך. (ג) לאחר פציעתו, באופן אשר של באומן או קרום המרתף נפרצה, התאים סביב apoptose הפצע. ( Eו-D ) תזרים של תאים לאכלס מחדש את הפצע של תושב keratocytes או מח עצם, נגזר fibroblasts ומעבר fibroblasts מופעל או ישירות לתוך myofibroblasts. Myofibroblasts פתולוגי (F) דוגל אלה יוצרים ללולאה autocrine של הפעלת TGFβ הפרשת מטריקס שהותירה לא מאורגן, המקדם אובך הקרנית היווצרות צלקת. פצע נרפא regeneratively, myofibroblasts מופיעים אך יש apoptosed29,6,30רקמה בריאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : קיבול ועיבוד לקרנית לתרבות איברים. חזיר (A) עיניים מתקבלים עם מכסים כדי להגן על הקרנית במהלך המשלוח. (B) תמונה של כדור הארץ לאחר הסרת רקמות. (ג) תמונה של trephine 6 מ מ. (ד) Wounding של הקרנית המרכזית עם trephine. (E) תמונה של הקרנית נטען לאחר הסרת מהגלוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : רקמת הקרנית לאחר פציעתו. ניתוח Immunohistological של unwounded (בקרה) או קרניות פצועים. חזיר לקרנית עזב unwounded (בקרה) או פצועים. מקטעי רקמת היו immunostained עם נוגדן ל אקטין שריר חלק-אלפא (α-SMA) לזיהוי myofibroblasts. (A ו- B) שליטה, unwounded. (C ו- D) פצועה ו קבוע ב 6-אייץ ' פוסט-ופצעו. אפיתל הוא הוסר (חץ). (E ו- F) פצועה ו קבוע ב 6 ימים שלאחר ופצעו. משתית יש מלא- ולאחר האפיתל יש המצמיח (ראש חץ). נציג myofibroblasts מופעל מסומנים באמצעות כוכביות (*). (G, H) נמוכה הגדלה תמונות של α-SMA immunostaining 2 שבועות לאחר ופצעו: α-SMA (אדום), דאפי (כחול). תמונות נלכדו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף/brightfield עם מצלמת CCD. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (A, C, E); 50 מיקרומטר (B, D, F); מיקרומטר 200 (G, H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . בדיקת משובי סוכני ריפוי. חזיר לקרנית היו גם (A ו- D) unwounded (בקרה), (B ו- E) נפצעו, מטופלים עם שליטה siRNA, או (C ו- F) פצועים ו שטופלו USP10 siRNA. Immunostaining עבור (A-C) α-SMA או (D-F) Fibronectin-EDA. לאחר הטיפול עם USP10 siRNA, α-SMA צומצם על ידי קיפול ± 0.6 2.2 * * * p < 0.001 וקיפול ± 1.2 FN-EDA 3.3 * * p < 0.01. תמונות נלכדו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף/brightfield עם מצלמת CCD. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (G) הקרנית סטרומה מכתים כפי לכמת על-ידי ImageJ. מובהקות סטטיסטית מחושב על ידי חד-כיווני אנובה עם המבחן של Bonferroni. איור היה מותאם באישור גילספי et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : בדיקות סוכנים השפעות על reepithelialization - מחקרים הרעלים. Immunostaining עבור α-SMA. חזיר לקרנית היו unwounded (א), (B) נפצעו. (C-F) קרנית ושוטר מודגרות עם 10 מיקרומטר Spautin-1. המדכא היה נשטף החוצה והוא הוחלף על ידי מדיה לאחר (ג) 2 ימים, (ד) 4 ימים (E) 6 ימים, (F) 14 ימים. כל השינויים בתקשורת במהלך תקופת הדגירה כללו Spautin כמצוין. לקרנית כל היו קבועים, המוטבעות פרפין לאחר 2 שבועות בתרבות. תמונות נלכדו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף/brightfield עם מצלמת CCD. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מודל לימוד ריפוי הפצע בסביבה תלת-ממד מרובדת טבעית. השימוש של תרבות איברים כמו ביניים בין תרבית תאים ולימודי ויוו מפחיתה באופן משמעותי את עלויות, כמו גם הליכי הפחתת בבעלי חיים. דגמי תלת-ממד אחרים להיות היתרון הגדול לשדה כולל עצמי סינתזה קולגן ג'לים זני העיקרי fibroblasts הקרנית האנושית2 או תאים אלה אותם מוטבע בתוך ג'ל מסיבים מהחי collagens31. מערכת מודל של התרבות איברים שימושי במיוחד עבור בדיקות סוכני ריפוי בשם מאז הפצע הוא מקומי, לפיכך יש שוליים ברורים בין הפצועים ונפצעו הלא רקמת הקרנית באותו (איור 4). בנוסף, פצע trephine מכני מאפשר גישה ישירה אל stroma, וזה מצוין עבור ניהול של siRNAs לתוך הפצע (איור 5). למרות שהיא לא מוצגת כאן, התמרה חושית ויראלי לתוך רקמות הקרנית בתרבות איבר היה גם הפגינו32,33,34. תמורה נוספת של assay הזה יהיה להדביק את הקרנית עם מבנה הכתב עניין ותמונה גנים בזמן אמת לאחר פציעתו. מבחינת תרגום ללימודים ויוו, הליך זה זהה יכול להתבצע ארנבים35 , ולכן איברים תרבות על האדם, חזיר, או ארנב לקרנית ניתן להשוות תוצאות ויוו. מניסיוננו, הנתונים בידינו באמצעות מודל תרבות איברים עם טיפול siRNA יש לתרגמו דומה ממצאים ויוו (נתונים שלא פורסמו). מאז קרניות תרבות איברים חסרים להערכת limbal תפקודית, דמעות, ו aqueous הומור, כל חוקר להעריך אם זה יהיה מודל שימושי עבור המחקרים שלהם. תושב ההפעלה של תאים חיסוניים הוכח, אבל המקבילה המדויקת ללימודים ויוו עדיין אינו ברור1.

צעד המפתח בפרוטוקול זה לא לחדור את הקרנית על ידי ופצעו עמוקה מדי. זה יהיה ברור כמו הנוזל לחדר הקדמיות ידלוף במקרה זה. במקרה זה, העולם צריך להיות מושלך. כדי לייצר פצע אפילו מכני, לאחוז את שפתו של הרקמה במתחם בתוך אזור trephined עם forcep ולאחר מכן הזז את הלהב כירורגי מקביל פני הקרנית לחתוך את הרקמה בתחומי trephine הפצע. פני הקרנית לא צריך לייבש ולכן אנו ממליצים כי לאחר ביצוע את הפצע, חיתוך הקרנית מן העולם, מקום פני הקרנית למטה PBS עד התערובת אגר בטמפרטורה הנכונה. מוודא אגר זה, לא חם מדי יימנע נזק אנדותל.

מגבלה של מודל זה הוא השימוש trephine כדי לייצר פצע לא אחידה, ניתן לשכפל באופן זהה קרנית קרנית לעומת לייזר המושרה פצעים36. עם זאת, באופן טבעי המתרחשים הפצעים אינם שקולים הכל לעומק, גוף גדול של נתונים מראים כי כל הפרה של קרום המרתף יוצר ערפל ופיתוח myofibroblast ב stroma, ואילו מוביל התחדשות של קרום המרתף פחתה37,וצלקות38,39. מודל תרבות זה חזיר איברים הקרנית מעסיקה פצע חמור שבו קרום המרתף יוסר בתוך האזור של trephine. הפיתוח של myofibroblasts, סמני שהותירה stroma המצמוץ באופן עקבי, הפארמצבטית מושגת בעזרת מודל המערכת. צביעת אפיתל מסוימים מתבטא בדרך כלל זה מכהה ב פצועים ואף המצמיח האפיתל. זה הוכח ב דוחות אחרים תרבות איברים הקרנית40 אך נעדרו ב לקרנית רוב ויוו עכבר, ארנב מחקרים41,42. עם זאת, מחקר שבוצע במודל הכלבי ויוו הפגינו חזקה אפיתל α-SMA מכתים בתוך האפיתל לאחר ופצעו43. SiRNA שפירסמה ריפוי רגנרטיבית מחקרים שלנו משמעותי גם מופחת זה immunostaining אפיתל, רומז כי האפיתל עשוי להיות בתהליך החובשים (שהותירה צלקות) כאשר זה מתחדש בתרבות איבר. בנוסף, העדרו של נוגדן ראשוני בפרוטוקול ההגדלה של הקרנית פצועים כתוצאה העדר מוחלט של צביעת7 רומז immunostaining הוא ספציפי. מקטעים קפואים (לא מוצג) היו דומים הפרפין מקטעים בהקשר זה. עם זאת, כי הרקע קלה אבל משתנה מכתים בתוך האפיתל, המעבדה שלנו יש רק לכמת ההכתמה סטרומה, אשר מופיע ללא רקע היסטולוגית יש בעיות7.

אם ופצעו את הקרנית האנושית, קבלת לקרנית לא רגיל להשתלה במקום גלובס מלא עשוי להיות חסכוני יותר40. במקרה זה, פצוע הקרנית ללא הסיוע של הלחץ המוענקת על ידי כדור הארץ. אסטרטגיות ופצעו נוספים עשויים לכלול כוויות קרניות, אשר כבר בהרחבה מנוצל ויוו לייצר הצלקת42.

לסיכום, היתרונות של מערכת זו על פצע 3D רקמת ריפוי assay הוא הפארמצבטית שלה חיסכון בעלויות עם צרכים ציוד סטנדרטי בלבד, שהופך אותו משאב מצוין להתבוננות לכימות את ההשפעות של סוכנים על רקמת ריפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH-NEI R01 EY024942, מחקר כדי למנוע עיוורון, בצפון לרפואה אוניברסיטת בלתי מוגבלת וקרנות מחקר, ואת מחוז אריות 20-י' מיקרוסקופ וניתוח תמונה של פרפין סעיפים בוצעו בתוך ליבת מיקרוסקופ, הכנת שקופית היסטולוגית בוצעה Biorepository, פתולוגיה הליבה בבית הספר לרפואה של Icahn במעמד הר סיני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

רפואה גיליון 144 קרנית Scarring פיברוזיס Myofibroblast Ex-vivo תרבות איברים
Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro, N., Gillespie, S. R.,… More

Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter