Summary
전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Abstract
각 막은 상처 치유를 공부 하는 모델 시스템으로 광범위 하 게 사용 되었습니다. 능력을 생성 하 고 2 차원 (2D)과 3 차원 (3D) 문화에 기본 포유류 세포를 활용 풍부한 정보 뿐만 아니라 각 막 생물학에 대 한 뿐만 아니라 상처 치유, myofibroblast 생물학, 그리고 일반적으로 흉터에 대 한 발생 . 프로토콜의 목적은 myofibroblast 개발, 흉터 특징을 측정 하는 분석 결과 시스템입니다. 우리는 돼지 눈을 사용 하는 각 막 기관 문화 비보 전 모델을 보여 줍니다. 이 앞쪽 keratectomy 상처, 세계에서 아직도 각 원형 블레이드는 판형 이라는 부상는. 앞쪽 각 막의 약 1/3의 플러그는 상피, 지하실 멤브레인와 스트로 마의 앞쪽 부분을 포함 하 여 제거 됩니다. 부상, 후 각 지구에서 잘라, 콜라겐/한 천 자료에 있으며 주민 섬유 아 세포에 의해 세포 증식과 세포 외 기질 분 비를 증가 시키기 위해 안정화 된 비타민 c 보충 세럼 무료 매체에 2 주 동안 경작. 앞쪽 기질에 myofibroblasts의 활성화 치료 각 막에 분명 하다. 이 모델은 상처 폐쇄, myofibroblasts과 거리, 그리고 독성 연구 개발 시험을 사용할 수 있습니다. 또한,이 시스템에서 유전자 최저에 대 한 지질 중재 siRNA transfection 작은 분자 억제제의 효과 테스트할 수 있습니다.
Introduction
상해, 외상, 또는 감염에서 발생 하는 각 막에 흉터 불투명도 및 영구적인 시력 상실을 쇠 약하게 될 수 있습니다. 따라서, 치료 적 개입에 대 한 대상으로 지정할 수 경로 식별 하는 중요 한 필요가 있다. 현재 치료 옵션 제한 되며 전 세계에 걸쳐 환자에 액세스할 수 있습니다 각 막 이식, 주로 이루어져 있다. 둘 다 (그림 1) 인간과 동물 각 차원에 대 한 이용 될 수 있다 고 3D 세포 배양 연구1,2. 인간 시체 각 막 이식에 적합 하지 않은 안구 은행 또는 중앙된 조직 은행 (국가 질병 연구 교환 (NDRI))에서 얻어질 수 있다 그리고 동물 눈은 도살 장에서 얻어질 수 있다. 기본 각 막 상피 세포, stromal 섬유 아 세포, 그리고 더 최근에, 내 피 세포, 절연 수 및 상처 치유에 대 한 이러한 조직에서 경작 그리고 독물학 연구3,,45. 눈부신 눈 질병의 분자 기준 이해의 중요성 뿐만 아니라 조직과 문화 1 차 셀 수의 접근이 했다 각 막 연구에 대 한 중요 한 모델 시스템을. 각 막 흉터 정상적인 각 막 투명 하 고 상처의 특정 유형을 만드는 불투명도 또는 fibrotic 흉터 (6에서검토)에 에이전트의 효과 테스트에 이상적입니다. 몇 가지 vivo에서 각 막 상처 치유 모델은 또한 광범위 하 게 이용 되어 상처 연구1. 덜 활용 되었습니다 전 비보 각 막 상처 치유 모델7,8 여기에서 설명 하는. 이 방법의 목표는 흉터 결과 3d 다세포 거리 제조 업체에 의해 특징을 계량 하는 ex vivo 모델 시스템 각 막.
24-72 h9내 닫습니다 각 막 상피 부상 하 일반적으로 상피의 지하실 멤브레인을 위반 하지 않습니다. 부상, 곧 후 상피의 가장자리에 세포 확산 하 고 상피 무료 표면 상피 장벽 기능을 다시 설정으로 이동 시작 합니다. 이 활동은 순차적으로 먼저 하 고, 상피 세포 대량10,11의 복구를 달성 하기 위해 외부 limbal 지역에 있는 선구자 세포의 나중 단계에서 각 막 기저 세포 증식의 활성화를 옵니다. 이러한 상처는 종종 흉터 없이 치료. 그러나, 종종 지하실 막 기질에 침투 상처 흉터 형성1발생 합니다. 각 막 실질 부상 후 기질 차별화 된 주민 stromal 세포 골 수에서 파생 된 fibrocytes12,,1314포함 한 여러 기원 세포로 채워집니다. Fibrotic 흉터 치료 상처에 myofibroblasts의 지 속성에 의해 특징입니다. 이러한 병 적인 myofibroblasts 보여 초점 유착, 수축 성 α-부드러운 근육 걸 (α-SMA) 스트레스 섬유와 세포 외 기질 (ECM)의 현지 활성화 integrins의 축적을 통해 증가 접착-압수 잠재성 변형 성장 인자-베타 (TGFβ). 엽 전환 (응급), 상피로 알려진 파생 된 상피 세포의 분화 형성6흉터에 기여할 수 있습니다.
부상 후 세포 분화 및 apoptosis 사이의 미묘한 균형이 있다. 혈소판 파생 된 성장 인자 (PDGF)과 눈물에서 TGFβ 상피 목욕 기질, 유도 myofibroblast 차별화, TGFβ 활성화의 지속적인된 autocrine 루프와 같은 성장 요인 지하실 멤브레인에 위반 때문에 그리고 비 조직적인된 거리 ECM15,16분 치료 상처에 myofibroblasts의 지 속성 안개 및 (그림 2) 각 막에 흉터를 촉진 합니다. 그러나, regeneratively 치유 상처 myofibroblasts 개발, 비록 그들은 apoptose 및 따라서 결 석 또는 치유 조직 (참조6,10검토)에서 크게 감소 된 수. 따라서, fibrotic 흉터에 대 한 연구를 적어도 부분 과도 한 myofibroblast 개발 또는 myofibroblast 지 속성17,18을 방지 하는 분자를 대상으로에 집중 했다. Myofibroblast 지 속성 특징 모든 조직19에 흉터와 거리 질병, 때문에 각 막 섬유 증의 일반적인 셀룰러 메커니즘 연구를 모델 시스템으로 유용할 수 있습니다.
우리의 모델 시스템에서 각 막 원통형 블레이드 라는 세계에 판형으로 부상입니다. 인간 돼지 각 중 하나는 6 또는 7 m m 판형;와 부상 수 있습니다 토끼 각 막에 대 한 6 m m 판형이 좋습니다. 돼지 막은 인간 각 막 크기에서 유사 합니다. 때문에 비용 효과적이 고 쉽게 사용할 수 있는 많은 수에서 돼지 각 기관 문화 정기적으로 사용 됩니다. 또한, 항 체 및 인간 반응 했다 siRNAs 돼지7cross-reacted 일관 되 게 있다. 부상, 후 각 막을 절단 하는 limbus로 전 세계에서 그대로 한 천/콜라겐 베이스에 탑재. 각 혈 청 무료 미디어에서 교양 플러스 섬유 아 세포 증식과 ECM 증 착20를 시뮬레이션 하기 위해 비타민 C를 안정화. 혈 청의 추가 없으며 성장 요인 유도 myofibroblast 형성7필요 합니다. 각 막은 정기적으로 고정 하 고 문화의 2 주 후 조직학에 대 한 처리. 유전자 최저, 또는 상처 치유에 에이전트의 결과 테스트, 상처는7 명이 후 상처에 siRNA로 대우 될 수 있다 또는 수용 성 에이전트 각각8미디어에 추가할 수 있습니다.
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Protocol
1. 기관 문화
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준비
- 다음과 같이 한 솔루션을 준비 합니다. 작은 술병에 준비 1% 한 천은 1 mg/mL 소 콜라겐 DMEM F12에 최대 20 mL. 뜨거운 접시에 끓여 야 가져와. 솔루션 50 mL 원뿔 튜브에 넣어. 응고에서 솔루션을 유지 하는 뜨거운 접시에 물 욕조에 튜브를 배치 합니다.
- 보충 세럼-무료 미디어 (SSFM) 재료의 테이블에에서 제공 된 구성에 따라 준비 합니다.
참고: 필요한 양의 대비해 SSFM 처리할 각 막의 수에 따라 달라 집니다. 보통 30 mL 4 각에 대 한 충분 한 매체 이다.
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해 부
참고: 절 개 후드 또는 화학 후드에이 단계를 수행 합니다. 눈은 여전히 지구를 보호 하기 위해 개별 가방에 부착 된 뚜껑 함께 제공 됩니다.- 에탄올 청소도 마 보드에 스트레이트에 지 외과 블레이드와 뚜껑에서 글로브를 제거 합니다. 칼 또는 작은 위 (그림 3A, 3B)를 사용 하 여 눈에서 과잉 지방 조직을 제거 합니다.
- 뚜껑에서 세계를 제거한 후 세계 뒤로 집게로 누른 즉시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 눈을 찍어. 신속 하 게 그것을 찍어 (100 mL 비 커)에서 10% 요오드에 3 배. 빨리 찍어 PBS (~ 100 mL 비 커, 자주 변경 PBS에서에서) 2 배.
- 깨끗 한 수건 이나 티슈 using, 원주는 판형으로 잘라 긴장 된 각 막 표면에 충분 한 압력으로 눈 랩.
참고: 각 막 접촉에서 수건 이나 티슈를 방지 하기 위해 주의.
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부상
- 6mm 판형을 사용 하 여 각 막의 중심을 상처. 전체 각 막 통해 전체 두께 상처를 만들지 않고 상피와 앞쪽 기질에 침투.
참고: 있는 피를 관통 하는 경우 새 액체 및 압력의 손실을 볼 수 있습니다. 이 경우에 눈을 폐기 해야한다. - 각 막의 중심에는 판형, 180 ° 시계 방향 및 시계 반대 방향으로 5 회전 x (방향 변경 때마다 그것은 것으로 계산 한 번) 상처를 깊게 하기 위해 가벼운 압력을 적용 하는 동안.
참고: 상처 이제 깊은 만큼 조직 플랩 집게의 쌍을 사용 하 여 해제를 허용 해야 합니다. 이 경우 반복 하지 않으면 1.3.2 단계. - 플랩 가장자리에서 들어올립니다. 동시에 다른 한편 또는 두 번째 사람 앞쪽 각 막 상처 여백 내에서 해제 하는 집게 계속 조직 버려야 하 세계에 평행 절단 블레이드를 사용 합니다. 이 단계의 결론에 원형 상처 (참조 그림 3 C, 3D) 각 막의 가운데에 위치 해야 합니다.
- 6mm 판형을 사용 하 여 각 막의 중심을 상처. 전체 각 막 통해 전체 두께 상처를 만들지 않고 상피와 앞쪽 기질에 침투.
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절단 및 전 세계에서 각 막 제거
- 조직으로 눈을 들고 있도록 각 막의 작은 절 개는 가장자리에서 1 m m 블레이드는 limbus 장기 문화에 포함 되어.
- 작은 사용 하 여, 날카로운가 위 절 개는 limbus를 그대로 유지 하는 각 막에 걸쳐 밀리미터 여백은 전세계 잘라 이전 단계에서 만든 액세스 합니다.
- 장착까지 PBS, 상처 면의 1 mL와 60 mm 접시에 막 내려 놓습니다.
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장착
- 따뜻한 온도 (약 25 ° C)에 한 천 온 다는 것을 확인 하십시오.
- 집게의 두 쌍, 내 피 쪽으로 각 막의 두 측면을 견디고 여 한 컵을 만듭니다. 찰 때까지 무 균 전송 피 펫을 사용 하 여 각 막에 따뜻하게 위로 한 솔루션을 추가 합니다.
- 후에 한 천 견고 (보통 대략 30-45 s) 신중 하 게 60 m m 플레이트 (그림 3E)으로 agar와 각 막 플립. 뚜껑으로 커버.
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부 화
- 37 ° c.에 5% CO2 limbal 국경에 공기 액체 인터페이스에서 각을 유지 하는 접시 SSFM의 4 개 mL를 추가 그 후 매일 24 시간 후 미디어를 새로 고침 합니다.
참고: 상처로 transfection를 수행 하는 경우 transfection 후 때까지 항생제를 생략 합니다. - 수 분을 유지 하기 위해 접시에 바른된 미디어에서 SSFM 1 방울을 추가 하 여 일단 매일 각 막 표면에 젖은. 이 위해, 인큐베이터에서 접시를가지고, 후드 아래 장소, 접시 뚜껑을 제거, 젖은 접시 살 균 피 펫을 사용 하 여에서 미디어와 표면, 다시 커버를 다시 인큐베이터에서.
- 유전자 최저, 유전자를 대상으로 상처를 치료 또는 공급 업체의 지침 (아래 참조)에 의하여 지질 중재 캐리어에 complexed은 siRNA를 제어.
- 믹스 5 µ L (50 pmol) 감소-혈 청 최소 필수 미디어의 50 µ L에 siRNA의 (예., Opti 메모리). 감소 된 혈 청 미디어의 50 µ L로 transfection 시 약의 혼합 2 µ L. 5 분이 앉아 보자 하 고 그들을 섞는다.
- 시 약/siRNA 혼합물에 감소-혈 청 최소 미디어의 200 µ L를 추가 합니다.
- 상처에 dropwise 플라스틱 및 3 h에 품 어.
- SiRNA는 접시에 미디어와 함께 각 막 표면에서 세척 한다. SSFM + 항생제 ( 재료의 표참조)를 부 화 미디어를 변경 합니다. 계속 언급 했 듯이 이전 인큐베이션 (단계 1.6.1-1.6.2).
- 37 ° c.에 5% CO2 limbal 국경에 공기 액체 인터페이스에서 각을 유지 하는 접시 SSFM의 4 개 mL를 추가 그 후 매일 24 시간 후 미디어를 새로 고침 합니다.
2. 조직학: 파라핀 섹션 및 Immunostaining
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조직 준비
- 후에 2 주 보육 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석, 담합, 전에 잘라 각 막 상처를 통해 반에 대 한 조직의 일부를 사용 하는 경우 이 반 또는 유일한 ¼ (중 하나는 충분 한 조직) 안정화 RNA 보호 시 약으로.
- 표준 절연 키트를 사용 하 여 RNA를 분리 하 고 qRT-PCR을 수행.
참고: 또는 상처 부분만 수 수 분리 하 고 유전자 발현에 대 한 테스트. - 다른 각 막의 조직 병리학 카세트에 놓고 실 온 (RT)에서 2-4 일에 대 한 정착 액 (10% 포 르 말린)에 잠수함.
- 파라핀이 표준 기술을 사용 하 여 부상된 각 막의 반 포함.
참고: 조직 단면 각 막의 단면을 생산할 예정 이다 있도록 부상된 각 막을 방향을 정하십시오.
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Immunostaining 3, diaminobenzidine (DAB)-3'를 사용 하 여
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주 1
- 레이블 적절 연필을 사용 하 여 슬라이드. 드 비운 에이전트 (2 변경, 각 10 분)와 함께 항아리에 슬라이드를 삽입 하 여 조직 paraffinize.
- 감소 하는 농도 (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 각 변경에 대 일 분)에서 에탄올으로 슬라이드를 전송 하 여 조직의 rehydrate.
- 시트르산 버퍼 (10 m m, pH 6.4) 5 분에 대 한 플라스틱 항아리에 슬라이드 microwaving antigen 검색을 수행 합니다. 처음에 50% 전력에서 5 분 주기. 구 연산 염 버퍼와 항아리를 리필 하 고 반복 합니다. 10 분 동안 식혀.
- PBS, 3 x 2 분을 씻어. 1% 트라이 톤 X-100 실시간 블록에서 PBS 10 분에 3% 정상 염소 혈 청 (NGS) 습 한 챔버에 RT에 1 h와 섹션 조직 permeabilize
- 1 차적인 항 체와 조직을 품 어 (1: 100 또는 공급자에서 알 수 있듯이) 3%에서 NGS 4 ° C (슬라이드 당 300 µ L)에서 하룻밤.
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주 2
- 린스 슬라이드 3 x PBST (PBS 플러스 1% 트윈 20), 2 분. 내 인 성 과산화 효소를 차단 하는 10 분 동안 3% H2O2 에 슬라이드를 배치 합니다. PBST, 3 x 2 분을 씻어. 섹션 3%에서 HRP 이차 항 체 (1: 250)을 품 어 RT에서 1 h NGS (슬라이드 당 300 µ L).
- 씻어 슬라이드 3 x PBST, 2 분. DAB 키트와 함께 슬라이드를 취급 합니다. 추가 300 µ L/슬라이드 3 분 세척에 대 한 dH2O 2 (빠른 딥) x 슬라이드.
- DH2O 2 (빠른 딥) x 슬라이드 20 미 세척을 위한 Hematoxylin와 counterstain. DH2O를 배치 하 여 20 s. Dehydrate 조직에에서 20 미 린스 청소법 에이전트와 얼룩 (50%, 70%, 100%, 100%, 모든 빠른 딥) 에탄올의 농도 증가에 슬라이드.
- 슬라이드 10-20 분에 대 한 후드 종이 타월에 건조.
- 미디어, coverslip 커버 장착 1 방울을 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다. 레이블 및 실시간 저장
- 현미경 슬라이드를 이미지 하 고 계량 한 덩어리 신호 ImageJ7 (섹션 4 참조).
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주 1
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Immunostaining: 형광
- 주 1 단계 2.2.1에서에서 설명한 단계를 수행 합니다. 주2 다음 단계를 수행 합니다.
- 린스는 2 분 동안 PBST에서 3 x 슬라이드. 3%에서 이차 항 체 fluorophore 태그 섹션을 품 어 NGS (1: 200) 실시간에서 1 h
- 2 분 PBST에 3 배를 씻어. 슬라이드는 coverslip로 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 설치 미디어와 커버의 1 방울을 사용 하 여 탑재 합니다. 형광 이미징까지 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분이 게에 대 한 후드 종이 수건에 건조.
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이미지 J를 사용 하 여 정량화
- ImageJ DAB 정량화를 얼룩이 지기에 대 한 필요한 플러그인을 포함의 "피지" 버전을 다운로드.
- 피지와 선택에서 이미지를 열고 이미지 → 색상 → 색상 Deconvolution.
- "H 소량" 얼룩으로 선택한 다음 확인을 클릭 합니다. 3 새로운 이미지 표시 됩니다. 만 한 덩어리 얼룩이 포함 된 이미지를 선택 합니다.
- Stromal 얼룩만 계량, DAB 이미지에서 상피를 제거 하 ImageJ 지우개 기능을 사용 합니다.
- 선택 → 분석 측정 (또는 Ctrl + M) 값을 기록 하 고.
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Representative Results
Immunohistochemistry 기본 분석 결과 활용은 전의 성공을 분석 하 비보 상처 치유 실험. 그림 4 에 상피 및 제어 조직 (그림 4A, 4B)에서 앞쪽 기질 보여 주며. 6 시간 후에 부상, 상피 (그림 4C, 4d)에 결 석 했다. 6 일 예상 대로 부상 후 상피 (4E 그림, 4 층) regrown 했다. 이 조직 알파-부드러운 근육 걸 (α-SMA), 중 식 myofibroblasts 특징에 대 한 immunostained 이었다. 색도계 DAB 기판에 의해 감지 기질에서 α-SMA immunostaining에 극적인 증가 있다. 또한 상피 반응성 응급7 전환 하는 것을 제안할 수 있습니다 증가 했다 (토론 참조). 해체는 상피와 기질에 분명 했다. DAB 대신 형광 immunostaining와 낮은 확대율에서 부상 실험 (그림 4G, 4h) 표시 됩니다. 상처 여백 후부 기질을 앞쪽에서 활성 myofibroblasts 그라데이션 뿐만 아니라 표시 됩니다.
거리 표시는 거리 표시의 일관 되 고 안정적인 개발을 1 주일 (그림 4)에 의해 표현 하지만 2 주 시간 포인트 선정 되었다. 그림 5 에서 재생 치료 증진을 위한 테스트 제어 또는 유전자를 대상으로 siRNA의 일회성 응용 프로그램을 사용 하 여 분석 결과 보여 줍니다. 이 경우에, 대상 siRNA USP10는 deubiquitinase에 대 한 했다. 병 적인 myofibroblasts 초점 유착21αv-integrins의 축적을 통해 증가 접착을 설명 했다. 우리의 이전 연구는 αvβ1와 αvβ5는 중요 한 거리 integrins 각 막 실질 치유7에 보였다. Integrins는 세포 밖에 서 ECM 바인딩할 하 고 함께 그들은 내 면 됩니다. 내 면된 integrin ubiquitinated 이며 저하는 리소좀에 대 한 전송 또는 유비퀴틴 태그 deubiquitinase (DUB)에 의해 제거 되 고는 integrin은 세포 표면에 재활용. 우리 DUB (USP10)의 유전자 발현 증가 integrin 소 단위 β1와 β5에서 유비퀴틴 제거의 속도 증가 했다 발견 αv/β1/β5, 세포 표면에, 후속 TGFβ 활성화와 유도의 결과 축적으로 이어지는 거리 표시7. 각 막 장기 문화에 USP10의 최저 거리 마커7의 외관을 방지. 이러한 결과의 예는 그림 5에 표시 됩니다. 위에서 α-SMA는 활용 myofibroblasts에 대 한 표식으로. 흉터의 또 다른 지표는 RGD, αv integrin 바인딩 도메인22,,2324를 포함 하는 FN의 스플라이스 변종 Fibronectin EDA (FN-EDA) 이다. 그것은 또한 세포 FN (c-FN) 불린다. 그것은 주요 거리 표식 역할 때문에 FN EDA 플라즈마 순환에 아니다 하지만 대신만 표현 거리 조건25에서 세포에 의해 분 비. 그림 5A-α-SMA를 위한5 C immunostaining 표시 됩니다. Unwounded (그림 5A)에 비해, 제어 siRNA (그림 5B) 플러스 부상 높아졌습니다 극적인 α-SMA 단백질 표정, 반면 USP10 siRNA7 의 추가 극적으로 감소 된 기질에 식 고 상피입니다. 마찬가지로, unwounded (그림 5D)에 비해, fibronectin EDA 단백질 식 USP10 siRNA (5 층 그림) 치료에 비해 극적인 증가 입증 (그림 5E) 제어 siRNA 플러스 부상. Immunohistology (이 경우 USP10)에서 대상 단백질에 대 한 성공적인 최저7를 설명 하기 위해 사용 되었다. 또한, qRT-PCR을 수행 하는 것은 유전자 최저 조직에서 또는 또한 다른 거리 표시7에 대 한 분석 결과를 드릴 수 있습니다. ImageJ는 계량만 기질에 신호 또는 총 신호 (그림 5G)를 사용할 수 있습니다. 테스트할 각 조건에 대 한 적어도 3 각 우리가 여기에 표시 하 고 이전7출판 통계적 의미를 생성 하는 immunostaining 척도를 사용 해야 합니다. 거리 표시에 대 한 정기적으로 활용 된 다른 단백질은 콜라겐 III 표현과 integrin 식1,26증가.
그림 6, ex vivo 각 막 문화의 사용은 독물학 시험으로 보여 줍니다. 이 실험에서 각 했다 왼쪽 (그림 6A) unwounded, (그림 6B), 부상 또는 부상 및 치료 10 µ M Spautin-127, ( 에 밖으로 세척 하기 전에 기간을 높이기 위한 세포 배양에 추가 했다 그림 6 c-6F). Spautin-1 비 특히 USP1027대상 약물 이다. 성공 때문에 우리의 USP10 siRNA와, Spautin 치료 흉터 예방 효과 대 한 테스트를 했다. SiRNA, 달리이 농도에서 Spautin 조직에 독성 했다. 문화에서 Spautin-1 시간 다시 epithelialization를 방해 하 고 질적 세포 죽음, 비 조직된 매트릭스 및 Spautin-1의 농도 분석에서 치유 촉진 하지 제안 stromal 그들. 표준 조직학 분석 실험 세포 증식 또는 apoptosis 척도를 사용할 수 있습니다.
그림 1 : 각 막의 확장 된 보기와 인간의 눈의 횡단면. 영장류와 닭, 조직학에서는 5 가지 레이어: 상피, 보우만 막, 기질, Decement의 막, 및 endothelium28,29. 모든 다른 포유류에서 보우만 막 보이지 않습니다 조직학. 전송 전자 현미경 수준에서 지하실 멤브레인 분리 각 막 상피 그리고 stroma는 보우만 막에 그들을 포함 하 여 모든 각에서 관찰 됩니다. 그대로 보 먼의 막 또는 기질에서 상피를 분리 하는 지하실 멤브레인은 모든 포유류에서 흉터를 방지 하는 데 필요한. 이미지는 AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm)에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 각 막 흉터로 이어질 셀룰러 이벤트의 다이어그램. 이 다이어그램 부상 후 앞쪽 각 막에 전개 하는 기본 이벤트를 보여 줍니다. (A) 상피, 지하실 막, 기질 및 기질, 즉, keratocytes에 포함 된 무부하 셀의 묘사. (B) 기계 수 있는 상처, 궤 양, 바이러스, 또는 지속적인 감염을 묘사 하는 빨간 삼각형. (C)에 부상 후 보 먼의 또는 지하실 막 돌파 되는, 상처 apoptose 주위 세포. (D 및 E) 셀의 유입 주민 keratocytes 또는 골 수에서 파생 된 섬유 아 세포와 활성화 된 섬유 아 세포 또는 myofibroblasts로 직접 전환에서 상처를 다시 채웁니다. (F)이이 점착 병 적인 myofibroblasts TGFβ 활성화는 autocrine 루프 및 각 막 안개 및 흉터 형성을 촉진 하는 비 조직적인된 거리 매트릭스의 분 비를 만듭니다. Regeneratively 치료 상처에 myofibroblasts 나타나지만 치료 조직6,,2930에 있는 apoptosed. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 수신 및 처리 기관 문화에 대 한 각. (A) 돼지 눈으로 받은 운송 중 각 막을 보호 하기 위해 뚜껑. (B) 조직 제거 후 글로브의 이미지. (C)는 6 m m 판형의 이미지. (D) Wounding는 판형으로 중앙 각 막의. (E) 지구에서 제거 후 탑재 된 각 막의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 각 막 직물 부상 후. Unwounded (제어) 또는 부상된 각 막의 Immunohistological 분석. 돼지 각 unwounded (제어) 왼쪽 또는 부상 했다. 조직 섹션 했다 myofibroblasts 식별 하기 위해 알파-부드러운 근육 걸 (α-SMA)에 항 체로 immunostained. (A 와 B) 제어, unwounded. (C 와 D) 운디드 6 h 후 부상에 고정. 상피는 제거 (화살표). (E 와 F) 운디드 6 일 후 부상에 고정. Stroma는 가득-고 상피는 (화살표 머리)를 regrown. 대표 활성화 myofibroblasts는 별표 (*)로 표시 됩니다. (G, H) 낮은 α-SMA immunostaining의 확대 이미지 부상 후 2 주: α-SMA (빨강), DAPI (파란색). 이미지는 CCD 카메라와 직 립 형광/명시 야 현미경을 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대 = 100 µ m (A, C, E); 50 µ m (B, D, F); 200 μ (G, H) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 재생 치료 에이전트 테스트. 돼지 각 중 하나를 했다 (A 와 D) (제어), unwounded (B E) 부상 및 제어 siRNA 치료 또는 (C 와 F) 부상 USP10 siRNA로 치료. (A-C) Immunostaining (D-F) 또는 α-SMA Fibronectin에 다. 치료 후 USP10 siRNA와, α-SMA 2.2 ± 0.6 배 감소 했다 * * * p < 0.001와 FN EDA 3.3 ± 1.2 배 * * p < 0.01. 이미지는 CCD 카메라와 직 립 형광/명시 야 현미경을 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대 ImageJ로 정량 50 µ m. (G) 각 막 실질 얼룩 =. 통계적 의미는 일방통행 ANOVA Bonferroni의 테스트에 계산 됩니다. 그림 길 허가 적응 되었습니다 외.7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : Reepithelialization-독성 연구에 대 한 효과 대 한 에이전트 테스트. Α-SMA를 위한 Immunostaining입니다. 돼지 각 (A) unwounded, (B) 부상 했다. (C-F) 각 막 부상 되었고 10 µ M와 incubated Spautin-1. 억제 물 씻 고 (C) 후 2 일, (D) 4 일, (E) 6 일, (F) 14 일 미디어로 대체. 인큐베이션 기간 동안 모든 미디어 변경 된 Spautin를 포함 됩니다. 모든 각 고정 하 고 2 주 후에 문화 파라핀에 포함 된 했다. 이미지는 CCD 카메라와 직 립 형광/명시 야 현미경을 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 상처 치유는 자연 층 화 3D 환경에서 공부에 대 한 모델을 설명 합니다. 세포 배양 그리고 vivo에서 학문 사이 중간 장기 문화의 사용 비용 뿐만 아니라 살아있는 동물에 감소 절차에 크게 줄일 수 있습니다. 다른 3D 모델 되었습니다 자체 콜라겐 젤 기본 인간 각 막 섬유 아 세포2 또는이 같은 세포에서 만들어진 합성을 포함 하는 필드에 큰 혜택의 임베디드 젤 동물 파생 collagens31에서 만든. 기관 문화 모델 시스템 상처 지역화 된 때문에 따라서 같은 각 막 (그림 4)에 상처 및 부상 비 조직 사이 명확한 한계는 putative 치유 에이전트를 테스트 하기 위해 특히 유용 합니다. 또한, 기계적 판형 상처 관리 siRNAs의 상처 (그림 5)에 대 한 뛰어난 기질, 직접 액세스할 수 있습니다. 그것은 여기에 표시 되지, 비록 기관 문화에서 각 막 조직에 바이러스 성 변환 시연된32,,3334도 되었습니다. 이 분석 결과의 다른 순열 부상 후 실시간으로 관심과 이미지 유전자 발현의 리포터 구조와 각 감염 하는 것입니다. Vivo에서 연구를 번역, 측면에서 토끼35 따라서 기관 문화 인간, 돼지,이 동일한 절차를 수행할 수 있습니다 또는 토끼 각 막을 vivo에서 결과를 비교할 수 있습니다. 우리의 경험에서 우리가 siRNA 치료 기관 문화 모델을 사용 하 여 얻은 데이터는 비슷한 결과 vivo에서 (되지 않은 데이터)으로 번역 됩니다. 이후 장기 문화 각 기능 limbal 맥 관 구조, 눈물, 그리고 액 부족, 각 수 사관이 그들의 연구에 대 한 유용한 모델 될 것입니다 평가 해야 합니다. 면역 세포의 주민 활성화 입증 되었습니다, 하지만 vivo에서 학문에 정확한 평행선은 아직 분명1.
프로토콜에서 핵심적인 단계 너무 깊게 부상에 의해 각 막에 침투 하지 않습니다. 이 앞쪽 챔버 유체는이 경우에 누출 것입니다 명백한 될 것입니다. 이 경우, 세계는 무시 해야. 심지어 기계적 상처를 생산 하는 forcep으로 trephined 지역 내의 demarcated 조직의 입술을 다음 외과 블레이드 판형 상처의 경계 내에 조직을 떨어져 잘라 각 막 표면에 평행 하 게 이동. 각 막 표면 건조 하지 한다 따라서 우리는 상처를 만들고 세계에서 각 막 밖으로 절단 후 놓고 각 막 뒤집어 PBS에 한 천 혼합물은 정확한 온도에 것이 좋습니다. 만들기는 agar는 너무 뜨거운 내 피 손상을 방지 합니다.
이 모델의 한계 상처를 생산 하는 판형의 사용도는 동일 하 게 막에서 각 막에 레이저 유도 상처36에 비해 복제할 수 없습니다입니다. 그러나, 자연스럽 게 발생 상처 깊이에 모두 해당 되지 않습니다 및 데이터의 큰 시체는 지하실 멤브레인에 위반 myofibroblast 개발 및 연 무에에서 생성 기질, 지하실 막의 재생을 리드 하는 반면 제안 흉터37,,3839감소. 이 돼지 막 기관 문화 모델 고용 심각한 상처는 판형의 영역 내에서 지하실 막이 제거 됩니다. 각 막 stroma에 myofibroblasts과 거리의 개발 일관 되 고 재현성이 모델 시스템을 사용 하 여 달성. 일부 상피 얼룩은 일반적으로 분명 부상과 regrown 상피에 어둡게 하는. 이 다른 각 막 기관 문화 보고서40 에서 입증 되었습니다 하지만 vivo에서 마우스에서 대부분 각 막에 결 석 하 고 연구41,42토끼. 그러나, vivo에서 개 모델에서 수행 하는 연구 강한 상피 α-SMA43부상 후 상피에 얼룩을 보여주었다. SiRNA는 또한 상당히 우리의 연구에 재생 치료 감소 상피 응급 (fibrotic 흉터)를 겪고 있을 수 있습니다 제안,이 상피 immunostaining 때 장기 문화에 regrows. 또한, 부상된 각 막의 얼룩 프로토콜에는 기본 항 체의 누락 결과7 제안 하는 immunostaining는 특정 얼룩의 총 부재. (표시 되지 않음) 고정된 섹션 파라핀 섹션 이와 유사 했다. 그러나, 때문에 상피에 얼룩 약간 있지만 변수 배경 우리 실험실은만 계량 stromal 얼룩,7을문제는 조직학 배경이 나타납니다.
인간의 각 막 부상 하는 경우 취득 하지 전체 글로브 대신 식을 사용 하는 각 더 많은 비용 효율적인40있을 수 있습니다. 이 경우에, 각 막 세계에서 제공 하는 압력의 도움 없이 부상 될 것입니다. 추가 부상 전략 광범위 하 게 이용 되었습니다 흉터42를 생산 하는 vivo에서 각 막 화상을 포함할 수 있습니다.
요약 하면, 3 차원 조직 상처 치유 분석 결과 대 한이 시스템의 장점은 표준 장비 필요, 그것을 관찰 하 고 조직 치유에 에이전트의 효과 측정을 위한 훌륭한 자원 만들기의 재현성 및 비용 절감입니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH NEI R01 EY024942, 실명 방지, 북부 의료 대학 무제한 연구 자금, 연구에 의해 지원 되었다 및 라이온 스 지구 20 Y. 현미경 검사 법 및 파라핀 섹션의 이미지 분석 현미경 코어에서 수행 했다, 조직학 슬라이드 준비 Biorepository 마운트 시 나이에서 아이 칸 의학 학교에서 병 리 코어에서 수행 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100x |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100x |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100x |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100x |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200x |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10 mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera |
References
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
- Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
- Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
- Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
- Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
- Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
- Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
- Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
- Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
- Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
- Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
- White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
- Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
- Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
- DelMonte, D. W., Kim, T.
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
- Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
- Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
- Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
- Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
- Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
- Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
- Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).
