Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo sårtilheling hornhinnen Organ kultur modell for studier

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll for en ex vivo hornhinnen orgel kultur modell nyttig for sårheling studier er beskrevet. Modell systemet kan brukes til å vurdere effekten av agenter å fremme regenerativ helbredelse eller medikament toksisitet i organisert 3D flercellet miljø.

Abstract

Hornhinnen er brukt mye som en modell for å studere sårtilheling. Muligheten til å utvikle og anvende primære pattedyrceller i to-dimensjonale (2D) og tre-dimensjonale (3D) kultur har generert et vell av informasjon ikke bare om hornhinnen biologi, men også om sår helbredelse, myofibroblast biologi, og arrdannelse generelt . Målet med protokollen er en analysen for kvantifisere myofibroblast utvikling, som preger arrdannelse. Viser vi hornhinnen orgel kultur ex vivo modell med gris øyne. I denne fremre keratectomy sår, er hornhinner fortsatt i verden såret med en sirkulær blad kalt en trephine. En plugg av ca 1/3 av fremre hornhinnen fjernes inkludert epitel, kjelleren membranen og den fremre delen av stroma. Etter såret, hornhinner kuttet fra globe, montert på en kollagen/agar base og kultivert for to uker i supplert serum gratis medium med stabilisert vitamin C for å øke celle spredning og ekstracellulær matrix sekresjon av bosatt fibroblaster. Aktivering av myofibroblasts i fremre stroma er tydelig i helbredet hornhinnen. Denne modellen kan brukes til analysen såret nedleggelse, utvikling av myofibroblasts og fibrotiske markører og toksikologi studier. I tillegg kan effekten av lite molekyl hemmere samt lipid-formidlet siRNA transfection for genet knockdown testes i dette systemet.

Introduction

Arrdannelse i hornhinnen som følge av skade, traumer eller infeksjon kan føre til ødeleggende grumsete og permanent synstap. Dermed er det et kritisk behov for å identifisere veier som kan være mål for terapeutisk intervensjon. Gjeldende handling valgmulighetene er begrenset, og består hovedsakelig av hornhinnen transplantasjoner, som ikke er tilgjengelig for pasienter over hele verden. Både menneskelige (figur 1) og dyr hornhinner kan utnyttes for 2D og 3D cellekultur studier1,2. Menneskelige cadaver hornhinner uegnet for transplantasjon kan fås fra øye banker eller sentralisert bankene (nasjonal sykdom forskning Interchange (NDRI)), og dyr øyne kan fås fra en abattoir. Primære hornhinnen epitelceller, stromal fibroblaster og mer nylig endotelceller, kan være isolert og kultivert fra disse vev for sårheling og toksikologi studier3,4,5. I tillegg til viktigheten av å forstå molekylær grunnlag av blinding øyesykdom, har tilgjengelighet av vev og evnen å kultur primære celler gjort hornhinnen en viktig modellsystem for studier. Hornhinnen er ideelle for å teste effekten av agenter på arrdannelse normalt hornhinnen er gjennomsiktig og visse typer sår opprette tetthet eller fibrotiske arr (omtalt i6). Flere i vivo hornhinnen sår helbredelse modeller har også vært mye benyttet for arrdannelse studier1. Mindre utnyttet er ex vivo hornhinnen sår helbredelse modell7,8 som er beskrive i detalj her. Målet med denne metoden er å tallfeste arrdannelse resultater preget av fibrotiske beslutningstakere i en 3D flercellet hornhinnen ex vivo modellsystem.

Hornhinnen epithelial såret som ikke bryter epithelial kjelleren membranen normalt stenger i 24-72 h9. Snart etter såret begynner cellene på kanten av epitel å spre og migrere til epithelial gratis overflaten, gjenopprette epithelial barriere-funksjonen. Denne aktiviteten er sekvensielt etterfulgt aktiveringen av hornhinnen basal celle spredning først, og i en senere fase, forløper celler i sonen for ytre limbal å oppnå utvinning av epitelial cellen masse10,11. Disse sår leges ofte uten arrdannelse. Men resulterer et sår som trenger kjelleren membranen inn stroma ofte i arr formasjon1. Etter hornhinnen stromal såret, fylles stroma med celler i flere opprinnelse inkludert differensierte bosatt stromal celler som Ben margtransplantasjon-avledet fibrocytes12,13,14. Fibrotiske arrdannelse er preget av for myofibroblasts i en healing sår. Disse patologisk myofibroblasts viser økt vedheft gjennom akkumulering av integrins fokal adhesjon, kontraktile α-glatt muskel utgangen (α-SMA) stress fiber og lokal aktivering av ekstracellulær matrix (EFM)-sequestered latent-omforming vekst faktor-beta (TGFβ). Differensiering av epitelial-avledet celler, kalles epithelial mesenchymal overgang (EMT), kan også bidra til å arr formasjon6.

Det er en hårfin balanse mellom celledifferensiering og apoptose etter såret. På grunn av brudd i kjelleren membranen, vekst faktorer som blodplater-avledet vekst faktor (PDGF) og TGFβ fra tårer og epitel bade stroma, inducing myofibroblast differensiering, en vedvarende autocrine løkke av TGFβ aktivisering, og utskillelsen av uorganisert fibrotiske ECM15,16. For myofibroblasts i såret leget fremmer dis og arrdannelse i hornhinnen (figur 2). Men i regeneratively helbredet sår selv om myofibroblasts utvikle, de apoptose og dermed er fraværende eller betydelig redusert i antall i helbredet vev (omtalt i referanse6,10). Dermed fokusert forskning på fibrotiske arr minst delvis på målretting molekyler som hindrer overdreven myofibroblast utvikling eller myofibroblast utholdenhet17,18. Fordi myofibroblast utholdenhet preger både arrdannelse og fibrotiske sykdom i alle vev19, kan hornhinnen være nyttig som en modell å studere generell cellulære mekanismer av fibrose.

I vår modellsystem, er hornhinnen såret med en sylindrisk blad kalt en trephine mens du fremdeles er i verden. Mennesker og gris hornhinner kan bli såret med enten en 6 eller 7 mm trephine; kanin hornhinner foretrekkes en 6 mm trephine. Gris hornhinnen ligner i størrelse på menneskelig hornhinnen. Fordi de er kostnadseffektiv og lett tilgjengelig i store antall, brukes gris hornhinner rutinemessig for orgel kultur. Videre har antistoffer og siRNAs laget for å reagere med human konsekvent cross-reacted med gris7. Etter såret, hornhinner er kuttet fra hele verden med limbus intakt og montert på en agar/kollagen base. Hornhinnen er kultivert i serum-free media pluss stabilisert vitamin C for å simulere fibroblast spredning og ECM deponering20. Verken tillegg av serum eller vekst faktorer er nødvendig for å indusere myofibroblast formasjon7. Hornhinner rutinemessig fast og behandlet for histology etter to uker med kultur. For gen knockdown, eller å teste effekten av en agent på sårheling, såret kan behandles med siRNA i såret etter såret7 eller en løselig agent kan legges til media, henholdsvis8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. organ kultur

  1. Forberedelser
    1. Forberede agar løsning som følger. I en liten bolle, forberede 1% agar og 1 mg/mL bovin kollagen i DMEM-F12 opptil 20 mL. Bringe ved en kokeplate. Sette løsningen i en 50 mL konisk rør. Sett røret i et vannbad i en varm plate å holde løsningen fra styrket.
    2. Forberede supplert serum-frie medier (SSFM) som sammensetningen i Tabellen for materiale.
      Merk: Den nødvendige mengden av SSFM være forberedt, avhenger av antall hornhinner behandles. 30 mL er vanligvis nok medier for 4 hornhinner.
  2. Disseksjon
    Merk: Utføre dette trinnet i disseksjon hette eller kjemiske hette. Øynene sendes med lokk fortsatt festet i enkelte poser å beskytte globuser.
    1. Fjern globes fra lokk med rette kant kirurgisk blad på en etanol-renset hakkebrett. Fjern overflødige fettstoffer vev fra øyet et blad eller en liten saks (figur 3A, 3B).
    2. Etter fjerner verden fra lokket, holder verden posteriorly med tang og umiddelbart dypp øyet i fosfat-bufret saltvann (PBS). Raskt dypp den 3 x 10% jod (i et 100 mL beger). Raskt dypp 2 x i PBS (~ 100 mL i et beaker, endre PBS ofte).
    3. Bruker et rent håndkle eller vev, vikle øyet circumferentially nok presset til å ha en stram hornhinnen overflate å klippe med trephine.
      Merk: Pass på å forhindre at håndkle eller vev å kontakte hornhinnen.
  3. Såret
    1. Bruk en 6 mm trephine for å sår midten av hornhinnen. Trenge gjennom epitel og fremre stroma uten å gjøre et full-tykkelse sår gjennom hele hornhinnen.
      Merk: Hvis endotelet er gjennomsyret, vises et tap av trykk og lekkende væske. I dette tilfellet skal øyet kasseres.
    2. Sted i trephine i sentrum av hornhinnen, roteres 180° klokken og mot klokken 5 x (hver gang retning endres vil det regnes som en gang) mens søknad lett trykk å utdype såret.
      Merk: Nå skal såret dypt nok til å tillate en vev klaff løftes med en tang. Hvis dette ikke er tilfelle Gjenta trinn 1.3.2.
    3. Løft klaffen fra kantene. Samtidig, enten med andre hånd eller med en annen person, bruk et blad, kutte parallell verden klippe bort vevet som tang fortsetter å løfte av fremre hornhinnen innenfor såret margen. Når dette trinnet der burde være en sirkulær såret ligger i sentrum av hornhinnen (se Figur 3 C, 3D).
  4. Skjæring og fjerne hornhinnen fra Globe
    1. Holder øye med vevet, lag et lite innsnitt 1 mm fra kanten av hornhinnen med blad slik at limbus er inkludert i orgel kultur.
    2. Bruker små, skarpe saks tilgang i snitt opprettet i forrige trinn å kutte rundt i verden, holde en millimeter margin gjennom hornhinnen for å holde limbus intakt.
    3. Plass hornhinnen i en 60 mm parabolen med 1 mL av PBS, såret siden før montering.
  5. Montering
    1. Kontroller at agar har kommet til en varm temperatur (ca 25 ° C).
    2. Med to par pinsett, lage en kopp ved å holde to sider av hornhinnen med endotelial side opp. Legge til varmet opp agar løsningen i hornhinnen bruke en steril overføring pipette før den er full.
    3. Etter agar stivner (vanligvis om 30-45 s) nøye Vend hornhinnen med agar i 60 mm plate (figur 3E). Dekk med lokk.
  6. Inkubasjon
    1. Legge til 4 mL SSFM av platen, opprettholde hornhinner på en luft-væske-grensesnittet på limbal grensen på 5% CO2 på 37 ° C. Oppdater media etter 24 timer og deretter annenhver dag.
      Merk: Hvis du utfører en transfection i såret, Utelat antibiotika til etter hva.
    2. Våt hornhinnen overflaten én gang daglig ved å legge til 1 dråpe SSFM fra betinget media i retten å opprettholde fuktighet. For dette, ta rett ut av inkubatoren, plasserer den under panseret, fjerne retten lokket, våt overflaten med media fra retten med en bakteriefri pipette, dekke igjen og sette den tilbake i inkubator.
    3. Gene knockdown, behandle såret med gene målretting eller kontrollere siRNA som er kompleksbundet til en lipid-formidlet transportør som leverandørens anvisninger (se nedenfor).
    4. Mix 5 µL (50 pmol) av siRNA til 50 µL redusert serum minimum viktige medier (f.eks., Opti-MEM). Bland 2 µL av transfection reagensen i 50 µL av redusert serum media. La denne sitte i 5 minutter, og bland dem.
    5. Legge til 200 µL av redusert serum minimum media reagens/siRNA blandingen.
    6. Pipetter dropwise på såret og ruge 3 h.
    7. Bleke siRNA fra hornhinnen overflaten med medier i fatet. Endre inkubasjon media SSFM + antibiotika (se Tabell for materiale). Fortsette inkubasjon som nevnt tidligere (trinn 1.6.1-1.6.2).

2. histologi: Parafinsnitt og immunostai-

  1. Forbereder vevet
    1. Etter en to ukers inkubering, hvis bruker noen av vev for kvantitative sanntid polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR) analyse, før festing, halvert hornhinnen gjennom såret. Denne halv eller bare ¼ (enten er nok tissue) i stabilisere RNA-beskytte reagens.
    2. Bruker en standard isolering kit, isolere RNA og utføre qRT PCR.
      Merk: Alternativt kan den sårede delen bare være isolert og testet for genuttrykk.
    3. Plasser den andre halvparten av hornhinnen i vev patologi kassetter og dukke i bindemiddel (10% formalin) for 2-4 dager ved romtemperatur (RT).
    4. Parafin legge denne halvparten av sårede hornhinnen ved hjelp av.
      Merk: Plasser sårede hornhinnen for å sikre at vev snitting vil produsere et tverrsnitt av hornhinnen.
  2. Immunostaining med 3, 3-diaminobenzidine (DAB)
    1. Dag 1
      1. Etiketten lysbilder riktig bruk av en blyant. De paraffinize vev ved å plassere lysbilder i en krukke med fjerne agent (2 endringer, 10 min).
      2. Rehydrate vev ved å overføre lysbildene til etanol ved å redusere konsentrasjonene (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 min for hver).
      3. Utføre antigen henting av mikrobølgeovnen lysbildene i plast glasset med citrate buffer (10 mM, pH 6.4) i 5 min. Første syklus 5 min på 50% strøm. Fyll glasset med citrate buffer og gjenta. Avkjøl på 10 min.
      4. Vask 3 x med PBS, 2 min. Permeabilize vev med 1% Triton X-100 i PBS 10 min i RT. blokk seksjoner med 3% normal geit serum (NGS) 1t på RT i fuktig kammer.
      5. Inkuber vev med primære antistoff (1: 100 eller som leverandøren antyder) i 3% NGS overnight på 4 ° C (300 µL per lysbilde).
    2. Dag 2
      1. Skyll lysbilder 3 x med PBST (PBS pluss 1% mellom 20), 2 minutter hver. Plasser lysbilder i 3% H2O2 for 10 min å blokkere endogene peroxidase. Vask 3 x med PBST, 2 min. Inkuber seksjoner med HRP sekundære antistoff (1:250) 3% NGS 1t på RT (300 µL per lysbilde).
      2. Vask lysbilder 3 x PBST, 2 min. Behandle lysbilder med DAB kit. Legge til 300 µL/lysbilde for 3 min. vask lysbilder med dH2O 2 x (rask dips).
      3. Counterstain med Hematoxylin 20 s. vaskes lysbildet med dH2O 2 x (rask dips). Flekk med bluing agent for 20 s. skylling i dH2O for 20 s. Dehydrate vev ved å plassere glir inn i økende konsentrasjoner av etanol (50%, 70%, 100%, 100%, alle rask dips).
      4. Tørr lysbilder på et papirhåndkle under panseret i 10-20 minutter.
      5. Montere lysbilder med 1 dråpe montering media, dekk med dekkglassvæske. Selskapet og butikken på RT.
      6. Image lysbildene under et mikroskop og kvantifisere DAB-signalet med ImageJ7 (se Seksjon 4).
  3. Immunostaining: fluorescens
    1. Følg fremgangsmåten i trinn 2.2.1 på dag 1 . Gjør følgende på dag 2.
    2. Skyll lysbilder 3 x i PBST i 2 minutter. Inkuber seksjoner med fluorophore-merket sekundære antistoff 3% NGS (1:200) 1 h på RT.
    3. Vask 3 x i PBST, 2 min. Montere lysbilder med 1 dråpe 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) monterer medier og dekket med en dekkglassvæske. Tørr på papirhåndkle under panseret i 30 min. butikken i mørket på 4 ° C til fluorescens bildebehandling.
  4. Kvantifisering bruke bildet J
    1. Dataoverføre "Fiji" versjon av ImageJ, som inkluderer nødvendig plugins for DAB flekker kvantifisering.
    2. Åpne et bilde i Fiji, og velg Image → farge → farge Deconvolution.
    3. Velg "H DAB" som flekken og klikk deretter OK. Tre nye bilder vises. Velg bildet som inneholder bare DAB flekker.
    4. For å kvantifisere stromal flekker bare, kan du bruke funksjonen ImageJ viskelær fjerne epitel fra DAB bildet.
    5. Velg analysere → mål (eller Ctrl + M) og registrere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunohistochemistry er den primære analysen utnyttet analysere suksessen til ex vivo sår helbredelse eksperiment. Figur 4 viser epitel og fremre stroma i kontroll vev (figur 4A, 4B). Seks timer etter at såret, var epitel fraværende (figur 4C, 4 D). Seks dager etter såret som forventet, hadde epitel regrown (figur 4E, 4F). Dette vevet var immunostained for alpha-glatt muskel utgangen (α-SMA), uttrykket som karakteriserer myofibroblasts. Det er en dramatisk økning i α-SMA immunostaining i stroma som oppdages av kolorimetrisk DAB substrat. Det var også en økning i epithelial reaktivitet som kan foreslå EMT overgang7 (se diskusjonen). Disorganization i epitel og stroma var tydelig. En såret eksperiment forstørring og med fluorescerende immunostai-i stedet for DAB vises (figur 4G, 4 H). Såret er synlig og gradering av aktive myofibroblasts fra det fremre til bakre stroma.

Selv om fibrotiske markører er uttrykt ved en uke (Figur 4), for å få konsekvent og pålitelig utviklingen av fibrotiske markører, ble en to-ukers tidspunkt valgt. Analysen bruker en engangs program for kontroll eller genet målretting siRNA skal testes for å fremme regenerativ healing er demonstrert i figur 5 . I dette tilfellet var den målretting siRNA USP10, en deubiquitinase. Patologisk myofibroblasts demonstrert økt vedheft gjennom akkumulering av αv-integrins i fokal adhesjon21. Våre tidligere studier viste at αvβ1 og αvβ5 er viktige fibrotiske integrins i hornhinnen stromal helbredende7. Integrins binde ECM utenfor cellen og sammen de er internalisert. Internalisert integrin er ubiquitinated og sendt til fornedrelse i lysosome eller ubiquitin koden er fjernet av en deubiquitinase (DUB) og integrin gjenvinnes til celleoverflaten. Vi oppdaget at en økning i genuttrykk av DUB (USP10) økt rate av ubiquitin fjerning fra integrin underenheter β1 og β5 fører til en resulterende opphopning av αv/β1/β5, på celleoverflaten, med påfølgende TGFβ aktivisering og induksjon av fibrotiske markører7. Knockdown av USP10 i hornhinnen orgel kultur forhindret utseendet av fibrotiske markører7. Et eksempel på disse resultatene er vist i figur 5. Som benyttes ovenfor, α-SMA som en markør for myofibroblasts. En annen indikator arrdannelse er Fibronectin-EDA (FN-EDA), en skjøte variant av FN som inneholder en RGD, αv integrin bindende domene22,23,24. Det er også betegnet mobilnettet FN (c-FN). Det fungerer som en sentral fibrotiske markør siden FN-EDA i sirkulerende plasma men i stedet ikke er bare uttrykt og skilles ut av celler under fibrotiske forhold25. I figur 5A- vises5 C immunostaining for α-SMA. Sammenlignet med unwounded (figur 5A), såret pluss kontroll siRNA (figur 5B) viste en dramatisk økning i α-SMA protein uttrykk, mens tillegg av USP10 siRNA7 dramatisk redusert uttrykk i stroma og epitel. På samme måte viste i forhold til unwounded (figur 5 d), såret pluss kontroll siRNA (figur 5E) en dramatisk økning i fibronectin-EDA protein uttrykk i forhold til behandling med USP10 siRNA (figur 5F). Immunohistology for målet protein (i dette tilfellet USP10) ble brukt til å demonstrere vellykket knockdown7. I tillegg kan utfører qRT PCR forsikre genet knockdown i vevet eller til analysen for andre fibrotiske markører7. ImageJ kan brukes å kvantifisere signal i stroma bare eller totale signalet (figur 5G). Minst 3 hornhinner for hvert vilkår testes bør brukes å kvantifisere immunostaining å generere statistiske betydning som vi har vist her og tidligere utgitt7. Andre proteiner som har vært rutinemessig benyttet for fibrotiske markører er kollagen III uttrykk og en økning i integrin uttrykk1,26.

I figur 6, er bruk av ex vivo hornhinnen kultur vist som en toksikologi analysen. I dette eksperimentet, hornhinner var enten venstre unwounded (figur 6A), såret (figur 6B), eller såret og behandlet med 10 µM Spautin-127, ble lagt til celle kultur mediet for å øke perioder før vask ut ( Figur 6C-6F). Spautin-1 er et stoff som nonspecifically mål USP1027. På grunn av suksessen med USP10 siRNA, ble Spautin behandling testet for effektivitet i å forebygge arrdannelse. I motsetning til siRNA var Spautin på denne konsentrasjonen giftige til vev. Øke tiden med Spautin-1 i kultur forhindret re epithelialization og resulterte i kvalitativ celledød, uorganisert matrise og stromal vacuoles antyder at Spautin-1 ikke fremme helbredelse på konsentrasjonen assayed. Standard histologiske analyser kan brukes å kvantifisere celle spredning eller apoptose.

Figure 1
Figur 1 : Tverrsnitt av en menneskelig øye med en utvidet visning av hornhinnen. I primater og kyllinger, histologisk det er fem forskjellige lag: epitel Bowmans membran, stroma, Decements membran og endotelet28,29. I alle andre pattedyr vises Bowmans membran ikke histologisk. På transmission elektron mikroskopisk nivå, er en kjeller membran observert skille hornhinnen epitel og stroma i alle hornhinner inkludert de med en Bowman membran. En intakt Bowman membran eller kjelleren membran skille epitel fra stroma er en nødvendig å hindre arrdannelse i alle pattedyr. Bilde gjengitt med tillatelse fra AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Diagram av mobilnettet hendelsene som fører til hornhinnen arrdannelse. Dette diagrammet viser grunnleggende hendelsene brette i fremre hornhinnen etter såret. (A) skildring av epitel, kjelleren membran, stroma og quiescent cellene innebygd i stroma, dvs, keratocytes. (B) den røde trekanten viser et sår, som kan være mekanisk, en sår, virus eller vedvarende infeksjon. (C) etter at såret, i som Bowmans eller kjelleren membranen er brutt, og cellene rundt sår apoptose. (D og E) en tilstrømning av celler gjenbefolke såret fra bosatt keratocytes eller Ben margtransplantasjon-avledet fibroblaster og overgangen til aktivert fibroblaster eller direkte til myofibroblasts. (F) disse tilhenger patologisk myofibroblasts opprette en autocrine løkke av TGFβ aktivisering og sekresjon av uorganisert fibrotiske matrise som fremmer korneal dis og arr formasjon. Myofibroblasts vises i et regeneratively helbredet sår men har apoptosed i helbredet vev6,29,30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Mottak og behandling hornhinner for orgel kultur. (A) gris øyne mottas med lokk for å beskytte hornhinnen under frakt. (B) bilde av verden etter vev er fjernet. (C) bilde av en 6 mm trephine. (D) Wounding av sentrale hornhinnen med en trephine. (E) bilde av montert hornhinnen etter fjerning fra hele verden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Hornhinnen tissue etter såret. Immunohistological analyse av unwounded (kontroll) eller såret hornhinner. Gris hornhinner er igjen unwounded (kontroll) eller såret. Vev delene var immunostained med antistoff alpha-glatt muskel utgangen (α-SMA) til å identifisere myofibroblasts. (A og B) kontroll, unwounded. (C og D) såret og fast på 6 h etter såret. Epitel er fjernet (pil). (E og F) såret og fast på 6 dager etter såret. Stroma har utfylt og epitel har regrown (pilen leder). Representant aktivert myofibroblasts er merket med stjerner (*). (G, H) Lav forstørrelse bilder av α-SMA immunostai-2 uker etter såret: α-SMA (rød), DAPI (blå). Bildene ble tatt med en oppreist fluorescens/brightfield mikroskop med CCD kamera. Skala bar = 100 µm (A, C, E); 50 µm (B, D, F); jektet 200 µm bakover (G, H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Testing regenerativ helbredende agenter. Gris hornhinner var enten (A og D) unwounded (kontroll), (B og E) såret og behandlet med kontroll siRNA, eller (C og F) såret og behandlet med USP10 siRNA. Immunostaining (A-C) α-SMA eller (D-F) Fibronectin-EDA. Etter behandling med USP10 siRNA, α-SMA ble redusert med 2,2 ± 0,6 fold *** p < 0,001 og FN-EDA 3.3 ± 1.2 brett ** p < 0,01. Bildene ble tatt med en oppreist fluorescens/brightfield mikroskop med CCD kamera. Skala bar = 50 µm. (G) hornhinnen stromal flekker som kvantifisert ved ImageJ. Statistisk betydning ble beregnet ved veis VARIANSANALYSE med Bonferroni's test. Figur er tilpasset med tillatelse fra Gillespie et al.7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Testing agenter for effekter på reepithelialization - toksikologi studier. Immunostaining for α-SMA. Gris hornhinner var (A) unwounded, og (B) såret. (C-F) Hornhinnen ble såret, og inkubert med 10 µM Spautin-1. Inhibitor ble vasket ut og erstattet av media etter (C) to dager, (D) 4 dager, (E) 6 dager, (F) 14 dager. Alle medier som er byttet under inkubasjonstiden inkludert Spautin som angitt. Alle hornhinner var fast og innebygd i parafin etter 2 uker i kultur. Bildene ble tatt med en oppreist fluorescens/brightfield mikroskop med CCD kamera. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en modell for å studere sårheling i en naturlig lagdelt 3D-miljø. Bruk av orgel kultur som et mellomledd mellom cellekultur og i vivo studier reduserer kostnader samt redusere prosedyrer på levende dyr. Andre 3D-modeller har vært til stor nytte for feltet inkludert selv syntetisere kollagen gels laget av primære menneskelig hornhinnen fibroblaster2 eller disse samme cellene innebygd i gels laget av animalske collagens31. Orgel kultur modell systemet er spesielt nyttig for å teste antatte helbredende agenter siden såret er lokalisert, og dermed er det en klar margin mellom såret og ikke-skadet vev i samme hornhinnen (Figur 4). I tillegg gir et mekanisk trephine sår direkte tilgang til stroma, som er utmerket for administrasjon av siRNAs i såret (figur 5). Selv om det ikke vises her, har viral signaltransduksjon inn hornhinnen tissue i orgel kultur også vært vist32,33,34. En Permutasjon av denne analysen vil være å infisere hornhinner med en reporter konstruksjon av interesse og bilde genuttrykk i sanntid etter såret. Når det gjelder oversettelse i vivo studier, samme fremgangsmåte kan oppnås i kaniner35 og således orgel kultur på menneske, gris, eller kanin hornhinner kan sammenlignes i vivo resultater. I vår erfaring, har dataene som vi oppnådd ved hjelp av orgel kultur modellen med siRNA behandling oversatt til tilsvarende funn i vivo (upubliserte data). Siden orgel kultur hornhinner mangler en funksjonell limbal blodkar, tårer og aqueous humor, må hver etterforsker vurdere om dette vil bli en nyttig modell for sine studier. Bosatt aktivering av immunceller har vist, men nøyaktig parallell til i vivo studier er ennå ikke klart1.

Et viktig skritt i protokollen er ikke å trenge gjennom hornhinnen av såret for dypt. Dette blir tydelig når fremre kammer væsken vil lekke i dette tilfellet. Hvis dette skjer, skal verden bli forkastet. For å produsere et selv mekanisk sår, grep av avgrensede vevet trephined området med en tang og flytt deretter kirurgisk bladet parallelt hornhinnen overflaten klippe vevet bort innenfor grensene av trephine sår. Hornhinnen overflaten bør ikke tørke ut så vi anbefaler at etter gjør såret og kutte ut hornhinnen fra hele verden, plassere hornhinnen med forsiden ned i PBS til agar blandingen er ved korrekt temperatur. Sørge for at agar ikke er for varmt vil unngå endothelial skade.

En begrensning av denne modellen er at bruk av en trephine til å produsere et sår er ujevn og kan ikke reproduseres identisk fra hornhinnen til hornhinnen sammenlignet med laser-indusert sår36. Men naturlig forekommende sår er ikke alle ekvivalente i dybden og en stor mengde data tyder på at brudd i kjelleren membranen genererer myofibroblast utvikling og disen i stroma, mens regenerering av kjelleren membranen fører til redusert arrdannelse37,38,39. Denne grisen hornhinnen orgel kultur modellen har en alvorlig såret som fjernes kjelleren membranen innenfor området i trephine. Utvikling av myofibroblasts og fibrotiske markører i hornhinnen stroma har vært konsekvent og reproduserbarhet oppnådd ved hjelp av denne modellsystem. Noen epithelial flekker er vanligvis tydelig som mørkner i såret og regrown epitel. Dette har blitt vist i andre hornhinnen orgel kultur rapporter40 men er fraværende i de fleste hornhinner fra i vivo musen og kanin studier41,42. En studie utført i en i vivo hjørnetann modell viste imidlertid sterk epithelial α-SMA farging i epitel etter såret43. SiRNA som fremmet regenerativ healing i våre studier også betydelig redusert denne epithelial immunostaining, antyder at epitel kan være gjennomgå EMT (fibrotiske scarring) når det regrows i orgel kultur. I tillegg resulterte unnlatelse av en primære antistoff fargeprotokoll av en såret hornhinnen i totalt fravær av flekker7 antyder at immunostaining er bestemt. Frosne snitt (vises ikke) var lik parafinen delene i denne forbindelse. Men fordi liten, men variabel bakgrunnen farging i epitel, vår lab har bare kvantifisert den stromal flekker, spørsmål som synes å ha ingen bakgrunn histologiske7.

Hvis såret menneskelige hornhinner, være skaffe hornhinner ikke brukes for transplantasjon i stedet for selvkost globuser mer kostnadseffektiv40. I dette tilfellet vil hornhinnen bli såret uten hjelp av trykket by av verden. Flere såret strategier kan omfatte hornhinnen burns, som har blitt mye utnyttet i vivo å produsere en arr42.

Oppsummert er fordelene med dette systemet for en 3D vev sårheling analysen sin reproduserbarhet innsparinger og reduserte kostnader med bare standard utstyr behov, gjør den en utmerket ressurs for observere og kvantifisere effekten av agenter på vev helbredelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH-NEI R01 EY024942, forskning for å hindre blindhet, storbyen medisinske universitet ubegrenset forskningsmidler, og Lions distriktet 20-Y. mikroskopi og bildeanalyse av parafinsnitt ble utført mikroskopi kjernen og histologiske lysbildet forberedelse ble utført på Biorepository og patologi kjernen ved Icahn School of Medicine i Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

Medisin problemet 144 hornhinnen Scarring Fibrosis Myofibroblast Ex vivo orgel kultur
Ex Vivo sårtilheling hornhinnen Organ kultur modell for studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro, N., Gillespie, S. R.,… More

Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter