Summary
Ett protokoll för en ex vivo korneal orgel kultur modell användbar för sårläkning studier beskrivs. Denna modell-systemet kan användas för att bedöma effekterna av agenter för att främja regenerativ läkning eller drog toxicitet i en organiserad 3D flercelliga miljö.
Abstract
Hornhinnan har använts flitigt som modellsystem studera sårläkning. Förmågan att generera och använda primära däggdjursceller i två dimensionell (2D) och tre dimensionell (3D) kultur har genererat en mängd information inte bara om hornhinnan biologi men också om såret läka, myofibroblast biologi, och ärrbildning i allmänhet . Syftet med protokollet är ett analyssystem för att kvantifiera myofibroblast utveckling, som kännetecknar ärrbildning. Vi visar en hornhinnan orgel kultur ex vivo modell med grisen ögon. I denna främre keratectomy sår, såras hornhinnor fortfarande i Globen med cirkulära blad kallas en trephine. En propp av ungefär 1/3 av främre hornhinnan tas bort bland annat epitelet och basalmembranet den främre delen av stroma. Efter såra, är hornhinnor skär från Globen, monterad på en kollagen/agar base och odlade i två veckor i kompletteras-serum gratis medium med stabiliserad vitamin C att öka cellproliferation och extracellulär matrix sekretion av bosatta fibroblaster. Aktivering av myofibroblaster i främre stroma är tydligt i läkta hornhinnan. Denna modell kan användas till assay sårslutning, utvecklingen av myofibroblaster och fibrotiska markörer, och för toxikologiska studier. Dessutom kan effekterna av liten molekyl-hämmare samt lipid-medierad siRNA transfection för genen knockdown testas i detta system.
Introduction
Ärrbildning i hornhinnan som härrör från skada, trauma eller infektion kan leda till försvagande opaciteter och permanent synbortfall. Således finns det ett kritiskt behov att identifiera vägar som kan vara måltavlan för terapeutisk intervention. Aktuella behandlingsalternativ är begränsad och består främst av hornhinnans transplantationer, som inte är tillgängliga för patienter över hela världen. Både mänskliga (figur 1) och animaliska hornhinnor kan utnyttjas för 2D och 3D cellkultur studier1,2. Mänskliga cadaver hornhinnor inte lämpar sig för transplantation kan erhållas från ögat banker eller centraliserad vävnadsbanker (nationella sjukdom forskning Interchange (NDRI)), och djurs ögon kan erhållas från ett slakteri. Primära korneal epitelceller, stromal fibroblaster och mer nyligen, endotelceller, kan vara isolerade och odlade från dessa vävnader för sårläkning och toxikologiska studier3,4,5. Förutom vikten av att förstå den molekylära basen för bländande ögonsjukdom, har tillgängligheten av vävnad och förmågan att kultur primära celler gjort hornhinnan en viktigt modellsystem för studien. Hornhinnan är idealisk för att testa effekterna av agenter på ärrbildning som normala hornhinnan är transparent och vissa typer av sår skapa opacitet eller fibrotisk ärr (ses i6). Flera i vivo korneal sår helande modeller har också använts flitigt för ärrbildning studier1. Mindre utnyttjas har varit ex vivo korneal sår helande modell7,8 som är beskriva i detalj här. Målet med denna metod är att kvantifiera ärrbildning resultat kännetecknas av fibrotiska beslutsfattare i en 3D flercelliga korneal ex vivo modellsystem.
Hornhinnans epitel skadade som inte strider mot epitelial basalmembranet normalt stängs inom 24-72 h9. Snart efter såra börja cellerna vid kanten av epitelet sprida och migrera till den epitelial yta, återupprätta epitelial barriärfunktion. Denna aktivitet är sekventiellt följt av aktivering av hornhinnans basal cell spridning först och i ett senare skede, av prekursorceller som ligger vid yttre limbala zonen att uppnå återvinning av epitelial cell massa10,11. Dessa sår läker ofta utan ärrbildning. Dock resulterar ett sår som penetrerar basalmembranet i stroma ofta i ärr bildas1. Efter hornhinnans stromal såra, fylls stroma med celler av flera ursprung inklusive differentierad bosatt stromaceller samt benmärg-derived fibrocytes12,13,14. Fibrotiska ärrbildning kännetecknas av ihållande myofibroblaster i ett läkande sår. Dessa patologiska myofibroblaster påvisa ökad vidhäftning genom ansamling av integriner i focal sammanväxningar, kontraktila α-smooth aktin (α-SMA) stress muskelfibrer och lokal aktivering av extracellulär matrix (ECM)-binds latent-omvandla tillväxtfaktor-beta-(TGFβ). Differentiering av epitelial-derived celler, som kallas epitelial mesenkymala övergång (EMT), kan också bidra till att ärr bildning6.
Det finns en känslig balans mellan celldifferentiering och apoptos efter såra. På grund av överträdelsen i basalmembranet, tillväxt faktorer såsom trombocyt-derived tillväxt factor (PDGF) och TGFβ från tårar och epitelet bada stroma, förmå myofibroblast differentiering, en ihållande autokrin loop av TGFβ aktiveringen, och den utsöndringen av oorganiserad fibrotiska ECM15,16. Varaktigheten av myofibroblaster i läkta såret främjar haze och ärrbildning på hornhinnan (figur 2). Dock i regeneratively läkt sår även om myofibroblaster utvecklar, de apoptose och därmed är frånvarande eller avsevärt minskat i antal i läkta vävnaden (ses i referens6,10). Forskning om fibrotiska ärrbildning fokuserat således åtminstone delvis på inriktning molekyler som förhindrar överdriven myofibroblast utveckling eller myofibroblast persistens17,18. Eftersom myofibroblast persistens präglar både ärrbildning och fibrotisk sjukdom i alla vävnader19, kan hornhinnan vara användbart som modellsystem studera allmänna cellulära mekanismer av fibros.
I vår modellsystem såras hornhinnan med cylindriska blad kallas en trephine samtidigt i hela världen. Människa och gris hornhinnor kan vara sårad med antingen en 6 eller 7 mm trephine; för kanin hornhinnor föredras en 6 mm trephine. Gris hornhinnan är samma storlek som mänskliga hornhinnan. Eftersom de är kostnadseffektiva och lätt tillgängliga i stort antal, används rutinmässigt gris hornhinnor för orgelkultur. Antikroppar och siRNAs gjorde att reagera med mänskliga har dessutom konsekvent cross-reacted med pig7. Efter såra, skärs hornhinnor från hela världen med limbus intakt och monterad på en agar/kollagen bas. Hornhinna är odlade i serumfritt media plus stabiliserad vitamin C för att simulera fibroblast spridning och ECM nedfall20. Varken tillägg av serum eller tillväxtfaktorer behövs för att framkalla myofibroblast bildande7. Hornhinnor är rutinmässigt fast och behandlas för histologi efter två veckor av kultur. För genen knockdown att testa effekterna av en agent på sårläkning, såret kan behandlas med siRNA i såret efter såra7 eller en löslig agent kan läggas till media, respektive8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. orgelkultur
-
Förberedelser
- Bered agar enligt följande. I en liten kolv, förbereda 1% agar och 1 mg/mL bovint kollagen i DMEM-F12 upp till 20 mL. Föra för att koka på en värmeplatta. Sätta lösningen till en 50 mL konisk rör. Placera röret i vattenbad på en värmeplatta att hålla lösningen från stelnar.
- Förbereda kompletterade serum-fria medier (SSFM) enligt den sammansättning som anges i Tabellen för material.
Obs: Den nödvändiga mängden SSFM förberedas beror på antalet hornhinnor behandlas. 30 mL är vanligtvis tillräckligt media för 4 hornhinnor.
-
Dissektion
Obs: Utför det här steget om du i en dissektion huva eller kemisk huva. Ögonen är levereras med lock som fortfarande sitter i individuella påsar för att skydda glober.- Ta bort glober från lock med en straight-edge kirurgiska bladet på en etanol-rengöras skärbräda. Ta bort överflödig fettvävnad från ögat med hjälp av en kniv eller en liten sax (figur 3A, 3B).
- När världen ur locket, håll världen posteriort med pincett och doppa omedelbart ögat i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Snabbt doppa den 3 x i 10% jod (i en 100 mL-bägare). Snabbt doppa 2 x i PBS (~ 100 mL i en bägare, ändra PBS ofta).
- Använda en ren handduk eller vävnad, Linda ögat maskrad med tillräckligt tryck att ha en spänd hornhinnans yta att skära med trephine.
Obs: var noga med för att förhindra handduk eller vävnad från att kontakta hornhinnan.
-
Såra
- Använd en 6 mm trephine till sår i mitten av hornhinnan. Tränga in i epitel och främre stroma utan att göra ett fullhudsskador sår genom hela hornhinnan.
Obs: Om endotelet blir penetrerad, ses en förlust av tryck och läckande vätska. I detta fall ska ögat kasseras. - Placera trephine i mitten av hornhinnan, rotera den 180° medurs och moturs 5 x (varje gång riktning ändras räknas det som en gång) medan lätt tryck att fördjupa såret.
Obs: Såret bör nu vara tillräckligt djupt för att tillåta en vävnad flik att lyftas med ett par pincett. Om detta inte är fallet Upprepa steg 1.3.2. - Lyft klaffen från kanterna. Samtidigt, antingen med den andra handen eller med en andra person, använda en kniv, skär parallellt i världen att klippa bort vävnaden som tången fortsätter att lyfta den främre hornhinnan inom såret marginalen. Vid ingående av detta steg bör det finnas ett cirkulär sår som ligger i mitten av hornhinnan (se figur 3 C, 3D).
- Använd en 6 mm trephine till sår i mitten av hornhinnan. Tränga in i epitel och främre stroma utan att göra ett fullhudsskador sår genom hela hornhinnan.
-
Kapning och borttagning hornhinnan från Globen
- Håller ögat med vävnaden, göra ett litet snitt 1 mm från kanten av hornhinnan med en kniv så att limbus ingår i orgelkultur.
- Med små, åt vassa saxar snittet skapade i det föregående steget att skära runt om i världen, att hålla en millimeters marginal hela hornhinnan att hålla limbus intakt.
- Placera hornhinnan i en 60 mm skålen med 1 mL PBS, såret sida ner tills montering.
-
Montering
- Kontrollera att ägarn har kommit till en varm temperatur (ca 25 ° C).
- Med två par pincett, skapa en kopp genom att hålla två sidor av hornhinnan med den endothelial Sidan upp. Tillsätt varmkörd agar lösningen i hornhinnan med sterila pipett tills den är full.
- Efter ägarn hårdnar (vanligtvis ca 30-45 s) noggrant flip hornhinnan med ägarn i 60 mm plattan (figur 3E). Täck med ett lock.
-
Inkubation
- Tillsätt 4 mL SSFM till plattan, upprätthålla hornhinnor på ett luft-vätska gränssnitt limbala i vid gränsen 5% CO2 vid 37 ° C. Uppdatera media efter 24 h och därefter varannan dag.
Obs: Om utför en transfection i såret, utelämna antibiotika förrän efter transfection. - Våt hornhinnans yta en gång dagligen genom att lägga till 1 droppe av SSFM från luftkonditionerade medier i skålen att behålla fukt. För detta, ta skålen ur ruvmaskinen, placera den under huven, ta bort locket från skålen, våta ytan med media från skålen med steril pipett, täcka igen och sätta tillbaka den på inkubatorn.
- Gen knockdown, behandla såret med gen-targeting eller styra siRNA som är complexed till en lipid-medierad transportör enligt leverantörens anvisningar (se nedan).
- Blanda 5 µL (50 pmol) siRNA in 50 µL av minskad-serum minsta nödvändiga media (t.ex., Opti-MEM). Blanda 2 µL transfection reagens in 50 µL av minskad-serum media. Låt detta sitta i 5 min och sedan blanda dem.
- Tillsätt 200 µL minskas-serum minsta media reagens/siRNA blandningen.
- Pipettera droppvis på såret och Inkubera under 3 h.
- Tvätta ur siRNA från hornhinnans yta med media i skålen. Ändra inkubation media till SSFM + antibiotika (se Tabell för material). Fortsätt inkuberingen som nämnts tidigare (här 1.6.1-1.6.2).
- Tillsätt 4 mL SSFM till plattan, upprätthålla hornhinnor på ett luft-vätska gränssnitt limbala i vid gränsen 5% CO2 vid 37 ° C. Uppdatera media efter 24 h och därefter varannan dag.
2. histologi: Paraffin avsnitt och immunfärgning
-
Förbereda vävnaden
- Efter en två veckors ruvning, om du använder några av vävnad för kvantitativa realtid polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) analys, innan fastställande, skurna hornhinnan i halv genom såret. Placera denna halva eller bara ¼ (antingen är tillräckligt vävnad) till stabilisera RNA-skydda reagens.
- Använda en standard isolering kit, isolera RNA och utföra qRT-PCR.
Obs: Alternativt, den sårada del endast kan isoleras och testade för genuttryck. - Placera den andra hälften av hornhinnan i vävnad patologi kassetter och dränka i fixativ (10% formalin) för 2-4 dagar i rumstemperatur (RT).
- Paraffin bädda detta hälften av sårade hornhinnan med hjälp av standardtekniker.
Obs: Orient sårade hornhinnan för att säkerställa att den vävnad snittning kommer att producera ett tvärsnitt av hornhinnan.
-
Immunfärgning med 3, 3'-Diaminobenzidin (DAB)
-
Dag 1
- Etiketten glider ordentligt med en blyertspenna. De paraffinize vävnaden genom att placera bilder i en burk med clearing agent (2 ändringar, 10 min varje).
- Rehydrera vävnaden genom att överföra bilderna till etanol på minskande koncentrationer (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 min för varje ändring).
- Utföra antigen hämtning av mikrovågsugnen bilder i en plastburk med citratbuffert (10 mM, pH 6,4) för 5 min. Grundnivå 5 min på 50% effekt. Fyll burken med citratbuffert och upprepa. Svalna i 10 min.
- Tvätta 3 x med PBS, 2 min varje. Permeabilize vävnad med 1% Triton x-100 i PBS 10 min vid RT. Block avsnitten med 3% normala get serum (NGS) för 1 h på RT i fuktig kammare.
- Inkubera vävnad med primär antikropp (1: 100 eller som leverantören antyder) hos 3% över natten NGS vid 4 ° C (300 µL per bild).
-
Dag 2
- Skölj glider 3 x med PBST (PBS plus 1% Tween-20), 2 min varje. Placera bilder i 3% H2O2 för 10 min att blockera endogena peroxidas. Tvätta 3 x med PBST, 2 min varje. Inkubera sektioner med HRP sekundär antikropp (1: 250) hos 3% NGS för 1 h på RT (300 µL per bild).
- Tvätta diabilder 3 x PBST, 2 min varje. Behandla bilder med DAB kit. Lägg till 300 µL/bild för 3 min. Tvätta glider med dH2O 2 x (snabb dips).
- Counterstain med Hematoxylin för 20 s. Tvätta bilden med dH2O 2 x (snabb dips). Fläcken med blåelse agent för 20 s. Skölj i dH2O för 20 s. Dehydrate vävnad genom att placera glider in ökande koncentrationer av etanol (50%, 70%, 100%, 100%, alla snabba dips).
- Torra diabilder på en pappershandduk under huven för 10-20 min.
- Montera diabilder med 1 droppe montering media, täck med täckglas. Etikett och butiken på RT.
- Bild bilder under ett mikroskop och kvantifiera DAB signal med ImageJ7 (se avsnitt 4).
-
Dag 1
-
Immunfärgning: fluorescens
- Följ stegen som beskrivs i steg 2.2.1 på dag 1 . Utför följande steg på dag 2.
- Skölj glider 3 x i PBST för 2 min varje. Inkubera sektioner med fluorophore-taggade sekundär antikropp i 3% NGS (1: 200) för 1 h på RT.
- Tvätta 3 x i PBST, 2 min varje. Montera diabilder med 1 droppe 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) montering media och täck med ett täckglas. Torka på hushållspapper under huven för 30 min. Store i mörker vid 4 ° C tills fluorescens imaging.
-
Kvantifiering med bild J
- Ladda ner den ”Fiji” versionen av ImageJ, som innehåller de nödvändiga plugins för DAB färgning kvantifiering.
- Öppna en bild i Fiji och välj bild → färg → färg Deconvolution.
- Välj ”DAB-H” som fläcken och klicka sedan på OK. Tre nya bilder kommer att visas. Välj den bild som innehåller bara DAB färgning.
- För att kvantifiera stromal färgning endast funktionen ImageJ radergummit bort epitelet från DAB bilden.
- Välj analysera → åtgärd (eller Ctrl + M) och registrera mätvärdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunhistokemi är primära analysen utnyttjas för att analysera framgången för ex vivo sår helande experiment. Figur 4 illustrerar de epitel och främre stroma i kontroll vävnad (figur 4A, 4B). Sex timmar efter såra, var epitelet frånvarande (figur 4 c, 4 D). Sex dagar efter såra som förväntat, hade epitelet växt ut (figur 4E, 4F). Denna vävnad var immunostained för alpha-smooth muscle aktin (α-SMA), uttrycket som kännetecknar myofibroblaster. Det finns en dramatisk ökning av α-SMA immunfärgning i stroma som upptäcks av kolorimetriska DAB substrat. Det fanns också en ökning av epitelial reaktivitet som kan föreslå EMT övergång7 (se diskussionen). Oordning i epitel och stroma var uppenbart. En skadade experiment vid lägre förstoring och med fluorescerande immunfärgning istället för DAB visas (figur 4 g, 4 H). Såret marginalen syns samt en gradient av aktiva myofibroblaster från den främre till bakre stroma.
Även om fibrotiska markörer uttrycks av en vecka (figur 4), för att få konsekventa och tillförlitliga utveckling av fibrotiska markörer, valdes en två veckors tidpunkt. I figur 5 framgår ett test med en engångs tillämpning av kontroll eller gen-targeting siRNA testas för att främja regenerativ healing. I det här fallet var den inriktning siRNA för USP10, en deubiquitinase. Patologiska myofibroblaster visat ökad vidhäftning genom ackumulering av αv-integriner i focal sammanväxningar21. Våra tidigare studier visade att αvβ1 och αvβ5 är viktiga fibrotiska integriner i hornhinnan stromal helande7. Integriner binder ECM utanför cellen och tillsammans är de internaliserat. Internaliserad integrin är ubiquitineras och skickas för nedbrytning i lysosomen eller ubiquitin etiketten tas bort genom en deubiquitinase (DUB) och integrin återvinns till cellytan. Vi upptäckte att en ökning av genuttrycket av DUB (USP10) höjdes ubiquitin borttagning från integrin subenheter β1 och β5 leder till en resulterande ansamling av αv/β1/β5, på cellytan, med efterföljande TGFβ aktivering och induktion av fibrotiska markörer7. Nedslagning av USP10 i hornhinnan orgelkultur förhindrat tillkomsten av fibrotiska markörer7. Ett exempel på dessa resultat visas i figur 5. Som används ovan, α-SMA som markör för myofibroblaster. En annan indikator på ärrbildning är Fibronektin-EDA (FN-EDA), en skarv variant av FN som innehåller en RGD, αv integrin bindande domän22,23,24. Det är också betecknas cellulära FN (c-FN). Det fungerar som en nyckel fibrotiska markör eftersom FN-EDA är inte cirkulerande plasma men istället är endast uttryckt och utsöndras av celler under fibrotiska villkor25. I figur 5A- visas5 C immunfärgning för α-SMA. Jämfört med oskadad (figur 5A), såra plus kontroll siRNA (figur 5B) visade en dramatisk ökning i α-SMA proteinuttryck, medan tillägg av USP10 siRNA7 reduceras dramatiskt uttryck i stroma och epitel. På samma sätt visat jämfört med oskadad (figur 5 d), såra plus kontroll siRNA (figur 5E) en dramatisk ökning av Fibronektin-EDA proteinuttryck jämfört med behandling med USP10 siRNA (figur 5F). Immunohistology för målproteinet (i detta fall USP10) användes för att påvisa framgångsrika knockdown7. Dessutom kan utför qRT-PCR försäkra gen knockdown i vävnaden eller också till assay för andra fibrotiska markörer7. ImageJ kan användas för att kvantifiera signal i stroma endast eller totala signal (figur 5 g). Minst 3 hornhinnor för varje villkor som testas bör användas för att kvantifiera immunfärgning för att generera statistisk signifikans som vi har visat här och tidigare publicerat7. Andra proteiner som använts rutinmässigt för fibrotiska markörer är kollagen III uttryck och en ökning av integrin uttryck1,26.
I figur 6demonstreras användning av ex vivo hornhinnan kultur som en toxikologi assay. I detta experiment, hornhinnor var antingen vänster oskadad (figur 6A), sårad (figur 6B), eller sårade och behandlades med 10 µM Spautin-127, som lades till cell kultur media för att öka tid innan wash-out ( Figur 6 c-6F). Spautin-1 är en drog som icke-specifikt riktar USP1027. På grund av våra framgångar med USP10 siRNA testades Spautin behandling för effektivitet att förebygga ärrbildning. Till skillnad från siRNA var Spautin vid denna koncentration giftigt för vävnaden. Ökar tiden med Spautin-1 i kultur hindrade återepitelisation och resulterade i kvalitativa celldöd, oorganiserad matris och stromal vakuoler tyder på att Spautin-1 inte främja läkning i koncentration som analyseras. Histologiska standardanalyser kan användas för att kvantifiera cellproliferation eller apoptos.
Figur 1 : Tvärsnitt av ett mänskligt öga med en expanderad vy av hornhinnan. I primater och kycklingar, histologiskt finns det fem distinkta lager: epitel, Bowmans membran, stroma, Decements membran och endotel28,29. I alla andra däggdjur är Bowmans membran inte synlig histologiskt. På transmission electron mikroskopisk nivå observeras en basalmembranet skiljer hornhinneepitelet och stroma i alla hornhinnor inklusive de med en Bowmans membran. En intakt Bowmans membran eller basalmembran avgränsar epitelet från stroma är ett nödvändigt att förhindra ärrbildning i alla däggdjur. Bilden återges med tillstånd från AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Diagram över de cellulära händelser som leder till hornhinnan ärrbildning. Detta diagram illustrerar de grundläggande händelserna som utvecklas i främre hornhinnan efter såra. (A) skildring av epitelet, basalmembranet, stroma och quiescent celler inbäddade i stroma, i.e, keratocyter. ()B) den röda triangeln skildrar ett sår, som kan vara mekanisk, sår, virus, eller persisterande infektion. (C) efter sårbildning, i vilket Bowman eller basalmembranet bryts, cellerna runt Apoptosen såret. (D och E) ett inflöde av celler återbefolka såret från bosatt keratocyter eller benmärg-derived fibroblaster och övergången till aktiverade fibroblaster eller direkt till myofibroblaster. (F), dessa anhängare patologiska myofibroblaster skapa en autokrin loop av TGFβ aktivering och utsöndring av oorganiserad fibrotiska matris som främjar hornhinnan haze och ärr bildas. I ett regeneratively läkta sår, myofibroblaster visas men har apoptosed i läkt vävnad6,29,30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Ta emot och behandla hornhinnor för orgelkultur. (A) gris ögon mottas med lock för att skydda hornhinnan under frakt. (B) bild av världen efter vävnad avlägsnas. (C) bild av en 6 mm trephine. (D) Wounding av centrala hornhinnan med en trephine. (E) bild av monterade hornhinnan efter borttagning från Globen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Hornhinnan vävnad efter såra. Immunohistological analys av oskadad (kontroll) eller skadade hornhinnor. Gris hornhinnor antingen kvar oskadad (kontroll) eller sårade. Vävnadssnitt var immunostained med antikropp till alpha-smooth muscle aktin (α-SMA) att identifiera myofibroblaster. (A och B) kontroll, oskadad. (C och D) sårad och fasta på 6 h efter såra. Epitel är borttagna (pil). (E och F) sårad och 6 dagar efter såra. Stroma har fyllt och i epitelet har växt ut (pil). Representativa aktiverade myofibroblaster betecknas med asterisker (*). (G, H) Låg förstoring bilder av α-SMA immunfärgning 2 veckor efter såra: α-SMA (röd), DAPI (blå). Bilder fångades med en upprätt fluorescens/brightfield Mikroskop med en CCD-kamera. Skalstapeln = 100 µm (A, C, E). 50 µm (B, D, F); 200 µm (G, H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Testning regenerativ helande agenter. Gris hornhinnor var antingen (A och D) oskadad (kontroll), ( EochB ) sårad och behandlade med kontroll siRNA, eller (C och F) sårad och behandlade med USP10 siRNA. Immunfärgning för (A-C) α-SMA eller (D-F) Fibronektin-EDA. Efter behandling med USP10 siRNA, α-SMA minskade med 2,2 ± 0,6 gånger *** p < 0,001 och FN-EDA 3,3 ± 1,2 gånger ** p < 0,01. Bilder fångades med en upprätt fluorescens/brightfield Mikroskop med en CCD-kamera. Skalstapeln = 50 µm. (G) korneal stromal färgning som kvantifieras i ImageJ. Statistisk signifikans beräknades genom envägs ANOVA med Bonferroni's test. Figur har anpassats med tillstånd från Gillespie et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Testa agenter för effekter på reepithelialization - toxikologistudier. Immunfärgning för α-SMA. Gris hornhinnor var oskadad (A) och (B) sårades. (C-F) Hornhinnan var sårad och inkuberas med 10 µM Spautin-1. Hämmaren var tvättas ut och ersattes av media efter (C) 2 dagar, (D), 4 dagar, (E), 6 dagar, (F), 14 dagar. Alla media ändringar under inkubationstiden ingår Spautin som anges. Alla hornhinnor var fast och inbäddade i paraffin efter 2 veckor i kultur. Bilder fångades med en upprätt fluorescens/brightfield Mikroskop med en CCD-kamera. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en modell för att studera sårläkning i en naturlig stratifierat 3D miljö. Användning av orgelkultur intermediär mellan cellkultur och in vivo-studier signifikant minskar kostnader samt minska förfaranden på levande djur. Andra 3D-modeller har varit till stor nytta för fältet inklusive själv syntetisera kollagen geler gjorda av primära mänskliga korneal fibroblaster2 eller dessa samma celler som inbäddade i geler gjort från animaliska kollagen31. Organsystem kultur modell är särskilt användbart för att testa förmodad helande agenter eftersom såret är lokaliserad och därför finns det en tydlig marginal mellan sårade och icke-sårade vävnad i samma hornhinnan (figur 4). Dessutom finns en mekanisk trephine sår, som ger direktåtkomst till stroma, vilket är utmärkt för administration av siRNAs in i såret (figur 5). Även om det inte visas här, har också visats32,33,34viral transduktion i hornhinnans vävnad i orgelkultur. En annan permutation av denna analys skulle kunna infektera hornhinnor med en reporter konstruktion av intresse och bild genuttryck i realtid efter såra. När det gäller översättning att in vivo-studier, samma förfarande kan åstadkommas i kaniner35 och således orgelkultur på mänskliga, gris eller kanin hornhinnor kan jämföras i vivo resultat. Vår erfarenhet har de uppgifter som vi fått hjälp av orgel kultur modellen med siRNA behandling översatt till liknande fynd i vivo (opublicerade data). Eftersom de orgel kultur hornhinna saknar en funktionell limbala kärlsystemet, tårar och kammarvattnet, måste varje utredare bedöma om detta kommer att vara en användbar modell för sina studier. Bosatt aktivering av immunceller har visats, men det exakta parallellt med in vivo-studier är ännu inte klart1.
Ett viktigt steg i protokollet är inte att penetrera hornhinnan av såra alltför djupt. Detta kommer att vara uppenbara som den främre kammare vätskan läcker ut i detta fall. Om detta inträffar ska i världen kasseras. För att producera ett även mekaniska sår, grepp läppen av avgränsade vävnaden inom det trephined området med en forcep och sedan flytta kirurgiska bladet parallellt med hornhinnans yta att skära vävnaden bort inom gränserna för den trephine sår. Hornhinnans yta bör inte torka ut så vi rekommenderar att efter att göra såret och skära ut hornhinnan från Globen, Lägg hornhinnan nedåtvänt i PBS tills agar blandningen är vid rätt temperatur. Att se till att ägarn inte är för varm att undvika endoteliala skador.
En begränsning av denna modell är att användningen av en trephine att producera ett sår är ojämn och inte kan reproduceras identiskt från hornhinnan till hornhinnan jämfört med laser-inducerad sår36. Naturligt förekommande sår är dock inte alla likvärdiga i djup och en stor mängd data tyder på att brott i basalmembranet genererar myofibroblast utveckling och haze i stroma, regenerering av basalmembranet leder till minskar ärrbildning37,38,39. Denna gris korneal orgel kultur modell sysselsätter ett svår sår där basalmembranet avlägsnas inom trephine området. Utveckling av myofibroblaster och fibrotiska markörer i hornhinnestroman har varit konsekvent och reproducerbarhet uppnås med hjälp av denna modellsystem. Vissa epitelial färgning är oftast uppenbart som mörknar i sårade och återväxta epitel. Detta har visats i andra hornhinnan orgel kultur rapporter40 men är frånvarande i de flesta hornhinnor från i vivo mus och kanin studier41,42. En studie på en invivo hund modell visade dock stark epitelial α-SMA färgning i epitelet efter såra43. Den siRNA som främjade regenerativ helande i våra studier också avsevärt minskas detta epitelial immunfärgning, föreslår att epitelet kan att genomgå EMT (fibrotiska ärrbildning) när det regrows i orgelkultur. Dessutom resulterade utelämnandet av en primär antikropp i protokollet färgning av en sårad hornhinnan i den totala avsaknaden av färgning7 tyder på att immunfärgning är specifika. Frusna snitt (visas inte) liknade paraffin avsnitt i detta avseende. Men eftersom liten men rörliga bakgrunden färgning i epitelet, vårt labb har endast kvantifierade stromal färgningen, frågor som verkar ha ingen bakgrund histologiska7.
Om skadade mänskliga hornhinnor, kan erhålla hornhinnor som inte används för transplantation istället för full glober vara mer kostnadseffektiva40. I det här fallet kommer hornhinnan vara sårad utan hjälp av trycket ges av världen. Ytterligare skadade strategier kan omfatta korneal burns, som i stor utsträckning använts i vivo att producera en ärr42.
Sammanfattningsvis är fördelarna med detta system för en 3D vävnad sårläkning assay dess reproducerbarhet och kostnadsbesparingar med endast standardutrustning behov, vilket gör det en utmärkt resurs för observation och kvantifiera effekterna av agenter på vävnad healing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH-NEI R01 EY024942, forskning för att förhindra blindhet, Upstate Medical University obegränsad forskningsmedel, och Lions distrikt 20-Y. mikroskopi och bildanalys av paraffin avsnitt utfördes vid mikroskopi kärnan och histologisk bild förberedelse utfördes vid Biorepository och patologi CORE vid Icahn School of Medicine vid berget Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100x |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100x |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100x |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100x |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200x |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10 mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera |
References
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
- Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
- Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
- Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
- Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
- Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
- Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
- Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
- Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
- Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
- Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
- White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
- Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
- Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
- Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
- Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
- Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
- Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
- Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
- Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
- Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).
