Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Abstract

Kornea kapsamlı bir model sistem olarak yara iyileşmesi çalışma kullanılmaya başlanmıştır. Yeteneği oluşturmak ve iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) kültür birincil memeli hücrelerinde kullanmak sadece kornea biyoloji hakkında aynı zamanda şifa, myofibroblast biyoloji ve genel olarak yara yara hakkında bilgi hazinesi üretti . Protokol amacı skarlasma karakterize myofibroblast geliştirme miktarının bir tahlil sistemidir. Biz domuz gözleri kullanarak bir kornea organ kültür ex vivo modeli göstermek. Yarası bu ön keratectomy içinde kornealar hala dünya içinde bir trephine olarak adlandırılan bir dairesel bıçakla yaralı. Bir fiş yaklaşık 1/3 ön kornea epitel, membran ve stroma ön parçası gibi kaldırılır. Yaralama sonra kornealar dünyanın gelen kesmek, kollajen/agar üste monte ve stabilize hücre çoğalması ve hücre dışı matriks salgılanmasını artırmak için C vitamini ile desteklenmiş serum özgür ortamda iki haftadır ikamet fibroblastlar tarafından kültürlü. Myofibroblasts anterior stroma içinde aktivasyonu iyileşmiş kornea belirgindir. Bu model yara kapatma, myofibroblasts ve fibrotik işaretleri ve toksikoloji çalışmaları için tahlil için kullanılabilir. Buna ek olarak, küçük molekül inhibitörleri yanı sıra lipit-aracılı siRNA transfection gen nakavt için etkileri bu sistemi test edilebilir.

Introduction

Yaralanma, travma ya da enfeksiyon sonucu kornea skarlasma opaklıklar ve kalıcı görme kaybı zayıflatıcı için yol açabilir. Böylece, terapötik müdahale için yönlendirilebilir yolları tanımlamak için kritik bir ihtiyaç vardır. Mevcut tedavi seçenekleri sınırlı ve dünya çapında hastalar için erişilebilir değildir öncelikle kornea nakillerine oluşur. İnsan (Şekil 1) ve hayvan kornealar-ebilmek var olmak kullanmak için 2D ve 3D hücre kültürü çalışmaları1,2. İnsan kadavra kornealar nakil için uygun değildir göz bankaları veya merkezi doku bankaları (Ulusal hastalık araştırma değişim (NDRI)) elde edilebilir ve hayvan gözleri bir mezbaha elde edilebilir. Birincil kornea epitel hücreleri, stromal fibroblastlar ve daha yakın, endotel hücreleri, izole ve olması için yara iyileşmesi bu dokularda gelen kültürlü ve toksikoloji3,4,5çalışmalar. Göz hastalığı kör moleküler temelini anlamak önemi ek olarak, çalışma için bir önemli model sistemi kornea doku ve kültür primer hücre yeteneği erişilebilirliğini yaptı. Korneanın normal kornea şeffaf ve opaklıklar veya fibrotik izleri (6' gözden) belirli türden yaralar oluşturmak gibi yara izi üzerinde ajanların etkileri test etmek için idealdir. Birkaç vivo içinde kornea yara iyileşme modelleri Ayrıca kapsamlı çalışmalar1yara izi için kullanılmıştır. Daha az kullanılan eski olmuştur vivo kornea yara burada ayrıntılı olarak açıklayan şifa modeli7,8 . Bu yöntemin skarlasma sonuçları çok hücreli bir 3D fibrotik yapımcıları ile karakterize ölçmek için hedeftir kornea ex vivo modeli sistemi.

Bu epitelyal membran normalde ihlal etmediği yaralama kornea epitel 24-72 h9içinde kapanır. Yakında yaralama sonra hücreleri epitel kenarında yayılan ve ücretsiz epitel yüzeye epitel bariyer fonksiyonu yeniden kurmak için geçiş yapma başlayın. Bu etkinlik ardışık olarak kornea bazal hücre çoğalması etkinleştirme tarafından ilk ve, bir sonraki aşamada, kurtarma epitel hücre kitle10,11ulaşmak için dış limbal bölgede bulunan öncü hücrelerinin içinde gelir. Bu yaralar kez skarlasma olmaksizin iyilesmektedir. Ancak, membran kez stroma nüfuz bir yara yara oluşumu1sonuç. Kornea stromal yaralama sonra stroma farklılaştırılmış ikamet stromal hücreler kemik iliği türevi fibrocytes12,13,14gibi birden çok kökenli hücreleri ile doldurulur. Fibrotik yara iyileştirici bir yara myofibroblasts sebat karakterizedir. Bu patolojik myofibroblasts integrinler odak yapışıklıklar, contractile α-düz kas aktin (α-SMA) stres lifleri ve hücre dışı matriks (ECM) yerel etkinleştirme birikimi ile artan yapışma göstermek-münzevi gizli dönüştürme büyüme faktörü-beta (TGFβ). Epitel mezenkimal geçiş (EMT), bilinen, türetilmiş epitel hücreleri farklılaşma da oluşumu6scar için katkıda bulunabilir.

Yaralama sonra hücre farklılaşma ve Apoptozis arasında hassas bir denge olduğunu. Trombosit-türevi büyüme faktörü (PDGF) ve TGFβ gelen gözyaşları ve epitel myofibroblast farklılaşma, TGFβ harekete geçirmek, sürekli otokrin döngüsünü inducing stroma, banyo yapma gibi membran ihlali nedeniyle, büyüme faktörleri ve salgı dağınık fibrotik ECM15,16. İyileşmiş yara myofibroblasts sebat haze ve kornea (Şekil 2) skarlasma teşvik etmektedir. Ancak, regeneratively iyileşmiş yara myofibroblasts geliştirmek rağmen onlar apoptose ve böylece yok olan veya önemli ölçüde azaltılmış numarası (başvuru6,10dakika sonra gözden) iyileşmiş doku. Böylece, fibrotik skarlasma araştırma en azından kısmen aşırı myofibroblast geliştirme veya myofibroblast sebat17,18önlemek molekülleri hedefleme üzerinde odaklanmıştır. Çünkü tüm dokularda19skarlasma ve fibrotik hastalığında myofibroblast sebat karakterize, kornea fibrozis genel hücresel mekanizmaları incelemek için bir model sistem olarak yararlı olabilir.

Modeli sistemimizde bir trephine hala içinde iken dünya denilen silindirik bir bıçak ile kornea yaralı. İnsan ve domuz kornealar yaralı ya da bir 6 veya 7 mm trephine ile; tavşan kornealar için 6 mm trephine tercih edilir. Domuz kornea insan kornea boyutunda benzer. Uygun maliyetli ve çok sayıda hazır oldukları için domuz kornealar rutin olarak organ kültür için kullanılır. Ayrıca, antikorlar ve insan ile tepki için yapılan çift sürekli olarak domuz7ile cross-reacted. Yaralama sonra kornealar limbus ile dünya üzerinden olduğu gibi kesilir ve bir agar/kollajen üzerinde temel monte. Kornealar serum serbest ortamda kültürlenir Ayrıca fibroblast proliferasyonu ve ECM ifade20benzetimi yapmak için C vitamini stabilize. Ne serum eklenmesi ne de büyüme faktörleri myofibroblast oluşumu7ikna etmek için ihtiyaç vardır. Kornealar düzenli olarak sabit ve histoloji için kültür iki hafta sonra işlenir. Gen nakavt veya yara iyileşmesi üzerinde bir ajan etkilerini test etmek için yara ile siRNA yarada7 yaralama sonra tedavi edilebilir veya çözünür bir ajan medya için sırasıyla8eklenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. organ kültür

  1. Hazırlıklar
    1. Agar çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın. Küçük bir şişeye %1 agar ve DMEM-F12 1 mg/mL sığır kolajen hazırlamak ilâ 20 mL. Sıcak plaka üzerinde kaynamaya getir. Çözüm 50 mL konik tüp içine koymak. Tüp güçlendirilerek gelen çözüm tutmak için sıcak tabakta su banyosu yerleştirin.
    2. İlave serum-ücretsiz medya (SSFM) göre sağlanan Malzemeler tablokompozisyon hazırlamak.
      Not: SSFM hazırlıklı olmak için gerekli miktarı işlenecek kornealar sayısına bağlıdır. Genellikle 30 mL 4 kornealar için yeterli ortamıdır.
  2. Diseksiyon
    Not: Bu adım bir diseksiyon başlık veya kimyasal bir başlık yerine getirmek. Gözleri hala küreler korumak için bireysel torbalara bağlı kapakları ile sevk edilir.
    1. Küre etanol temizlenmesi doğrama panosunda bir düz-kenar cerrahi bıçak ile kapakları kaldırın. Aşırı yağ dokusunda bir bıçak veya küçük makas (Şekil 3A, 3B) kullanılarak gözünden kaldırın.
    2. Dünya kapak kaldırma sonra Dünya özafagusu forseps ile tutun ve hemen fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) gözüne batır. Hızlı bir şekilde o eğim % 10 iyot (içinde 100 mL kabı) 3 x. Hızlı bir şekilde PBS (bir ölçek, değişiklik PBS sık ~ 100 mL) 2 x daldırma.
    3. Temiz bir havlu veya doku kullanarak, çepeçevre yeterince baskı ile trephine kesmek için gergin bir kornea yüzey için gözle sarın.
      Not: havlu veya doku kornea iletişim kurmanızı önlemek için dikkat ediniz.
  3. Yaralama
    1. 6 mm trephine kornea merkezi yarası için kullanın. Epitel ve anterior stroma bir tam-kalınlık yara yoluyla tüm kornea yapmadan nüfuz.
      Not: Endotel nüfuz, basınç ve sızıntı sıvı kaybı görülecektir. Bu durumda göz atılmalıdır.
    2. Trephine kornea ortasına yerleştirin, 180 ° saat yönünde ve saat yönünün tersine 5 döndürün x (yönü değişti her zaman o bir kez kabul edilir) yara derinleştirmek için hafif basınç uygularken.
      Not: Yara şimdi forseps çifti kullanılarak kaldırılması bir doku kapak izin vermek için yeterince derin olmalıdır. Bu durumda tekrar adım 1.3.2 değilse.
    3. Kenarlarından kapağı kaldırın. Aynı zamanda, diğer el ile veya ikinci bir kişi ile paralel olarak dünya forseps kapalı yara kenar boşluğu içinde ön kornea kaldırmaya devam ederken dokuyu kesip kesme bir bıçak kullanın. Bu adım sonuç olarak (bkz: Şekil 3 C, 3D) kornea merkezinde yer alan dairesel bir yara olması gerekirdi.
  4. Kesme ve kornea Globe'dan kaldırma
    1. Limbus organ kültüründe eklenmesi doku gözle holding, korneanın küçük bir insizyon attım 1 mm kenar uzak bir bıçak ile olun.
    2. Küçük kullanarak, keskin makas milimetre kenar boşluğunu limbus sağlam tutmak için kornea boyunca tüm dünyada kesmek için önceki adımda oluşturduğunuz kesi erişimi.
    3. PBS, yara yan 1 mL ile 60 mm çanak kornea montaj kadar yerleştirin.
  5. Montaj
    1. Agar bir sıcak sıcaklık (yaklaşık 25 ° C) geldi emin olun.
    2. Forseps iki çift ile bir fincan korneanın endotel yan yüzünde iki tutarak oluşturun. Sıcak-up agar çözüm dolu olduğu kadar steril transfer pipet kullanarak kornea ekleyin.
    3. Agar sertleşir sonra (genellikle yaklaşık 30-45 s) dikkatle kornea agar ile 60 mm plaka (Şekil 3E) çevirmek. Bir kapak ile kapak.
  6. Kuluçka
    1. Plakasına kornealar vasıl 37 ° C'de % 5 CO2 limbal sınırında bir hava-sıvı arayüzey Bakımı SSFM 4 mL ekleyin Medya 24 h ve bundan sonra her gün sonra yenileyin.
      Not: Bir transfection yara içine gerçekleştirmek ise, transfection kadar sonra antibiyotik gözardı et.
    2. Günde bir kez kornea yüzey nemi korumak için çanak şartına medyada SSFM 1 damla ekleyerek ıslak. Bunun için bulaşık kuluçka makinesi dışında bu başlık altında yer, çanak kapağı kaldırmak, steril bir pipet kullanarak çanak medyadan ile yüzey ıslak, tekrar kapak alıp geri kuluçka makinesi.
    3. Gen köşenize için gen hedeflemeyle yarayı tedavi veya complexed lipid-aracılı taşıyıcıya üreticinin yönergeleri (aşağıya bakın) göre siRNA kontrol.
    4. Mix 5 µL (50 pmol) indirimli serum minimum temel medya 50 µL içine siRNA (Örn., Opti-MEM). Mix 2 µL transfection reaktif azaltılmış-serum medya 50 µL içine. Bu sit 5 min için izin ve sonra bunları karıştırın.
    5. Azaltılmış-serum en az medya 200 µL reaktif/siRNA karışıma ekleyin.
    6. Dropwise yara pipet ve 3 h kuluçkaya.
    7. SiRNA çanak medyası ile kornea yüzeyinden dışarı yıkamak. Kuluçka medya değiştirmek için SSFM + ( Tablo reçetesigörmek) antibiyotik. Kuluçka (adımları 1.6.1-1.6.2) daha önce belirttiğimiz gibi devam edin.

2. Histoloji: Parafin kesitler ve Immunostaining

  1. Doku hazırlanıyor
    1. İki haftalık kuluçka sonra bazı doku kornea yarısı boyunca yara kesilmiş sabitleme önce nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi için kullanıyorsanız. Bu yarım veya tek ¼ yerleştirin (yeterli doku da) RNA korumak reaktif sabitleme içine.
    2. Bir standart izolasyon kit kullanarak, RNA yalıtmak ve qRT-PCR gerçekleştirin.
      Not: Alternatif olarak, yaralı bölümü yalnızca getirilebilir izole ve gen ekspresyonu için test edilmiştir.
    3. Diğer yarısı kornea dokusu patoloji kaset yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 2-4 gün için sabitleştirici (% 10 formalin) daldırın.
    4. Parafin bu standart yöntemlerle yaralı kornea yarısı gömün.
      Not: Yaralı kornea dokusu kesit kesit kornea üretecek emin olmak için gelecek şekilde yönlendirin.
  2. Immunostaining 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) kullanarak
    1. Gün 1
      1. Etiket düzgün bir kalem kullanarak slaytlar. Doku Ajan (2 değişiklik, 10 dk) temizlenmesi ile bir kavanoz içine slaytlar yerleştirerek de-paraffinize.
      2. Doku konsantrasyonları (% 100, % 100, % 70, %50, dH2O, dH20, her değişiklik için 5 dk) azalan, etanol içine slaytlar aktararak rehydrate.
      3. Antijen alma sitrat arabellek (10 mM, pH 6.4) 5 min için plastik bir kavanoza slaytlar mikrodalga tarafından gerçekleştirin. İlk 5 dk % 50 güç döngüsü. Sitrat arabelleği ile kavanoz dolum ve tekrarlayın. 10 dakikadır sakin olun.
      4. PBS ile 3 x 2 dakika yıkayın. Doku % 1 ile % 3 normal keçi serum (NGS) RT nemli odasında 1 h için PBS 10dk RT. bloğundaki Triton X-100 bölümleri permeabilize.
      5. Birincil antikor dokuyla kuluçkaya (1: 100 veya tedarikçi da anlaşılacağı gibi) 4 ° c (slayt başına 300 µL) NGS yılında % 3 gecede.
    2. 2. gün
      1. Durulama slaytlar PBST ile 3 x (PBS artı % 1 ara 20), 2 dak. Slaytlar % 3 H2O2 endojen peroksidaz engellemek 10 dakika yerleştirin. 3 x 2 dk PBST ile yıkayın. HRP ikincil antikor (1:250) %3 bölümlerle kuluçkaya NGS RT, 1 h için (slayt başına 300 µL).
      2. Slaytlar 3 yıkama x PBST, 2 dak. Slaytlar DAB kiti ile tedavi. 300 eklemek µL/slayt 3 dk. Yıkama için slaytlar ile dH2O 2 x (hızlı dips).
      3. 20 s. Yıkama için hematoksilen ile slayt dH2O 2 x (hızlı dips) ile counterstain. DH2O yerleştirerek 20 s. Dehydrate doku için 20 s. durulama için mavileştirme Aracısı ile leke etanol (% 50, % 70, % 100, %100, tüm hızlı dips) konsantrasyonları artan içine slaytlar.
      4. 10-20 dk için başlık altında bir kağıt havlu kuru slaytlarda.
      5. Medya, coverslip ile kapak montaj 1 damla kullanarak slaytları bağlayın. Etiket ve RT. mağazasında
      6. Mikroskop altında slayt görüntü ve DAB sinyal ImageJ7 (bakınız Bölüm 4) ile ölçmek.
  3. Immunostaining: floresan
    1. Gün 1 2.2.1. adımda anlatılan adımları izleyin. 2. gün'deaşağıdaki adımları.
    2. Durulama PBST 3 x 2 min için slaytlar. Fluorophore öğesini ikincil antikor %3 bölümlerle kuluçkaya NGS (1: 200) için 1 h RT.
    3. 3 x 2 dk PBST içinde yıkayın. Bir coverslip ile 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) montaj medya ve kapak 1 damla kullanarak slaytları bağlayın. Karanlıkta floresans görüntüleme kadar 4 ° C'de 30 dk mağaza için başlık altında kağıt havlu üzerinde kuru.
  4. Görüntü J kullanarak miktar
    1. DAB miktar boyama için gerekli eklentileri içerir ImageJ "Fiji" sürümünü karşıdan yükleyin.
    2. Fiji ve'yi seçin bir görüntüyü açmak görüntü → → renk renk Deconvolution.
    3. "H DAB" leke seçin ve Tamam'ı tıklatın. Üç yeni fotoğraf-ecek gözükmek. Tek DAB boyama içeren görüntü seçin.
    4. Sadece boyama stromal ölçmek için epitel DAB yansımadan kaldırmak için ImageJ silgi işlevini kullanın.
    5. Seçin → analiz ölçü birimi (ya da Ctrl + M) ve değeri kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İmmünhistokimya olduğunu kullanılan birincil tahlil eski başarısını çözümlemek için şifa deney vivo yara. Şekil 4 epitel ve denetim doku (Şekil 4A, 4B) ön stroma gösteriyor. Altı saat sonra yaralama, epitel (Şekil 4 c, 4 D) yapıldı. Beklendiği gibi yaralama sonra altı gün epitel (4E rakam, 4F) regrown. Bu doku immunostained Alfa-düz kas aktin (α-SMA), hangi ifade myofibroblasts karakterize için yapıldı. α-SMA immunostaining Renkölçer DAB substrat tarafından tespit gibi stroma içinde dramatik bir artış vardır. Ayrıca EMT geçiş7 önerebilir miyim epitel reaktivite bir artış oldu (konuya bakın). Dağınıklığı epitel ve stroma açıktı. Bir yaralama deneyi daha düşük büyütmede ve DAB yerine floresan immunostaining ile (Şekil 4 g, 4 H) gösterilir. Yara kenar boşluğu görülebilen bir degrade active myofibroblasts yanı sıra anterior posterior stroma için.

Fibrotik işaretleri bir hafta (Şekil 4), tutarlı ve güvenilir geliştirme fibrotik işaretlerinin elde etmek için ifade rağmen bir iki haftalık zaman noktası seçildi. Şekil 5 ' te bir tahlil rejeneratif şifa teşvik için test edilecek, denetim ya da gen hedefleme siRNA tek seferlik bir uygulama kullanarak gösterilmiştir. Bu durumda, hedefleme siRNA USP10 için bir deubiquitinase oldu. Patolojik myofibroblasts αv-integrinler odak yapışıklıklar21birikimi ile artan yapışma gösterdi. Bizim önceki çalışmalarda αvβ1 ve αvβ5 önemli fibrotik integrinler kornea stromal şifa7' olduğunu gösterdi. İntegrinler ECM hücre dışında bağlanır ve birlikte içselleştirilmiş. İçselleştirilmiş integrin ubiquitinated ve lysosome bozulması için gönderilen veya Ubikuitin etiketi bir deubiquitinase (DUB) tarafından kaldırılır ve integrin hücre yüzeyine geri kazanılır. Keşfettiğimiz DUB (USP10) gen ekspresyonu artışı Ubikuitin kaldırılması integrin alt birimleri β1 ve β5 oranı artış αv/β1/β5, hücre yüzeyinde, sonraki TGFβ harekete geçirmek ve indüksiyon ile çıkan bir birikimi önde gelen fibrotik işaretleri7. USP10 nakavt kornea organ kültür fibrotik işaretleri7görünümü engelledi. Bu sonuçlar örneği Şekil 5' te gösterilen. Olarak yukarıda, α-SMA myofibroblasts için bir işaretleyici olarak kullanılmaktadır. Yara izi başka bir fibronektin-(FN-EDA), EDA bir RGD αv integrin bağlayıcı etki alanı22,23,24içerir FN splice türevi göstergesidir. Ayrıca hücresel FN (c-FN) olarak adlandırılır. FN-EDA plazma dolaşan değil ama bunun yerine sadece ifade ve tüm koşulları25altında hücreleri tarafından salgılanan bu yana bir anahtar fibrotik marker olarak hizmet vermektedir. Şekil 5A-5 C immunostaining α-SMA için gösterilir. USP10 siRNA7 eklenmesi önemli ölçüde stroma ifadede azaltılmış ise unwounded (Şekil 5Aiçin) karşılaştırıldığında, denetim siRNA (Şekil 5B) yaralama dramatik bir artış α-SMA protein ifadede gösterdi ve epitel. Benzer şekilde, unwounded (Şekil 5 diçin) karşılaştırıldığında, denetim siRNA (5E rakam) yaralama fibronektin-EDA protein ifade USP10 siRNA (5F rakam) ile tedaviye göre dramatik bir artış gösterdi. Immunohistology (Bu durumda, USP10) hedef protein için başarılı devirme7göstermek için kullanıldı. Buna ek olarak, qRT-PCR gerçekleştirme gen nakavt doku ya da diğer fibrotik işaretleri7için tahlil için temin ederim. ImageJ sadece stroma sinyal veya toplam sinyal (Şekil 5G) ölçmek için kullanılabilir. Test edilen her koşul için en az 3 kornealar biz burada gösterilen ve daha önce yayınlanan7istatistiksel anlamlılık oluşturmak için immunostaining ölçmek için kullanılır. Fibrotik işaretler için rutin olarak kullanılan diğer protein kollajen III ifade ve integrin ifade1,26artış vardır.

Şekil 6' da bir toksikoloji tahlil olarak ex vivo kornea kültür kullanımı gösterilmiştir. Bu deneyde, kornealar zaten sol (6A rakam) askerinden, (Şekil 6B), yaralı ya da yaralı ve yıkama ( dışarı önce bir süre artırmak için hücre kültür ortamına eklenen 10 µM Spautin-127ile tedavi Şekil 6C-6F). Spautin-1 özel olarak sigara USP1027hedefleyen bir ilaçtır. USP10 siRNA ile bizim başarı nedeniyle, Spautin tedavi skar önlemede etkili için test edildi. SiRNA, Spautin bu konsantrasyon, doku için toksik. Spautin-1 ile zamanında kültür artan yeniden epithelialization engelledi ve nitel hücre ölümü, dağınık matris ve stromal çarpıtmalara Spautin-1 denetlesinler konsantrasyon iyileşmesine katkıda olmaz düşündüren sonuçlandı. Standart histolojik deneyleri hücre çoğalması ya da apoptozis ölçmek için istihdam edilebilir.

Figure 1
Resim 1 : İnsan gözünün kesiti ile kornea genişletilmiş bir görünümünü. Primatlar ve tavuk, histolojik olarak orada beş ayrı katmanlar: epitel, Bowman'ın membran, stroma, Decement'ın membran ve endotel28,29. Diğer memelilerde, Bowman'ın membran histolojik olarak görünür değil. Transmisyon elektron mikroskobik seviyelerde bir membran ayıran kornea epitel ve Bowman'ın membran olanlar dahil olmak üzere tüm kornealar stroma görülmektedir. Bir sağlam Bowman'ın membran veya epitel stroma ayıran membran bütün memelilerde skar önlemek için gereklidir. Görüntü AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm) izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Diyagramı kornea skarlasma neden hücresel olaylar. Bu diyagram yaralama sonra ön kornea açılmak temel olayları gösterir. (A)epitel, membran, stroma ve gömülü stroma, yani, keratocytes deneniyor hücreleri tasviri. ()B) mekanik olabilir bir yara, bir ülser, virüs veya kalıcı enfeksiyon kırmızı üçgen gösterilmektedir. (Yaralama, buna sonraC) hangi Bowman'ın veya membran gedik, hücrelerin etrafında yara apoptose. (D ve E) hücreleri bir akını yeniden doldurmanız ikamet keratocytes veya kemik iliği türevi fibroblastlar ve geçiş aktif fibroblastlar veya doğrudan myofibroblasts yaradan. (F) bu yapışık patolojik myofibroblasts TGFβ harekete geçirmek bir otokrin döngü ve korneal haze ve yara oluşumu teşvik dağınık fibrotik matris salgılanmasını oluşturun. Bir regeneratively iyileşmiş yara myofibroblasts görünür ancak iyileşmiş doku6,29,30' apoptosed vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Alma ve işleme kornealar organ kültür. Gözleri ile alınır(a)domuz kapakları nakliye sırasında kornea korumak için. (B) görüntü doku kaldırıldıktan sonra dünyanın. 6 mm trephine (C) görüntüsü. Merkez kornea bir trephine ile (D) Wounding. Dünya kaldırılması sonra bağlı kornea (E) görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Yaralama sonra kornea dokusu. Unwounded (kontrol) veya yaralı kornealar Immunohistological analizi. Domuz kornealar unwounded (kontrol) yaptı ya da yaralı. Doku bölümler immunostained myofibroblasts tanımlamak için alfa-düz kas aktin (α-SMA) antikor ile vardı. (A ve B) denetimi, askerinden. (C ve D) yaralı ve sonrası 6 h yaralama sabit. Epitel kaldırıldı (ok) olduğunu. (E ve F) yaralı ve 6 gün sonrası yaralama sabit. Stroma dolu-in ve epitel (ok başı) regrown. Temsilcisi harekete geçirmek myofibroblasts yıldız ile (*) belirtilir. (G, H) α-SMA immunostaining görüntülerini büyütme yaralama sonra 2 hafta düşük: α-SMA (kırmızı), DAPI (mavi). Görüntüleri bir dik floresans/aydınlık alan mikroskobu ile bir CCD kamera ile ele geçirildi. Ölçek çubuğu = 100 µm (A, C, E); 50 µm (B, D, F); 200 µm (G, H). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Rejeneratif şifa ajanlar test. Domuz kornealar vardı ya (A ve D) askerinden (kontrol), (B ve E) yaralı ve denetim siRNA ile tedavi veya (C ve F) yaralı ve USP10 siRNA ile tedavi. Immunostaining (A-C) için α-SMA veya (D-F) fibronektin-EDA. USP10 siRNA ile tedaviden sonra α-SMA 2.2 ± 0,6 kat tarafından düşürüldü *** p < 0,001 ve FN-EDA 3.3 ± 1.2 kat ** p < 0,01. Görüntüleri bir dik floresans/aydınlık alan mikroskobu ile bir CCD kamera ile ele geçirildi. Ölçek çubuğu 50 µm. (G) kornea stromal boyama ImageJ tarafından sayısal olarak =. İstatistiksel anlamlılık tarafından tek yönlü ANOVA Bonferroni'nın testi ile hesaplanır. Şekil Gillespie izniyle adapte olmuş vd.7. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Reepithelialization - toksikoloji çalışmaları üzerindeki etkileri için aracıları test. α-SMA için Immunostaining. Domuz kornealar askerinden(a)ve (B) yaralı vardı. (C-F) Kornea yaralı ve 10 µM ile inkübe Spautin-1. Engelleyici yıkanmış ve medya tarafından (Csonra) 2 gün, (D) 4 gün, (E) 6 gün, (F) 14 gün yerini aldı. Kuluçka dönemi sırasında tüm medya değişikliklerini Spautin belirtildiği şekilde dahil. Tüm kornealar sabit ve kültür 2 hafta sonra parafin içinde gömülü. Görüntüleri bir dik floresans/aydınlık alan mikroskobu ile bir CCD kamera ile ele geçirildi. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı bir doğal tabakalı 3D ortamda yara iyileşmesi eğitim için bir modeli açıklar. Bir ara içinde vivo çalışmalar arasındaki hücre kültürü olarak organ kültür kullanımı yanı sıra canlı hayvanlar üzerinde azalan bakiyeli yönergeleri maliyeti önemli ölçüde azaltır. Diğer 3D modelleri kollajen jelleri birincil insan kornea fibroblastlar2 ya da bu aynı hücrelere yapılan kendi kendine sentezleme dahil olmak üzere alana büyük fayda hayvan kaynaklı collagens31yapılan jelleri içinde gömülü. Organ kültür modeli sistemi özellikle sözde şifa ajanlar yara yerelleştirilmiştir ve böylece temiz bir kenar boşluğu arasında yoktur aynı kornea (Şekil 4) yaralı ve yaralı olmayan dokuda beri test etmek için kullanışlıdır. Buna ek olarak, bir mekanik trephine yara yara (Şekil 5) içine çift, yönetimi için mükemmel olan stroma, doğrudan erişim sağlar. Her ne kadar burada gösterilmeyen, organ kültür kornea dokusu içine viral iletim da gösterdiği32,33,34olmuştur. Bu testin başka bir permütasyon kornealar yaralama sonra ilgi ve görüntü gen ekspresyonu gerçek zamanlı bir muhabir yapı ile enfekte olur. Çeviri için içinde vivo çalışmalar açısından bu aynı prosedür tamamlandı tavşan35 ve böylece organ kültür insan, domuz veya tavşan kornealar içinde vivo sonuçları karşılaştırılır. Deneyim, biz siRNA tedaviyle organ kültür modeli kullanılarak elde veri benzer bulgular vivo içinde (yayınlanmamış veri) çevirdik. Organ kültür kornealar fonksiyonel limbal damarlara, gözyaşları ve sulu mizah yoksun olduğundan, bu uzun bir faydalı model kendi çalışmaları için olacaksa her araştırmacı değerlendirmek gerekir. Yerleşik bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu gösterdi ama tam paralel olarak içinde vivo çalışmalar henüz net1değil.

Önemli bir adım protokolündeki kornea çok derinden yaralı tarafından nüfuz değil etmektir. Bu durumda ön odası sıvı sızıntısı olacak bu açık olacaktır. Bu durum ortaya çıkarsa, dünya atılmalıdır. Hatta mekanik bir yara üretmek için bir forcep ile trephined alanı içinde sinirlari dokusunun dudak kavrama ve sonra cerrahi bıçak doku kes gitsin yara trephine sınırları içinde kornea yüzeyine paralel hareket. Kornea yüzey böylece biz kuru değil agar karışım doğru sıcaklıkta olana orayı yara yapma ve kornea dünya,--dan kesmek sonra kornea ön yüzü aşağı dönük PBS tavsiye. Agar çok sıcak değil emin endotel hasarı önlemek olacaktır.

Bir kısıtlamadır bu modelin bir yara üretmek için bir trephine kullanımı düzensiz ve aynı şekilde kornea kornea yaraları lazer kaynaklı36için karşılaştırıldığında çoğaltılamaz. Ancak, doğal olarak meydana gelen yara derinlemesine tüm eşdeğer değildir ve veri büyük gövdeli öneririz herhangi bir ihlali Bodrum zarda stroma içinde myofibroblast geliştirme ve pus oluşturur membran yenileme yol açar, ancak skarlasma37,38,39azaldı. Bu domuz kornea organ kültür model membran trephine alanı içinde kaldırılır ciddi bir yara kullanır. Myofibroblasts ve korneal stroma fibrotik işaretleyicilerini gelişimi sürekli olmuştur ve tekrarlanabilirlik bu model sistem kullanarak elde. Bazı epitel boyama genellikle belirgindir yaralı ve regrown epitel koyulaştırır. Bu diğer kornea organ Kültür raporları40 gösterdi ama çoğu kornealar vivo içinde fare yok ve çalışmalar41,42tavşan. Ancak, güçlü epitel α SMA içinde epitel43yaralama sonra boyama içinde vivo bir köpek modelinde gerçekleştirilen bir çalışma gösterdi. Rejeneratif çalışmalarımız de önemli ölçüde şifa terfi siRNA epitel (fibrotik skarlasma) EMT geçiyor olması düşündüren bu epitel immunostaining azaltılmış ne zaman organ kültür regrows. Buna ek olarak, birincil bir antikor boyama yaralı bir kornea protokolünden içinde ihmal immunostaining belirli olduğunu düşündüren7 boyama toplam yokluğunda sonuçlandı. Donmuş bölümler (gösterilmez) bölümleri bu konuda alkol benzerdi. Ancak, hangi histolojik hiçbir arka plan var görünüyor epitel içinde boyama hafif ama değişken arka bizim laboratuvar sadece stromal boyama sayısal çünkü7verir.

İnsan kornealar yaralama, tam küreler yerine nakli için kullanılan değil kornealar elde daha fazla maliyet etkin40olabilir. Bu durumda, kornea dünya tarafından tanınan basınç yardımı olmadan yaralı. Ek yaralama stratejileri kapsamlı bir yara izi42üretmek için vivo kullanılmıştır kornea yanığı içerebilir.

Özet olarak, bu sistem için tahlil şifa bir 3D doku yara avantajları, tekrarlanabilirlik ve maliyet tasarrufu gözlemleyerek ve doku iyileşmesi ajanların etkileri miktarının için mükemmel bir kaynak yapma sadece standart donanım gereksinimleri olan var.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Bu eser NIH NEI R01 EY024942, araştırma önlemek körlük, şehir dışında Üniversitesi Tıbbi sınırsız Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir ve aslanlar bölge 20-Y. mikroskobu ve görüntü analizi parafin bölümlerin mikroskobu özünde gerçekleştirilen ve histolojik slayt hazırlama Biorepository ve Sina Dağı, Icahn Tıp Fakültesi Patoloji özünde gerçekleştirildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

Tıp sayı: 144 kornea Scarring fibrozis Myofibroblast Ex vivo Organ kültür
Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro, N., Gillespie, S. R.,… More

Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter