Summary
Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.
Abstract
La cornea è stata utilizzata ampiamente come sistema modello per studiare la guarigione della ferita. La capacità di generare ed utilizzare le cellule di mammifero primarie in due dimensioni (2D) e tridimensionali (3D) tre cultura ha generato una ricchezza di informazioni non solo sulla biologia della cornea, ma anche sulla ferita guarigione, biologia dei miofibroblasti e cicatrici in generale . L'obiettivo del protocollo è un sistema di test per quantificare lo sviluppo dei miofibroblasti, che caratterizza lo sfregio. Dimostriamo un organo corneale cultura ex vivo modello utilizzando maiale occhi. In questo keratectomy anteriore ferita, cornee ancora nel globo sono ferite con una lama circolare chiamata un trephine. Una spina di circa 1/3 della cornea anteriore viene rimosso compreso l'epitelio, la membrana dello scantinato e la parte anteriore dello stroma. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo, montate su una base di collagene/agar e coltivate per due settimane in mezzo libero siero integrato con vitamina C stabilizzata per aumentare la proliferazione delle cellule e la secrezione extracellulare dai fibroblasti residente. Attivazione dei miofibroblasti nello stroma anteriore è evidente nella cornea guarita. Questo modello può essere utilizzato di saggiare la chiusura della ferita, lo sviluppo di miofibroblasti e fibrotici marcatori e per gli studi di tossicologia. Inoltre, gli effetti di piccole molecole inibitrici, come pure la transfezione di siRNA del lipido-mediata per atterramento di gene possono essere analizzati in questo sistema.
Introduction
Cicatrici nella cornea derivanti da lesioni, traumi o infezione può portare a debilitante opacità e perdita permanente della vista. Così, c'è una necessità critica di individuare percorsi che possono essere oggetto di intervento terapeutico. Opzioni correnti di trattamento sono limitate e sono costituiti principalmente di trapianti corneali, che non sono accessibili ai pazienti in tutto il mondo. Sia umani (Figura 1) e cornee animale possono essere utilizzate per il 2D e coltura cellulare 3D studi1,2. Non adatto per il trapianto di cornee cadavere umano possono essere ottenute da banche degli occhi o le banche di tessuti centralizzata (nazionale malattia ricerca Interchange (NDRI)), e gli occhi degli animali possono essere ottenuti da un mattatoio. Primarie di cellule epiteliali corneale e più recentemente, le cellule endoteliali, fibroblasti stromal può essere isolato e coltivato da questi tessuti per la guarigione della ferita e tossicologia studi3,4,5. Oltre all'importanza di comprendere le basi molecolari di malattia dell'occhio di accecante, l'accessibilità del tessuto e la capacità di cellule primarie di cultura ha reso la cornea un importante sistema modello per lo studio. La cornea è ideale per testare gli effetti di agenti su cicatrici come la cornea normale è trasparente e certi tipi di ferite creano opacità o cicatrici fibrotiche (rivisto in6). Diversi in vivo della ferita corneale guarigione modelli inoltre sono stati utilizzati estesamente per cicatrici studi1. Meno utilizzati è stato l'ex vivo cornea ferita guarigione modello7,8 che è descrivere in dettaglio qui. L'obiettivo di questo metodo è quello di quantificare i risultati sfregio caratterizzati dai creatori fibrotiche in un 3D multicellulari corneale ex vivo modello di sistema.
Ferendo epiteliale corneale che non violano la membrana basale epiteliale normalmente si chiude entro 24-72 h9. Presto dopo la ferita, le cellule al bordo dell'epitelio iniziare la diffusione e la migrazione in superficie epiteliale libera, per ristabilire la funzione di barriera epiteliale. Questa attività in sequenza è seguita dall'attivazione di proliferazione delle cellule basali corneale prima e, in una fase successiva, di cellule precursori situato presso la zona limbal esterna per ottenere il recupero di cellule epiteliali massa10,11. Queste ferite spesso guariscono senza lasciare cicatrici. Tuttavia, una ferita che penetra la membrana dello scantinato dello stroma spesso comporta cicatrice formazione1. Dopo la ferita corneale stromale, lo stroma è popolato con cellule di origini multiple tra cui differenziate cellule stromale residenti così come derivate da midollo osseo fibrociti12,13,14. Cicatrici fibrotiche è caratterizzata dalla persistenza di myofibroblasts in una guarigione della ferita. Questi myofibroblasts patologico dimostrare adesione aumentata attraverso l'accumulo delle integrine nell'adesioni focali, fibre contrattili α-liscia del muscolo actina (α-SMA) stress e attivazione locale della matrice extracellulare (ECM)-sequestrato trasformazione di latente crescita fattore-beta (TGFβ). La differenziazione delle cellule epiteliali derivate, noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), può anche contribuire per cicatrice formazione6.
C'è un delicato equilibrio tra differenziazione cellulare e l'apoptosi dopo la ferita. A causa della violazione nella membrana dello scantinato, fattori di crescita come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e TGFβ da lacrime e l'epitelio si bagnano lo stroma, inducendo la differenziazione dei miofibroblasti, un loop autocrino sostenuta di attivazione del TGFβ e la secrezione di disorganizzato fibrotica ECM15,16. La persistenza dei miofibroblasti nella ferita guarita promuove haze e cicatrici nella cornea (Figura 2). Tuttavia, in regeneratively guarito ferita anche se sviluppano miofibroblasti, essi apoptose e così sono assenti o significativamente ridotto in numero nel tessuto guarito (rivisto in riferimento6,10). Così, ricerca su cicatrici fibrotiche si è concentrata, almeno in parte sul targeting molecole che impediscono lo sviluppo eccessivo dei miofibroblasti o myofibroblast persistenza17,18. Perché myofibroblast persistenza caratterizza la malattia sia sfregio e fibrotica in tutti tessuti19, la cornea può essere utile come sistema modello per lo studio dei meccanismi cellulari generali di fibrosi.
Nel nostro sistema di modello, la cornea è ferita con una lama cilindrica chiamata un trephine mentre ancora nel globo. Umano e cornee di maiale possono essere ferite con entrambi un trephine 6 o 7 mm; per le cornee coniglio un trephine 6mm è preferito. La cornea di maiale è simile a quello della cornea umana. Perché essi sono efficaci e prontamente disponibili in gran numero, cornee di maiale sono abitualmente utilizzate per la coltura di organo. Inoltre, gli anticorpi e siRNA fatti reagire con umani hanno costantemente traversa-ha reagito con maiale7. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo con il limbus intatte e montato su un base di agar/collagene. Le cornee sono coltivate in terreni privi di siero più stabilizzata di vitamina C per simulare la proliferazione dei fibroblasti e la deposizione di ECM20. L'aggiunta di siero né fattori di crescita sono necessari per indurre myofibroblast formazione7. Le cornee sono ordinariamente fissa e trattate per istologia dopo due settimane di cultura. Per atterramento di gene, o per testare gli effetti di un agente sulla guarigione delle ferite, la ferita può essere trattata con siRNA nella ferita dopo che7 o un agente di purificazione può essere aggiunto ai media, rispettivamente8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. organo cultura
-
Preparazioni
- Preparare la soluzione di agar come segue. In un piccolo pallone, preparare 1% agar e il collagene bovino 1 mg/mL in DMEM-F12 fino a 20 mL. Portare ad ebollizione su un piatto caldo. Mettere la soluzione in una provetta conica da 50 mL. Posizionare il tubo in un bagno di acqua su una piastra calda per mantenere la soluzione da solidificarsi.
- Preparare i supporti senza siero completati (SSFM) secondo la composizione fornito in Tabella materiali.
Nota: La quantità necessaria di SSFM essere preparati dipende dal numero delle cornee da elaborare. 30 mL è solitamente abbastanza media per 4 cornee.
-
Dissezione
Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa di dissezione o una cappa chimica. Gli occhi vengono spediti con coperchi ancora attaccati in singoli sacchetti per proteggere i globi.- Rimuovere globi da coperchi con una lama chirurgica retti su un tagliere pulito di etanolo. Rimozione di tessuto adiposo in eccesso dall'occhio utilizzando una lama o un piccolo paio di forbici (Figura 3A, 3B).
- Dopo aver rimosso il globo dal coperchio, tenere il mondo posteriormente con il forcipe e immergere immediatamente l'occhio in tampone fosfato salino (PBS). Rapidamente si tuffo 3x in 10% di iodio (in un becher da 100 mL). Immergere rapidamente 2x in PBS (~ 100 mL in un becher da PBS cambia frequentemente).
- Utilizzando un asciugamano pulito o tessuto, avvolgere l'occhio lungo la circonferenza con una pressione sufficiente per avere una superficie cornea tesa a tagliare con il trapano.
Nota: fare attenzione per evitare l'asciugamano o tessuto dal contatto con la cornea.
-
Ferendo
- Utilizzare un trephine 6mm per ferita al centro della cornea. Penetrare l'epitelio e lo stroma anteriore senza fare una ferita di pieno-spessore attraverso l'intera cornea.
Nota: Se è penetrato l'endotelio, una perdita di pressione e liquido sarà visibili. In questo caso l'occhio deve essere eliminata. - Posizionare il trephine al centro della cornea, ruotarla di 180° in senso orario e antiorario 5 x (ogni volta che il senso è cambiato conterà come una volta) esercitando una leggera pressione per approfondire la ferita.
Nota: La ferita dovrebbe essere abbastanza profonda da consentire un lembo di tessuto da sollevare utilizzando un paio di pinze. Se questo non è il caso ripetere il punto 1.3.2. - Sollevare la linguetta dai bordi. Allo stesso tempo, con l'altra mano o con una seconda persona, utilizzare una lama, taglio parallelo al globo per tagliare il tessuto come il forcipe continuano a sollevare la cornea anteriore all'interno del margine della ferita. A conclusione di questa fase ci dovrebbe essere una ferita circolare situata al centro della cornea (Vedi Figura 3 C, 3D).
- Utilizzare un trephine 6mm per ferita al centro della cornea. Penetrare l'epitelio e lo stroma anteriore senza fare una ferita di pieno-spessore attraverso l'intera cornea.
-
Taglio e rimozione di Cornea dal globo
- Tenendo l'occhio con il tessuto, praticare una piccola incisione 1 mm dal bordo della cornea con una lama affinché il limbus è incluso nella coltura di organo.
- Utilizzando piccoli, forbici affilate accedere l'incisione creata nel passaggio precedente per tagliare intorno al globo, mantenendo un margine di millimetro in tutta la cornea per mantenere intatto il limbus.
- Posizionare la cornea in un piatto di 60 mm con 1 mL di PBS, ferita laterale verso il basso fino al montaggio.
-
Montaggio
- Assicurarsi che l'agar è venuto a una temperatura calda (circa 25 ° C).
- Con due paia di pinze, creare una tazza con il sollevare i due lati della cornea con il lato endoteliale. Aggiungere la soluzione di agar riscaldato nella cornea utilizzando una pipetta sterile fino a quando è pieno.
- Dopo l'agar si indurisce (solitamente circa 30-45 s) Capovolgere attentamente la cornea con l'agar nella piastra di 60 mm (Figura 3E). Coprire con un coperchio.
-
Incubazione
- Aggiungere 4 mL di SSFM alla piastra, mantenendo le cornee ad un'interfaccia aria-liquido al confine limbal in 5% CO2 a 37 ° C. Aggiornamento media dopo 24 h e da allora in poi ogni altro giorno.
Nota: Se si esegue una trasfezione nella ferita, omettere gli antibiotici fino a dopo la trasfezione. - Bagnare la superficie cornea, una volta al giorno aggiungendo 1 goccia di SSFM dal media condizionati nel piatto per mantenere l'umidità. Per questo, prendere il piatto fuori l'incubatrice, posizionarlo sotto il cofano, togliere il coperchio piatto, bagnare la superficie con i media da piatto utilizzando una pipetta sterile, coprire nuovamente e rimetterlo a posto presso l'incubatore.
- Per atterramento di gene, trattare la ferita con gene-targeting o controllo siRNA che è complessato ad un elemento portante del lipido-mediata seguendo le istruzioni del fornitore (Vedi sotto).
- Mix 5 µ l (50 pmol) di siRNA in 50 µ l di siero ridotto minimo essenziale media (ad es., Opti-MEM). Mescolare 2 µ l di reagente di transfezione in 50 µ l di siero ridotto media. Lasciate che questo sedersi per 5 min e poi mescolare.
- Aggiungere 200 µ l di siero ridotto minimo media alla miscela reagente/siRNA.
- Pipettare goccia a goccia sulla ferita e incubare per 3 h.
- Lavare siRNA dalla superficie corneale con media nel piatto. Modificare i media di incubazione SSFM + antibiotici (Vedi la Tabella materiali). Continuare l'incubazione come accennato in precedenza (punti 1.6.1-1.6.2).
- Aggiungere 4 mL di SSFM alla piastra, mantenendo le cornee ad un'interfaccia aria-liquido al confine limbal in 5% CO2 a 37 ° C. Aggiornamento media dopo 24 h e da allora in poi ogni altro giorno.
2. istologia: Sezioni della paraffina e Immunostaining
-
Preparare il tessuto
- Dopo un'incubazione di due settimane, se usare il tessuto per quantitativa della polimerasi reazione a catena (qRT-PCR) analisi in tempo reale, prima del fissaggio, tagliata la cornea nella metà attraverso la ferita. Posizionare questa metà o solo ¼ (o è abbastanza tessuto) in RNA-proteggere reagente di stabilizzazione.
- Utilizzando un kit di isolamento standard, RNA di isolare ed eseguire qRT-PCR.
Nota: In alternativa, la parte ferita solo può essere isolata e testata per l'espressione genica. - Inserire l'altra metà della cornea in cassette di patologia di tessuti e immergere nel fissativo (formalina al 10%) per 2-4 giorni a temperatura ambiente (TA).
- Paraffina incorporare questa metà della cornea ferita utilizzando tecniche standard.
Nota: Orientare la cornea ferita per garantire che il tessuto sezionamento produrrà una sezione trasversale della cornea.
-
Immunostaining usando 3, 3'-diaminobenzidina (DAB)
-
1 ° giorno
- Etichetta scorre correttamente utilizzando una matita. De-paraffinize il tessuto inserendo diapositive in un barattolo con intermedium (2 cambi, 10 min. ciascuno).
- Reidratare il tessuto trasferendo i vetrini in etanolo a diminuire le concentrazioni (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 min per ogni modifica).
- Eseguire ricupero dell'antigene di microwaving le diapositive in un barattolo di plastica con tampone citrato (10 mM, pH 6.4) per 5 min. Primo ciclo di 5 min a 50% di potenza. Riempire il vaso con tampone citrato e ripetere. Raffreddare per 10 minuti.
- Lavare 3 volte con PBS, 2 min ciascuno. Permeabilize tessuto con 1% Triton X-100 in PBS 10 min a RT. blocco sezioni con siero di capra normale 3% (NGS) per 1 h a temperatura ambiente in camera umida.
- Incubare il tessuto con l'anticorpo primario (1: 100 o come suggerisce il fornitore) nel 3% NGS durante la notte a 4 ° C (300 µ l per vetrino).
-
2 ° giorno
- Risciacquo diapositive 3 volte con PBST (PBS più 1% Tween 20), 2 min ciascuno. Posizionare le diapositive nel 3% H2O2 per 10 min bloccare perossidasi endogena. Lavare 3 volte con PBST, 2 min ciascuno. Incubare le sezioni con anticorpo secondario HRP (1: 250) nel 3% NGS per 1h a RT (300 µ l per vetrino).
- Lavare i vetrini 3 x PBST, 2 min ciascuno. Trattamento di diapositive con il kit DAB. Aggiungere 300 µ l/scorrevole per 3 min lavaggio degli acquascivoli con dH2O 2 x (rapido DIP).
- Colorante di contrasto con ematossilina per 20 s. lavare il vetrino con dH2O 2 x (rapido DIP). Macchia con agente azzurrante per 20 s. risciacquo in dH2O per 20 s. disidratare tessuto inserendo diapositive in aumento delle concentrazioni di etanolo (50%, 70%, 100%, 100%, tutte le salse rapidi).
- A secco di diapositive su un tovagliolo di carta sotto il cofano per 10-20 min.
- Montare diapositive utilizzando 1 goccia di montanti, coprire con vetrino coprioggetto. Etichetta e memorizzare a TA.
- I vetrini con un microscopio di immagine e quantificare il segnale DAB con ImageJ7 (vedere paragrafo 4).
-
1 ° giorno
-
Immunostaining: fluorescenza
- Il giorno 1 seguire la procedura descritta al punto 2.2.1. Il giorno 2procedere come segue.
- Risciacquo diapositive 3x in PBST per 2 minuti ciascuno. Incubare le sezioni con anticorpo secondario fluorophore-etichetta in 3% NGS (1: 200) per 1 h a TA.
- Lavare 3x in PBST, 2 min ciascuno. Montare diapositive utilizzando 1 goccia di 4 ′, mezzi di montaggio 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e coprire con un vetrino coprioggetti. Asciugare su carta assorbente sotto il cofano per 30 min. Store al buio a 4 ° C fino a fluorescenza.
-
Quantificazione mediante immagine J
- Scaricare la versione di "Fiji" di ImageJ, che include i plugin necessari per quantificazione di colorazione DAB.
- Aprire un'immagine in Fiji e selezionare immagine → colore → deconvoluzione di colore.
- Selezionare "H DAB" come la macchia e quindi fare clic su OK. Tre nuove immagini appariranno. Selezionare l'immagine che contiene solo DAB macchiatura.
- Per quantificare stromal macchiatura solo, è necessario utilizzare la funzione di gomma ImageJ per rimuovere l'epitelio dall'immagine DAB.
- Selezionare analizzare → misura (o Ctrl + M) e registrare il valore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunohistochemistry è il test primario utilizzato per analizzare il successo dell'ex vivo ferita guarigione esperimento. Figura 4 raffigura l'epitelio e stroma anteriore in tessuto di controllo (Figura 4A, 4B). Sei ore dopo la ferita, l'epitelio era assente (Figura 4, 4D). Sei giorni dopo la ferita come previsto, l'epitelio aveva ricresciuti (Figura 4E, 4F). Questo tessuto è stato immunostained per l'actina alfa-liscia del muscolo (α-SMA), la cui espressione caratterizza i myofibroblasts. C'è un aumento drammatico in α-SMA immunostaining nello stroma come rilevato da substrato DAB colorimetrico. C'era anche un aumento della reattività epiteliale che può suggerire EMT transizione7 (Vedi la discussione). Disorganizzazione nell'epitelio e stroma era evidente. Un esperimento ferentesi a basso ingrandimento e con fluorescente immunostaining anziché DAB è mostrato (Figura 4, 4 H). Il margine della ferita è visibile come una sfumatura di miofibroblasti attivo da anteriore a stroma posteriore.
Sebbene fibrotici marcatori sono espresse da una settimana (Figura 4), per ottenere lo sviluppo coerenza e affidabile dei marcatori fibrotici, è stato scelto un punto di tempo di due settimane. Nella Figura 5 è dimostrata un'analisi usando un'applicazione di una tantum di controllo o siRNA gene-targeting per essere testati per promuovere guarigione rigenerativa. In questo caso, il targeting siRNA era per USP10, un deubiquitinase. Myofibroblasts patologico ha dimostrato adesione aumentata attraverso l'accumulo di αv-integrine adesioni focali21. Nostri studi precedenti hanno mostrato che αvβ1 e αvβ5 sono integrine fibrotiche importante nella guarigione stromal corneale7. Le integrine legano ECM all'esterno della cellula e insieme essi sono interiorizzati. L'integrina interiorizzato viene ubiquitinata e inviato per la degradazione nel lisosoma o il tag ubiquitina viene rimosso da un deubiquitinase (DUB) e l'integrina è riciclato alla superficie delle cellule. Abbiamo scoperto che un aumento nell'espressione genica di DUB (USP10) ha aumentato il tasso di rimozione di ubiquitina dall'integrina subunità β1 e β5 che conduce ad un'accumulazione risultante di αv/β1/β5, sulla superficie delle cellule, con conseguente attivazione del TGFβ e induzione di fibrotica marcatori7. Atterramento di USP10 nella coltura di organo corneale ha impedito la comparsa di marcatori fibrotica7. Nella Figura 5è riportato un esempio di questi risultati. Come sopra, α-SMA è utilizzato come indicatore per i myofibroblasts. Un altro indicatore di cicatrici è Fibronectin-EDA (FN-EDA), una variante di splicing di FN che contiene un RGD, αv integrina associazione dominio22,23,24. È anche definito cellulare FN (c-FN). Serve come indicatore fibrotico chiave poiché FN-EDA non è in circolazione al plasma ma invece è solo espressa e secreta dalle cellule sotto condizioni fibrotiche25. In Figura 5A-5C immunostaining per α-SMA è indicato. Rispetto alle umiliazioni (Figura 5A), ferendo più siRNA di controllo (figura 5B) hanno mostrato un aumento drammatico nell'espressione della proteina α-SMA, mentre l'aggiunta di USP10 siRNA7 ha ridotto drammaticamente espressione nello stroma e epitelio. Allo stesso modo, rispetto alle umiliazioni (Figura 5), ferendo più siRNA di controllo (Figura 5E) ha dimostrato un aumento drammatico nell'espressione della proteina di fibronectin-EDA rispetto al trattamento con siRNA USP10 (Figura 5F). Immunohistology per la proteina dell'obiettivo (in questo caso, USP10) è stato usato per dimostrare il successo atterramento7. Inoltre, l'esecuzione qRT-PCR può assicurare atterramento genica nel tessuto o anche test per altri marcatori fibrotica7. ImageJ può essere utilizzato per quantificare il segnale nello stroma solo o totale (Figura 5). Almeno 3 cornee per ogni condizione in fase di test devono essere utilizzate per quantificare immunostaining per generare significato statistico, come abbiamo mostrato qui e precedentemente pubblicato7. Altre proteine che sono state utilizzate abitualmente per marcatori fibrotici sono espressione del collagene III e un aumento nell'espressione delle integrine1,26.
In Figura 6, l'uso di ex coltura cornea vivo è dimostrato come un'analisi di tossicologia. In questo esperimento, cornee erano o sinistra illesi (Figura 6A), feriti (Figura 6B), o ferito e trattati con 10 µM Spautin-1,27, che è stato aggiunto al terreno di coltura delle cellule per periodi di tempo prima di wash out ( più Figura 6-6F). Spautin-1 è un farmaco non specifico destinato a USP1027. A causa del nostro successo con USP10 siRNA, Spautin trattamento è stato testato per l'efficacia nella prevenzione di cicatrici. A differenza del siRNA, Spautin a questa concentrazione era tossico per i tessuti. Aumentando il tempo con Spautin-1 nella cultura ha impedito di riepitelizzazione e provocato la morte delle cellule qualitativa, matrice disorganizzato e stromali vacuoli suggerendo che Spautin-1 non promuovere la guarigione alla concentrazione analizzata. Le analisi istologiche standard possono essere impiegate per quantificare la proliferazione cellulare o apoptosi.
Figura 1 : Sezione trasversale di un occhio umano con una visualizzazione espansa della cornea. Nei primati e polli, istologicamente ci sono cinque strati distinti: epitelio, Bowman membrana, lo stroma, di Decement membrana ed endotelio28,29. In tutti gli altri mammiferi, membrana di Bowman non è visibile istologicamente. A livello microscopico dell'elettrone di trasmissione, una membrana dello scantinato è osservata che separa l'epitelio corneale e lo stroma in tutte le cornee, compresi quelli con membrana di Bowman, un. Di un intatto Bowman membrana o membrana basale che separa l'epitelio dallo stroma è una condizione necessaria per evitare cicatrici in tutti i mammiferi. Immagine ristampato con il permesso da AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Diagramma di eventi cellulari che portano alla cicatrizzazione corneale. Questo diagramma Mostra gli eventi di base che si dipanano nella cornea anteriore dopo la ferita. (A) rappresentazione dell'epitelio, membrana basale, lo stroma e le cellule quiescenti incorporate in stroma, cioè, keratocytes. (B) il triangolo rosso raffigura una ferita, che può essere meccanica, un'ulcera, virus o infezione persistente. (C) dopo il ferimento, in cui l'arciere o della membrana dello scantinato è violata, le cellule intorno il apoptose ferita. (D ed E) un afflusso delle cellule ripopolare la ferita da cheratociti residente o fibroblasti derivanti dal midollo osseo e transizione in fibroblasti attivati o direttamente in miofibroblasti. Myofibroblasts patologico (F) questi aderente creare un loop autocrino di attivazione del TGFβ e secrezione della matrice fibrotica disorganizzato che promuove la formazione di haze e cicatrice cornea. In una ferita regeneratively guarita, myofibroblasts compaiono ma abbiamo apoptosed in tessuto guarito6,29,30. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Ricezione e l'elaborazione di cornee per cultura organistica. (A) maiale occhi vengono ricevuti con coperchi per proteggere la cornea durante la spedizione. (B) immagine del globo dopo la rimozione di tessuto. (C) immagine di un trephine di 6 mm. (D) ferire della cornea centrale con un trapano. (E) immagine della cornea montata dopo la rimozione dal globo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Tessuto corneale dopo ferimento. Analisi di Immunohistological di umiliazioni (controllo) o cornee ferite. Cornee di maiale sono state lasciate illesi (controllo) o ferite. Sezioni di tessuto immunostained con l'anticorpo per l'actina alfa-liscia del muscolo (α-SMA) per identificare i myofibroblasts. (A e B) controllo, illesi. (C e D) Wounded e fissato a 6 h post-ferimento. Epitelio è rimossa (freccia). (E e F) Wounded e fissato a 6 giorni post-ferimento. Lo stroma ha compilato e l'epitelio è ricresciuto (testa di freccia). Rappresentante miofibroblasti attivati sono contrassegnati con un asterisco (*). (G, H) Immagini di ingrandimento di immunostaining α-SMA a basso 2 settimane dopo la ferita: α-SMA (rosso), DAPI (blu). Immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza/brightfield verticale con una camera CCD. Barra della scala = 100 µm (A, C, E); 50 µm (B, D, F); 200 µm (G, H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Test agenti di guarigione rigenerativi. Le cornee di maiale erano o (A e D) illesi (controllo), (B ed E) ferito e trattate con siRNA di controllo, o (C e F) ferito e trattati con siRNA USP10. Immunostaining per (A-C) α-SMA (D-F) o Fibronectin-EDA. Dopo il trattamento con USP10 siRNA, α-SMA è stata ridotta di 2,2 ± 0.6 piega * * * p < 0,001 e FN-EDA 3.3 ± 1.2 piega * * p < 0.01. Immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza/brightfield verticale con una camera CCD. Barra della scala = 50 µm. (G) corneale stromale colorazione come quantificato dal ImageJ. Significatività statistica è stata calcolata da One-way ANOVA con test di Bonferroni. Nella figura è stata adattata con permesso da Gillespie et al.7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Test agenti per effetti il reepithelialization - studi di tossicologia. Immunostaining per α-SMA. Le cornee di maiale erano illesi (A) e (B) ferito. (C-F) Cornea sono stati feriti e incubate con 10 µM Spautin-1. L'inibitore è stato lavato e sostituito dai media dopo (C) 2 giorni, (D), 4 giorni, (E), 6 giorni, (F), 14 giorni. Tutte le modifiche di media durante il periodo di incubazione incluse Spautin come indicato. Tutte le cornee erano fissi e inclusi in paraffina dopo 2 settimane nella cultura. Immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza/brightfield verticale con una camera CCD. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive un modello di studio della guarigione della ferita in un ambiente naturale di 3D stratificato. Uso della cultura di organo come intermedio tra coltura cellulare e gli studi in vivo riduce significativamente i costi, nonché riducendo le procedure sugli animali vivi. Altri modelli 3D sono stati di grande beneficio per il campo tra cui self-sintetizzazione gel di collagene in fibroblasti corneali umano primario2 o queste stesse cellule incorporati in gel fatto da collageni di derivazione animale31. Il sistema di modello di cultura dell'organo è particolarmente utile per testare agenti presunti guarigione quanto la ferita è localizzata e quindi c'è un margine chiaro fra il tessuto ferito e non feriti nella cornea stessa (Figura 4). Inoltre, una ferita di trapanazione meccanica consente l'accesso diretto allo stroma, che è eccellente per l'amministrazione di siRNA nella ferita (Figura 5). Anche se non è indicato qui, trasduzione virale nel tessuto cornea nella coltura di organo è stata anche dimostrata32,33,34. Un'altra permutazione di questo test sarebbe quello di infettare le cornee con una costruzione del reporter di espressione del gene di interesse e immagine in tempo reale dopo la ferita. In termini di traduzione a studi in vivo, questa stessa procedura può essere eseguita in conigli35 e così cultura organistica sull'essere umano, maiale, o le cornee coniglio possono essere paragonate ai risultati in vivo. Nella nostra esperienza, i dati che abbiamo ottenuto utilizzando il modello di cultura di organo con trattamento del siRNA sono tradotte in simili risultati in vivo (dati non pubblicati). Dal momento che le cornee di cultura organo mancano un funzionale sistema vascolare limbal, lacrime e umore acquoso, ogni investigatore deve valutare se si tratta di un modello utile per i loro studi. Residente attivazione delle cellule immuni è stata dimostrata, ma l'esatto parallelo studi in vivo non è ancora chiaro1.
Un passo fondamentale nel protocollo non deve penetrare la cornea ferendo troppo profondamente. Questo sarà evidente come il fluido di alloggiamento anteriore sarà una perdita in questo caso. In questo caso, il mondo deve essere eliminato. Per produrre una ferita anche meccanica, afferrare il labbro del tessuto delimitato all'interno dell'area trephined con una pinza e quindi spostare la lama chirurgica parallela alla superficie cornea per tagliare il tessuto all'interno dei confini del trephine ferita. La superficie corneale non deve asciugarsi, così possiamo raccomandare che dopo aver effettuato la ferita e tagliando fuori la cornea dal globo, posizionare il cornea capovolto in PBS, fino a quando la miscela di agar è alla giusta temperatura. Assicurandosi che l'agar non è troppo caldo per evitare danno endoteliale.
Una limitazione di questo modello è che l'uso di un trapano per produrre una ferita è irregolare e non può essere riprodotti in modo identico da cornea alla cornea rispetto alle ferite indotte da laser36. Tuttavia, naturalmente le ferite che si verificano non sono tutti equivalenti in profondità e un grande corpo dei dati suggeriscono che qualsiasi violazione nella membrana dello scantinato genera sviluppo myofibroblast e haze nello stroma, mentre la rigenerazione della membrana dello scantinato conduce alla diminuito di sfregio37,38,39. Questo modello di cultura di maiale organo corneale impiega una ferita grave, in cui la membrana basale viene rimosso all'interno dell'area della trapanazione. Sviluppo di miofibroblasti e fibrotici marcatori nello stroma corneale sono stati costantemente e riproducibilità realizzata con questo sistema di modello. Alcuni macchiatura epiteliale è solitamente evidente che scurisce nell'epitelio ferito e ricresciuto. Questo è stato dimostrato in altri rapporti di cultura organo corneale40 ma è assente nella maggior parte delle cornee di topo in vivo e studi41,42del coniglio. Tuttavia, uno studio condotto in un modello canino in vivo hanno dimostrato forte epiteliale α-SMA macchiatura nell'epitelio dopo ferimento43. Gli siRNA che ha promosso la guarigione rigenerativa nei nostri studi anche significativamente ridotto questo immunostaining epiteliale, suggerente che l'epitelio può essere sottoposto a EMT (cicatrici fibrotiche) quando essa ricresce nella coltura di organo. Inoltre, un'omissione di un anticorpo primario nel protocollo di colorazione di una cornea ferito ha provocato la totale assenza di macchiatura7 suggerendo che immunostaining è specifico. Sezioni congelate (non mostrate) erano simili a sezioni di paraffina a questo proposito. Tuttavia, perché lo sfondo leggero ma variabile di colorazione nell'epitelio, il nostro laboratorio solo ha quantificato la macchiatura stromal, che sembra non avere nessun sfondo istologico problemi7.
Se ferendo cornee umane, ottenendo le cornee non utilizzate per il trapianto invece di globi completo può essere più redditizio40. In questo caso, la cornea sarà ferita senza l'aiuto della pressione accordata dal globo. Ulteriori strategie ferentesi possono includere ustioni corneale, che sono state ampiamente utilizzate in vivo per produrre una cicatrice42.
In sintesi, i vantaggi di questo sistema per un dosaggio di cicatrizzazione del tessuto 3D è sua riproducibilità e risparmio con esigenze di equipaggiamento solo standard, che lo rende un'ottima risorsa per osservare e quantificare gli effetti degli agenti sulla guarigione dei tessuti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH-nia R01 EY024942, ricerca per prevenire la cecità, Upstate Medical University senza restrizione ricerca fondi, e distretto Lions 20-Y. microscopia e analisi delle immagini di sezioni della paraffina sono state eseguite presso il nucleo di microscopia e preparazione del vetrino istologico è stata eseguita la Biorepository e CORE di patologia presso la scuola di medicina di Icahn al Mount Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100x |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100x |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100x |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100x |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200x |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10 mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera |
References
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
- Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
- Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
- Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
- Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
- Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
- Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
- Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
- Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
- Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
- Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
- Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
- White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
- Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
- Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
- Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
- Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
- Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
- Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
- Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
- Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
- Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
- Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
- Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).
