Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Assay voor het bestuderen van de aggregatie van eiwitten Tau en Drug Screening

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58570
Automatic Translation
1, 1, 1
1Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

De tau aggregatie assay beschreven in dit manuscript bootst de verwachte kenmerken van in vivo misfolding tau en aggregatie.

Abstract

Aggregatie van eiwitten tau en vorming van gepaarde spiraalvormige filamenten is een kenmerk van de ziekte van Alzheimer en andere tauopathies. Vergeleken bij andere proteïnen die zijn gekoppeld aan neurodegeneratieve ziekten, de kinetiek van aggregatie gemeld in vitro voor tau-eiwit zijn minder consequent presenteert een relatief hoge variabiliteit. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een in vitro aggregatie bepaling die de verwachte stappen tau misfolding en aggregatie in vivois gekoppeld bootst. De bepaling maakt gebruik van de langste tau isovorm (huTau441) waarin zowel N-terminale zure inserts, alsmede vier microtubuli-bindende domeinen (MBD). De aggregatie van in vitro is geactiveerd door toevoeging van heparine en voortdurend gevolgd door thioflavin T fluorescentie in een 96 goed microplate-indeling. De tau aggregatie bepaling is zeer reproduceerbaar tussen verschillende wells, experimentele loopt en batches van het eiwit. De samenvoeging leidt tot tau PHF-achtige morfologie die zeer efficiënt is in het zaaien van de vorming van DOVO fibrillar structuren. Naast de toepassing in het bestuderen van het mechanisme van tau misfolding en aggregatie, is de huidige bepaling een krachtige tool voor het screenen van geneesmiddelen die met de pathogenese van tau interfereren kunnen.

Introduction

De ziekte van Alzheimer is een verwoestende neurodegeneratieve stoornis die histopathologically door de accumulatie van extracellulaire seniele plaques van geaggregeerde Amyloid-bèta1 is gedefinieerd en intracellulaire neurofibrillary klitten met geaggregeerde hyperphosphorylated tau-eiwit2. Fysiologische tau is monomeer en gepresenteerd als zes unieke isoforms met 0-2 N terminal inzetstukken en 3 of 4 microtubuli-bindende domeinen3,4 die voortvloeien uit alternatieve splicing en een gemiddelde van 2-3 phosphorylations. Men gelooft dat hyperphosphorylation, misfolding en zelf aggregatie in fibrillary structuren de sleutelelementen van tau pathogenese, als pathologisch beoordeeld in demente personen5,6 vormen.

De geaggregeerde neurofibrillary tau klitten zijn een kenmerk niet alleen voor AD, maar ook voor andere tauopathies, met inbegrip van Frontotemporale lobar degeneratie (FTLD), Pick's ziekte, Progressieve supranucleaire verlamming (PSP), fronto-temporele dementie (FTD) en primaire leeftijdsgebonden tauopathy (deel)2. Vanuit een biochemisch oogpunt, inzicht in het mechanisme van tau misfolding en aggregatie kan licht werpen op de pathologische processen gekoppeld aan AD en andere tauopathies. Naast het wetenschappelijke aspect zijn robuuste in vitro aggregatie testen waardevolle hulpmiddelen voor screening van drug kandidaten7,8,9,10. Het is van mening dat de samenvoeging van tau een nucleatie afhankelijke polymerisatie proces (NDP)11,12,13,14 volgt. De NDP-kinetiek is sigmoïdale en begint met een energiek ongunstige nucleatie stap gevolgd door een snel energiek downhill aggregatie-proces.

In tegenstelling tot andere amyloidogenic eiwitten, met inbegrip van het prion-eiwit en bèta amyloid α-synuclein, tau doet niet spontaan statistische onder fysiologische omstandigheden en zelfs extreme pHs of hoge temperaturen niet-bevorderlijk voor aggregatie15zijn. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de hydrophylic interacties in de tau aggregatie interface aanwezig. Echter, tau aggregaten efficiënt bij fysiologische concentraties wanneer inductoren zoals heparine16 of andere polyanions17,18 worden gebruikt.

Eerdere pogingen om in te stellen in vitro tau aggregatie testen hebben werpen enig licht op de details van tau misfolding en aggregatie, maar ze kwamen kort voor het nabootsen van wat wordt verondersteld te zijn van de in-vivo -kinetiek van het tau-aggregatie. In de meeste gevallen ontbrak de tau aggregatie kinetiek de fase van de eerste vertraging tau nucleatie is gekoppeld. Dit zou kunnen zijn het gevolg van het gebruik van zeer hoge tau-eiwit concentraties, aanwezigheid van aggregaten in de startende tau-eiwit preparaten en/of gebruik van tau fragmenten met veel hogere aggregatie neiging dan het meer fysiologische volledige lengte tau eiwit19,20,21,22,23. Bovendien, eerdere studies niet ingegaan op de reproduceerbaarheid en robuustheid aspect van tau aggregatie kinetiek.

Hier beschrijven we een robuuste in vitro tau aggregatie assay die bootst de belangrijkste kenmerken van een afhankelijke polymerisatie van nucleatie met een fase van de eerste vertraging overeenkomt met de tau nucleatie gevolgd door de fase van een exponentiële groei. Bovendien, de gegenereerde recombinante tau aggregaten zijn fibrillar in de natuur en hebben een extreem hoge seeding potentie. De bepaling is zeer reproduceerbaar ook tussen tau batches en vertegenwoordigt een waardevol instrument te screenen op aggregatie remmers.

Protocol

1. reagens voorbereiding

  1. Reactie buffer
    1. Reactie buffer bereiden: 0,5 mM TCEP in PBS, pH 6.7 door het oplossen van TCEP droge poeder (MW = 286.65 g/mol) in PBSstock oplossing, pH 7.4.
      Opmerking: De aanwezigheid van TCEP is te wijten aan het overbruggen van aggregatie studies met wild type tau-eiwit dat cysteines bevat. In het huidige protocol, TCEP wordt alleen gebruikt om de pH van PBS van 7,4 tot 6,7 en speelt geen rol bij het reguleren van eventuele redoxreacties.
    2. Meng en filtreer de oplossing door een membraanfilter van steriele 0,22 μm porie grootte PES.
    3. Aliquot en winkel op-80 ˚C.
    4. Ontdooi op de Bank en stabiliseren op RT vóór gebruik.
  2. huTau441
    1. HuTau441 (voor eiwit expressie en zuivering Zie Apetri et al. verwijderen 24) uit-80 ˚C diepvriezer.
    2. Ontdooien op de Bank en equilibreer tot kamertemperatuur (RT).
    3. Spin buis met eiwit voorraad voor 5 min bij 12.000 x g bij 20-25 ˚C te elimineren luchtbellen.
    4. Meten van de concentratie van huTau441by absorptie bij 280 nm met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven van 0.31 mL mg-1cm-1
  3. Thioflavin T
    1. Bereiden van 500 micrometer thioflavin T (ThT) stockoplossing door ontbinding van 10 mg ThT droge poeder (MW = 318.86 g/mol) in 35 mL reactie buffer.
    2. Meng grondig, vortex 3 keer voor 20 seconden bij maximale snelheid en filtreer de oplossing door een steriele membraanfilter van 0,22 μm porie grootte PES.
    3. Bepalen van concentratie door absorptie metingen op 411 nm met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven van 22.000 M-1 cm-1 en 500 μM ThT concentratie aan te passen. Bewaren bij RT beschermd tegen licht. Bereiden verse elke 2 maanden.
  4. Heparine
    1. Bereid verse 55 μM heparine oplossing door ontbinding van 1 mg van HMW heparine droge poeder (MW = 17-19 kDa) in 1 mL reactie buffer op RT.
    2. Goed schudden en vortex 2 keer voor 5 seconden.
    3. Filtreer de oplossing door een steriele 0,20 μm porie grootte PES membraanfilter (spuit).

2. continu-modus ThT aggregatie Assay op een multi-mode Microplate lezer

Opmerking: ThT kleurstof wordt toegevoegd aan de reactie op het controleren van huTau441 aggregatie kinetiek in een continu-modus (automatische metingen). Hoewel de reactie kan worden gevolgd door een regelmatige Fluorimeter met behulp van een conventionele cuvette, de handmatige aard van elke actie beperkt de frequentie van de metingen en de nauwkeurigheid van de opgenomen kinetische curven in het gedrang brengt. Om deze reden wordt een automatische multi-mode microplate-lezer gebruikt.

  1. Instrument instellen
    1. Zet de computer en de multi-mode microplate-lezer. Laat de apparatuur stabiliseren gedurende 10 minuten.
    2. Start de software en een protocol voor te bereiden.
      1. Selecteer het protocoltype: standaard protocol (Data reductie zelfstandig wordt uitgevoerd voor elke plaat).
      2. De temperatuur vastgesteldop 37 ˚C en selecteer preheatment voordat u doorgaat het protocol.
      3. Instellen van de kinetische run: runtime 50 h / meting interval: 15 min.
      4. Orbitale schudden bij 425 cpm (3 mm) in continu-modus instellen
      5. Selecteer de Lees methode: fluorescentie intensiteit eindpunt/kinetische - Monochromators golflengten: excitatie 440 nm (20 nm bandbreedte) / emissie 485 nm (20 nm bandbreedte) - optica positie: Top - hoogte normale leessnelheid - lees: 4.50 mm
      6. Start de run met behulp van het protocol van gemaakt. Naam van het experiment, selecteert u de bestemming van het zojuist gemaakte bestand en toestaan van het instrument aan vooraf equilibreer tot gewenste temperatuur.
  2. Spontane huTau441 conversie
    1. Het monster van de reactie in een tube van 1,5 mL voor te bereiden. Gebruik 200 μl mix per reactie en ten minste 4 replicaten (reactie volume voor 4 repliceert = 800 μL).
    2. Bereiden van 800 μL reactie monster (in geval van 4 wordt gerepliceerd) met 15 μM huTau441, 8 μM heparine en 50 μM ThT. Start door het mengen van het eiwit met de reactie buffer, voeg heparine en ThT en meng goed door pipetteren op en neer 5 keer. Respecteer de aangegeven volgorde voor reagens toevoeging.
    3. Spin monsters op 12.000 x g en 25 ˚C gedurende 5 minuten om te elimineren luchtbellen.
    4. Afzien van 200 μL van reactie monster per putje in 96-Wells microplates (96-Wells-zwarte solide microplate, goed-volume 360 μL, platte bodem). Vorming van luchtbellen vermijden.
    5. Zegel microplate om verdamping.
    6. Plaats van microplate in multi-mode microplate-lezer en beginnen metingen.
    7. Na afloop van het experiment werd plaat verwijderen van apparatuur en gegevens exporteren naar een data processing software.
  3. De kwaliteitscontrole van de conversie, zaad inzameling en opslag.
    1. De sealer verwijderen uit de plaat en het bundelen van de verschillende replicaat-organismen in 1,5 mL tubes. Meng goed het samengestelde monster in de putten 2 keer voordat het verzamelen op en neer waarbij eveneens. Aggregaten hebben de neiging te storten op de bodem van de put.
    2. Mix grondig in de 1,5 mL tube door pipetteren op en neer 5 keer en afzien van 10-20 μL op een mica oppervlak voor het analyseren van de aggregaten door AFM (voor meer details zie Apetri et al. 24).
    3. De aggregaten van de oogst door het draaien van de tube 1,5 mL op 20.000 x g en 4 ˚C gedurende 1 uur. Aggregaten vormen een pellet.
    4. Scheiden en analyseren van de bovendrijvende vloeistof door S-MALS te bevestigen van het ontbreken van monomeer tau in de steekproef die aangeeft van een succesvolle omzetting in aggregaten (voor verdere details zie Apetri et al. 24).
    5. Label de 1,5 mL-buis met de resterende aggregaten (pellet) die eerste huTau441 eiwitconcentratie en monstervolume aangeeft. Module bevriezen de aggregaten en bewaren bij-80 ˚C.
  4. Geplaatste reactie
    1. HuTau441 aggregaten uit-80 ˚C vriezer verwijderen. De omvang van de buffer van de reactie aangegeven op het etiket (eerste monstervolume) en laat de buis stabiliseren aan RT. resuspendeer de aggregaten door pipetteren op en neer 5 tot 8 keer toevoegen.
    2. Bewerk ultrasone trillingen ten het geaggregeerde monster. Voor een 200 μl steekproef (15 μM huTau441), bewerk ultrasone trillingen ten op ijs met behulp van een 1/8"-microtip (vanaf 100 μl tot 10 mL) voor een totale duur van 15 s met behulp van pulsen van 1 s en pauzes van 2 s bij 30% amplitude (ultrasoonapparaat 250 watt). Opnieuw equilibreer monster, tot op RT.
      Opmerking: De werknemer ultrasoonapparaat voorwaarden leiden tot een homogene populatie van tau fibrillen met een lengte van 20-50 nm24.
    3. Voorbereiding van het monster van de reactie in 1,5 mL tubes. Gebruik 200 μl mix per reactie en ten minste 4 replicaten (reactie volume voor 4 repliceert = 800 μL).
    4. Bereiden van 800 μL reactie monster met 15 μM huTau441, 8 μM heparine en 50 μM ThT. Start door het mengen van het eiwit met de reactie buffer, voeg heparine en ThT en meng goed door pipetteren op en neer 5 keer. Respecteer de aangegeven volgorde voor reagens toevoeging.
    5. Spin monsters op 12.000 x g en 25 ˚C gedurende 5 minuten om te elimineren luchtbellen.
    6. Afzien van 200 μL van reactie monster per putje in 96-Wells (96-Wells-zwarte solide microplate, goed-volume 360 μL, platte bodem). Vorming van luchtbellen vermijden.
    7. Meng grondig de voorgevormde fibril monster door repetitieve omhoog en omlaag pipetteren (5 keer) en toevoegen aan elk goed het bedrag dat overeenkomt met het gewenste percentage van de zaden. 2 μL van voorgevormde zaad toevoeging is voor een 200 μl goed totaal volume, een 1% (v/v). Mix door omhoog en omlaag pipetteren 3 keer bij het toevoegen van naar de waterput en vorming van luchtbellen vermijden.
    8. Zegel microplate om verdamping.
    9. Plaats van microplate in multi-mode microplate-lezer en beginnen metingen.
    10. Plaat verwijderen van apparatuur en gegevens exporteren naar een werkblad.

Representative Results

Recombinant huTau44124met de C291A en C322A mutaties en N-terminal zijn en C-terminal C-tags was uitgedrukt en gezuiverd zoals eerder beschreven. De huTau441 partijen zijn zeer zuiver als gevisualiseerde op SDS-pagina en vrijwel 100% monomeer zoals beoordeeld door S-MALS (Figuur 1). De aggregatie van 15 µM huTau441 werd geïnduceerd door de toevoeging van 8 µM HMW heparine en de reactie was voortdurend gevolgd door ThT fluorescentie met behulp van een multimode microplate-lezer. De excitatie-golflengte was 440 nm (bandbreedte 20 nm) Overwegende dat de emissie is gemeten op 485 nm (bandbreedte 20 nm). De bepaling is zeer reproduceerbaar is, met de resultaten van 10 individuele putten wordt vrijwel niet te onderscheiden (figuur 2A). De morphologies van de aggregaten ThT positieve huTau441 werden beoordeeld na 50 h AFM. Geaggregeerde hutau441 is een homogeen mengsel van fibrillar structuren van verschillende lengte vergelijkbaar met gerapporteerde ex vivo morphologies (figuur 2B). Het uiteindelijke reactiemengsel bevat bovendien geen monomeer, suggereren een volledige omzetting in aggregaten, zoals blijkt uit metingen van de S-MALS (figuur 2C). De kinetiek van huTau441 aggregatie in onafhankelijke experimentele loopt zijn zeer vergelijkbaar, zoals benadrukt door soortgelijke sigmoïdale bochten en niet te onderscheiden lag en groei fasen (Figuur 3). Het hoge niveau van reproduceerbaarheid blijft behouden wanneer verschillende batches van eiwitten worden gebruikt (Figuur 4). Voorgevormde huTau441 aggregaten zijn bovendien zeer efficiënt in het werven van tau monomeer en vorming van DOVO tau aggregaten inducerende. Bedragen zo laag als 0.0025% (v/v) van voorgevormde tau aggregaten zijn in staat om nucleatie en trigger generatie van DOVO fibrillen (Figuur 5) te omzeilen.

Figure 1
Figuur 1: recombinante huTau441 is monomeer en zeer zuiver. A) zuiverheid beoordeling onder de denaturering van voorwaarden op een 4-12% SDS-pagina gel met inbegrip van moleculair gewicht standaard eiwit ladder (in kDA) (baan 1); doorstromen van de laatste stap van de C-tag affiniteit zuivering (baan 2); kolom wassen breuk (baan 3), geëlueerd huTau441 eiwit piek, vóór (Lane 4) en na buffer wisselen (Lane 5), respectievelijk). B) S-MALS analyse van de huTau441. Eiwit toont > 99,9% monomeer met een molaire massa van 51 kDa en bevat geen aggregaten of fragmenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: samenvoeging van recombinante huTau441 is zeer reproduceerbaar en kwantitatief leidt tot fibrillar structuren. A) kinetiek van heparine geïnduceerde huTau441 aggregatie doorlopend gecontroleerd in 96 goed microplate-indeling door ThT fluorescentie. Concentraties van huTau441 en heparine zijn 15 µM en 8 µM, respectievelijk. De 10 individuele bochten overeenkomen met de omzetting van de dezelfde partij van het eiwit in tien putjes van de dezelfde microplate en worden gekenmerkt door een gemiddelde (met SD) lag fase van 14,2 ± 0.38 h en t50 van 18,8 ± 0,40 h. kinetische gegevens was uitgerust met een 5-parameter logisti c curve met een lineaire daling in de bovenste asymptote. Lag fase en t50 werden berekend door interpolatie tussen voorspelde waarden door middel van lineaire regressie. Lag fase is berekend op basis van de toename van 3% van ThT fluorescentie signaal. Curve passend en samenvattende statistieken worden verkregen met behulp van IBM SPSS statistics versie 20.0.0.2. B). Tau aggregaten Toon PHF-achtige morphologies zoals aangegeven door de AFM beeldvorming op 50 h; C). S-MALS analyse van monomeer huTau441 (t = 0 h) en het supernatant van het reactiemengsel bij de voltooiing van de reactie (t = 50 h). Op het tijdstip van 50 h was het reactiemengsel gecentrifugeerd gedurende 1 uur bij 20.000 X g en 4 ˚C en het resulteerde supernatant geïnjecteerd op S-MALS. De verdwijning van de piek monomeer bevestigt de volledige samenvoeging van tau. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: de tau aggregatie assay toont hoge reproduceerbaarheid tussen onafhankelijke experimentele runs. De twee panelen weer vier afzonderlijke kinetiek sporen voor spontane huTau441 aggregatie verzameld in twee onafhankelijke experimenten met de dezelfde batch van huTau441 eiwit. Concentraties van huTau441 en heparine zijn 15 µM en 8 µM, respectievelijk. Kinetiek worden gekenmerkt door een gemiddelde (met SD) lag fase van 12.2 ± 0.18 h en t50 van 17.8 ± 0.8 h (Run 1) en 11,6 ± 0,52 h en t50 van 17.8 ± 0,23 h (Run 2), respectievelijk. Kinetische gegevens was uitgerust met een 5-parameter logistieke kromme met een lineaire daling in de bovenste asymptote. T50 werden berekend door interpolatie tussen voorspelde waarden door middel van lineaire regressie. Lag fase is berekend op basis van de toename van 3% van ThT fluorescentie signaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: de tau aggregatie assay toont hoge reproduceerbaarheid tussen verschillende batches instellen van huTau441 eiwit. Elk paneel toont dat vier repliceert overeenkomt met een specifieke huTau441-partij. De aggregatie van iedere partij werd gevolgd in onafhankelijke experimenten. Concentraties van huTau441 en heparine zijn 15 µM en 8 µM, respectievelijk. Aggregatie kinetiek overeenkomt met de vier afzonderlijke tau batches worden gekenmerkt door een gemiddelde (met SD) lag fase van 15,3 ± 0.38 h en t50 van 21.1 ± 0,46 h (Batch 1); vertragingstijd fase van 12,5 ± 0,07 h en t50 van 19,8 ± 0,34 h (Batch 2); vertragingstijd fase van 15,1 ± 0,34 h en t50 van 21,9 ± 0,86 h (Batch 3) en hinken fase van 11,5 ± 0.29 h en t50 van 17.8 ± 0.29 h (Batch 4), respectievelijk. Kinetische gegevens was uitgerust met een 5-parameter logistieke kromme met een lineaire daling in de bovenste asymptote. Lag fase en t50 werden berekend door interpolatie tussen voorspelde waarden door middel van lineaire regressie. Lag fase is berekend op basis van de toename van 3% van ThT fluorescentie signaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: voorgevormde hutau441 aggregaten hebben hoog zaaien activiteit. Om te beginnen met zaaien, zijn sonicated tau aggregaten toegevoegd aan de monomeer hutau441. Van rood naar blauw, elke kleur van de verschillende kinetische curven vertegenwoordigt de verschillende hoeveelheid toegevoegde zaden: 1,25%, 0,63%, 0,31 procent, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0.005% en 0.0025% (v/v), respectievelijk. Spontane conversie van hutau441 is vertegenwoordigd in het zwart. Alle voorwaarden werden getest in viervoud. De vier kinetische wordt gerepliceerd die zijn gekoppeld aan een bepaalde concentratie van zaden zijn zeer reproduceerbaar zijn en in de meeste gevallen niet te onderscheiden. Concentraties van hutau441 en heparine zijn 15 µM en 8 µM, respectievelijk. De toevoeging van kleine hoeveelheden van pre-gevormde sonicated fibrillar structuren elimineert de fase van de eerste vertraging waargenomen in de spontane conversie en het effect is evenredig met de hoeveelheid zaden. Van rood naar blauw, is het verschil in t50 waargenomen (t50 spont.conv-t50 zaaien) 18,9, 18.40 17.8, 17.3, 16.6, 16.1, 15,4, 14,7, 14.2 en 13.7 uur, respectievelijk. Spontane conversie van hutau441 wordt gekenmerkt door een gemiddelde t-50 (met SD) van 19.85 ± 0,54 h. kinetische gegevens was uitgerust met een 5-parameter logistieke kromme met een lineaire daling in de bovenste asymptote. t50 werden berekend door interpolatie tussen voorspelde waarden door middel van lineaire regressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Ondanks talrijke pogingen, de tau aggregatie kinetiek gemeld in de literatuur naar datum ontbreken het gewenste niveau van reproduceerbaarheid en/of sommige van de kenmerken van een nucleatie afhankelijke polymerisatie19,20,21 , 22 , 23 , 25. dit wordt vaak benadrukt door het ontbreken van een lag fase, de inefficiënte zaaien en de niet-fibrillar aard van tau aggregaten. De reden voor deze tekortkomingen kan variëren en omvat suboptimale tau-eiwit kwaliteit (versnippering, aanwezigheid van aggregaten, lage zuiverheid, enz.), keuze van eiwitten en inducerende reagentia en/of experimentele omstandigheden. Een andere complicerende factor zijn de twee cysteïne residuen gelegen rond de tau aggregatie interface die kunnen vormen intra - of inter - moleculaire disulfide bruggen afhankelijk van de redox milieu en de invloed op de efficiëntie van tau aggregatie. In de meeste benaderingen vermindering van reagentia zoals DTT of TCEP zijn gebruikt om de cysteïne-residuen in verminderde vormen en dus verhoging van de niveaus van reproduceerbaarheid25. Bovendien, de coëfficiënt uitsterven van tau is zeer laag die leidt tot problemen in nauwkeurige metingen van de eiwitconcentratie.

We gericht vooral op een paar parameters en kenmerken van de kwaliteit die we beschouwd als cruciaal voor een representatieve, robuuste en reproduceerbare aggregatie-profiel voor tau-eiwit: opheffing van de mogelijkheid van intra - en inter-moleculaire bisulfide vorming, het genereren van een monomeer zeer zuivere tau en verbeteren van de nauwkeurigheid van de bepaling van de concentratie. Alle deze reagens gerelateerde vragen zijn potentiële aandachtspunten die wij als cruciaal voor een optimale assay ontwikkeling beschouwd. Om deze kwesties te behandelen, werd de volledige lengte huTau441 uitgedrukt met twee mutaties, C291A en C322A, en met N - en C-terminaal tags. Mutatie van de residuen van cysteïne heeft minimale impact op het eiwit tau terwijl het elimineren van de anders heel moeilijk te controleren bisulfide overbruggen. Uiting van het eiwit met relatief korte N - en C-terminaal tags toegestaan ons voort te zetten van een tweestaps affiniteit zuivering protocol, wat tot zeer hoge zuiverheid, integriteit en monomeer inhoud leidde. Bovendien, introduceerden we een F8W mutatie die steeg de coëfficiënt uitsterven van het eiwit en veel nauwkeuriger concentratie metingen24toegestaan.

Naast het gebruik van hoogwaardige eiwitten reagentia, werden ook andere parameters assay geoptimaliseerd. De optimale tau: heparine verhouding te rond 0,5 (M/M), die in overeenstemming met eerder gepubliceerde studies26 iswerd geïdentificeerd. Bovendien, mechanische en optische instrumentele instellingen zijn cruciaal om de reproduceerbaarheid en de optimale parameters kunnen verschillen tot op zekere hoogte afhankelijk van de fabrikant.

De aggregatie van tau beschreven in deze test toont kenmerken die zijn gekoppeld aan tau pathogenese in AD en gerelateerde tauopathies. Het proces begint met een fase van de eerste vertraging overeenkomt met de vorming van energierijke kernen en wordt gevolgd door een fase van snelle groei die overeenkomt met fibril groei. De vertragingstijd is lang genoeg om een breed venster om te studeren in detail de seeding proces die een breed scala van zaad concentraties (Figuur 5) terwijl nog steeds niet te lang dus afbraak van eiwitten en/of aspecifieke aggregatie worden vermeden (figuur te openen 2). deze secundaire gebeurtenissen kunnen met name gebeuren wanneer een intrinsiek ongeordende eiwitten zoals huTau441 wordt blootgesteld voor langere tijd aan fysiologische omstandigheden. Het verkregen tau aggregaten display de morfologie van PHFs geïsoleerd van hersenen van AD patiënten en zijn zeer efficiënt in het monomeer tau te werven en te converteren naar DOVO gegenereerd aggregaten, een proces genoemd zaaien. De bepaling is zeer reproduceerbaar is, met de kinetische bochten wordt vrijwel niet te onderscheiden tussen putten, experimentele loopt en eiwit batches. Hoewel de huidige bepaling richt zich alleen op de langste tau isovorm, huTau441, de toepassing kan worden aangepast aan het bestuderen van de conversie van andere vormen van tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica communicatie, pers), het maakt bovendien mechanistisch onderzoek gericht op het samenspel van tau isoforms en eventueel licht werpen op de verschillen tussen tau pathogenese in AD waar zowel 3R en 4R isoforms aanwezig zijn in PHFs en PICK's ziekte of Frontotemporale dementie waar tau pathologie bevat voornamelijk 3R en 4R tau isoforms, respectievelijk27.

De zeer hoge reproduceerbaarheid van de test mag lezers uit te voeren met relatief gemak in hun specifieke lab-instellingen. De assay bootst wat wordt verondersteld te zijn de in vivo misfolding en aggregatie van tau, inschakelen van mechanistische studies die licht op de pathogenese van tau en het werpen zal vormt een waardevol instrument voor het screenen van drugkandidaten en evalueren van hun inmenging met de verschillende stappen van het proces van de pathogenese.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank Hector Quirante voor de expressie en de zuivering van huTau441, Hanna Inganäs en Margot van Winsen voor uitstekende technische ondersteuning en Martin Koldijk voor data-analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), USA. E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies. Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 141 Tau aggregatie zaaien amyloid drug screening Alzheimer tauopathies eiwit misfolding
<em>In Vitro</em> Assay voor het bestuderen van de aggregatie van eiwitten Tau en Drug Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri,… More

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter