Summary
هنا يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية كمياً تقييم امتصاص تاو طريق microglia بهدف إنشاء أداة الفحص لوصف أفضل آليات العمل تاو المضادة الأجسام المضادة.
Abstract
مرض الزهايمر (ميلادي) هو شرط الأعصاب تدريجي التي جمعت تاو وبروتينات اميلويد تتراكم في الدماغ مما تسبب في خلل الخلايا العصبية الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى التدهور المعرفي. ويعتقد هايبرفوسفوريلاتيد تاو المجاميع في الخلايا العصبية تسبب معظم الأمراض المرتبطة بالإعلان. ويفترض أن يفرج عنها في حجرة خارج الخلية هذه المجاميع وتناول الخلايا العصبية السليمة المجاورة حيث أنهم الحث على مواصلة تجميع تاو. يمكن أن توقف هذا "بريون--مثل" نشر من الأجسام المضادة القادرة على "تحييد" المجاميع تاو خارج الخلية كما هو موضح في نماذج الماوس الإكلينيكية للإعلان وملزم. إحدى الآليات المقترحة التي تقلل الأجسام المضادة العلاجية علم الأمراض هو جسم بوساطة امتصاص وإزالة أشكال مجمعة المرضية تاو من microglia. هنا، يمكننا وصف مقايسة يستند إلى الخلية كمية لتقييم امتصاص تاو microglia. هذا التحليل يستخدم خط الخلية microglial الماوس بي-2، يسمح لخصوصية عالية وتقلب منخفض ومتوسط الإنتاجية. البيانات التي تم إنشاؤها مع هذا التحليل يمكن أن تساهم في وصف أفضل لوظائف المستجيب تاو المضادة الأجسام المضادة.
Introduction
مرض الزهايمر (ميلادي) شرط الأعصاب تدريجي تتسم بالتغير كونفورماشونال والتجميع الذاتي لبروتين بيتا اميلويد الببتيد وتأو في المجاميع المرضية. الببتيد بيتا اميلويد الذوبان المعتاد يتم تحويلها إلى بيتا اميلويد oligomeric وفيبريلار، بينما تتراكم تاو فوسفوريلاتيد طبيعي ليغومرات والتشابك نيوروفيبريلاري1،2. هذه المجاميع البروتين يسبب موت الخلايا العصبية مما يؤدي إلى فقدان الذاكرة والتدهور المعرفي التدريجي لاحقاً. قد يؤدي إلى تفاقم عوامل أخرى، بما في ذلك neuroinflammation غير الإنتاجية، وانخفاض قدرة على مسح تجمعات من البروتينات، والتعجيل بالمرض. حاليا، توفر استراتيجيات التدخل ضد الإعلان تخفيف الأعراض إلى حد كبير، ولكن هناك لا علاج أو الوقاية من المرض--تعديل.
أدلة متزايدة تشير إلى دور رئيسي هايبرفوسفوريلاتيد تاو المجاميع في علم الأمراض الإعلانية. في حالة غير مرضية، هو تاو بروتين تكشفت أصلاً بربط microtubules ويعزز بها الجمعية إلى سيتوسكيليتون الخلايا العصبية. عندما يصبح تاو هايبرفوسفوريلاتيد، يفصل من سيتوسكيليتون ومجموعات في المجاميع تاو في الخلايا العصبية، التي يعتقد أنها تسبب معظم الأمراض المرتبطة بإعلان3. تجميعه تاو يبدأ تراكم أولاً إينتراسيلولارلي، ولكن مع تقدم المرض، فمن المفترض أن يفرج عن الخلايا العصبية المتضررة في الفضاء خارج الخلية، التي يمكن أن يؤخذ بمجاورة أو متصلة سينابتيكالي صحية من الخلايا العصبية في " بريون الشبيهة بطريقة ". بمجرد استيعابه، يدفع مجموع تاو مزيد تاو التجميع عن طريق تغيير conformational templated4.
ووفقا لهذه الفرضية، العلاجات القادرة على مقاطعة تاو البذر قد تبطئ أو عكس مسار المرض تاو بوساطة الأعصاب. ودعما لهذه تظهر الفئران أدلى الطفرات الوراثية عرضه تاوباثي وحقن سلبية مع الأجسام المضادة تاو تاو انخفاض الأمراض وتحسين الوظائف المعرفية5،،من67،8 ،9. غير أن الآليات التي تقلل الأجسام المضادة العلاجية علم الأمراض لا تزال بعيدة المنال.
واحدة من الآليات المقترحة هو جسم بوساطة امتصاص وإزالة أشكال مجمعة المرضية تاو من microglia، الخلايا المناعية المقيم في الدماغ. المنشورات الأخيرة توحي بأن microglia كفاءة يمكن أن تستوعب والحط من الأنواع المرضية تاو وهو تعزيز قدرة هذا تاو المضادة الأجسام المضادة عن طريق Fc تعتمد على الآلية التي تشمل مستقبلات Fc أعرب على سطح microglia ومستقبلات وساطة البلعمه10،11. وتحدد هذه البيانات microglia المستجيبة التي قد تكون هامة للأجسام المضادة العلاجية.
يصف لنا هنا مقايسة يستند إلى الخلية لتقييم كمي امتصاص تاو microglia. البيانات التي تم إنشاؤها مع هذا التحليل يمكن أن يساعد على توضيح آليات العمل تاو المضادة الأجسام المضادة وبالتالي يمثل أداة مفيدة للتقدم تاو المضادة الأجسام المضادة إلى مزيد من الخطوات لتنميتها كعلاج ميلادي محتمل.
Protocol
1-بي-2 خلايا الثقافة
ملاحظة: التعامل مع بي-2 الخلايا تحت الاحتواء 2 مستوى السلامة الأحيائية. ينتج خط الخلية بي-2 لفي (قادرة على إصابة الخلايا مورين فقط) اكوتروبيك المؤتلف المغلفة12؛ هذه الفيروسات معروفة بهم في المختبر تحويل القدرة و في فيفو الورمية المحتملة.
- تعديل الخلايا بي-2 الثقافة في الجلوكوز عالية دولبيكو النسر المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين ومم 2 لتر-الجلوتامين (المشار إليها كوسيلة تثقيف من الآن فصاعدا) تكملها بذر خلايا في 4 × 104 خلايا/مل.
- الحفاظ على الثقافات في جو هوميديفيد من 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: نمو الخلايا المرفقة فضفاضة وفي تعليق.
2-تسمية المجاميع تاو المؤتلف مع "صبغة الفلورسنت" حساسة لدرجة الحموضة
ملاحظة: تم إعداد المجاميع تاو كما هو موضح في أبيتري et al. 13 مع الفرق أن لا تي ثيوفلافين (تي إتش تي) أضيفت إلى رد فعل المخزن المؤقت. وجمعت عينات مجمعة في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل. تم فحص إشارة fluorescence النهائي عن طريق خلط ميليلتر 118 عينة تجمع مع 12 ميليلتر من حل تي إتش تي 50 ميكرومتر. تم فصل المجاميع من سينتريفوجينج الخليط رد فعل التجميع في 20,000 x ز ح 1 في 4 درجات مئوية. وقد تم تحليل المادة طافية قبل مالس ثانية للتأكد من أن جميع تاو أحادي تم تحويلها إلى المجاميع. كانت الكريات (تاو المجاميع) الأداة الإضافية المجمدة والمخزنة في ثلاجة في-80 درجة مئوية.
- ريسوسبيند تاو المجاميع في المخزن المؤقت بيكربونات الصوديوم 0.1 M (ناكو3) في الأس الهيدروجيني 8.5 بتركيز 1 ملغ/مل (~ 20 ميكرومتر).
ملاحظة: تركيز المجاميع تاو يستند على تركيز مونومرات الأولية حسب تقييم امتصاص مونومرات تاو في 280 نانومتر باستخدام معامل انقراض ملمج 0.31-1سم-1. - Sonicate مجاميع ريسوسبينديد باستخدام سونيكاتور تحقيق مع الحفاظ على الجليد لتجنب التدفئة الزائدة.
- استخدام سعة 65% (مع سونيكاتور قوة 250 واط).
- أداء البقول 8 3 s مع توقف 15 s بين النبضات لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.
- تعد حلاً أسهم 8.9 ملم من صبغة حساسة لدرجة الحموضة (من الآن فصاعدا إشارة إلى كصبغ pH) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: تعد حلاً جديداً دائماً واستخدامه فقط في اليوم أنها على استعداد. - إضافة 10 جزيئات من صبغ كل مول بروتين إلى تركيز صبغة نهائية من 0.2 مم.
- المزيج بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- احتضان الخليط رد فعل لمدة 45 – 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
- وفي الوقت نفسه، تجميع هلام ديكستران cross-linked الملحي العمود اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- حجته العمود مع 25 مل من 0.1 م ناكو3 المخزن المؤقت pH 8.5 تحتوي على 3% [دمس]. تجاهل في التدفق من خلال.
- إضافة منتج إجمالي تاو وسم كرد فعل للعمود في إجمالي حجم 2.5 مل. إذا كانت العينة أقل من 2.5 مل، إضافة المخزن المؤقت حتى يتم تحقيق إجمالي حجم 2.5 مل.
- واسمحوا العينة أدخل هلام معبأة تماما، وتجاهل التدفق من خلال.
- الوتي مع 3.5 مل من 0.1 م NaHCO3 المخزن المؤقت pH 8.5 تحتوي على 3% [دمس] وجمع النذرة في كسور أي ما يعادل 4 في أنابيب 2 مل.
- تحديد تركيزات البروتين الكسور 4 بمقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك.
- تخزين البروتين المسمى في ثلاجة-20 درجة مئوية.
3-امتصاص المقايسة مع القراءة Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)
-
1 – البذور الخلايا في اليوم
- أغسل بي-2 الخلايا في قارورة بإزالة استزراع المتوسطة وإضافة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
ملاحظة: الغسيل حجم تتنوع استناداً إلى حجم قارورة الخلية المستخدمة. على سبيل المثال، لقارورة T175، يغسل مع 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني. - إزالة برنامج تلفزيوني من قارورة وفصل الخلايا التي تفرخ مع حمض (يدتا) التربسين-الإيثيلين 0.05% على 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى فصل الخلايا من قارورة (حوالي 5 دقائق).
ملاحظة: حجم يدتا التربسين 0.05% يعتمد على حجم قارورة الخلية المستخدمة. على سبيل المثال، لقارورة T175، استخدام 2 مل من التربسين-يدتا 0.05%. - ريسوسبيند الخلايا في استزراع المتوسطة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً ثلاث إلى خمس مرات.
ملاحظة: يختلف حجم استزراع المتوسطة استناداً إلى حجم قارورة الخلية المستخدمة والعدد الإجمالي للخلايا في قارورة وهكذا. على سبيل المثال، لقارورة T175، استخدم 8 مل من استزراع المتوسطة. - حساب عدد الخلايا وإنشاء تعليق خلية بتركيز 1 × 105 خلايا/مل في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 200 ميكروغرام/مل الهيبارين نهائي.
- لوحة 250 ميليلتر من تعليق خلية (2.5 × 104 خلايا) كل بئر في لوحة مسطحة قاع زراعة الأنسجة 96-جيدا.
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- أغسل بي-2 الخلايا في قارورة بإزالة استزراع المتوسطة وإضافة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
-
يوم 1--إعداد إيمونوكومبليكسيس
- ذوبان الجليد الأس الهيدروجيني صبغ-تاو على الجليد.
- إعداد ميكروليتر 65 كل شرط لحل شمال البحر الأبيض المتوسط 500 من الأس الهيدروجيني المجاميع صبغ-تاو في المتوسط خالية من المصل (SFM) (ارتفاع الجلوكوز دميم وتستكمل مع 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 200 ميكروغرام/مل من الهيبارين).
- إعداد تخفيف جسم في 65 ميليلتر للإدارة المستدامة للغابات وفي تركيز مزدوجة واحدة نهائية. مزيج المجاميع تاو صبغ الأس الهيدروجيني والأجسام المضادة في صفيحة 96-جيدا u-السفلي. الحجم النهائي لحالة الآن 130 ميليلتر وتركيز المجاميع تاو صبغ الأس الهيدروجيني هو 250 نيوتن متر. إغلاق لوحة تمييع واحتضانها طوال الليل في 37 درجة مئوية.
-
2-امتصاص إيمونوكومبليكسيس في اليوم
- إزالة المتوسطة تثقيف من خلايا بي-2. يغسل خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة الغرفة ميليلتر 100 1 x برنامج تلفزيوني.
- نقل ميليلتر 125 من إيمونوكومبليكسيس إلى الخلايا باستخدام ماصة الأقنية. احتضان الخلايا مع إيمونوكومبليكسيس ح 2 في CO 37 درجة مئوية و 5%2.
- إزالة المتوسطة الحضانة من الخلايا وتجاهل ذلك. يغسل خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة الغرفة ميليلتر 100 1 x برنامج تلفزيوني.
- إزالة 1 x PBS وعلاج الخلايا مع 50 ميليلتر التربسين-يدتا 0.25% لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2-
- إضافة 200 ميليلتر لتثقيف المتوسطة وريسوسبيند جيدا من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى 96-جيدا U-قاع اللوحة. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- وضع اللوحة على الجليد، وإزالة استزراع خلايا متوسطة ويغسل مرتين من قبل ريسوسبيندينج الكريات الخلية في 150 ميليلتر الجليد الباردة 1 x PBS. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- وضع الخلايا على الجليد، وإزالة إضافة 1 × برنامج تلفزيوني ويغسل لهم قبل ريسوسبيندينج الخلايا الكريات في 150 ميليلتر الباردة نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة (1 x PBS، 0.5% البقري ألبومين المصل (BSA)، 2 مم يدتا). لوحة أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- وضع الخلايا على الجليد وإزالة المخزن المؤقت إضافة لنظام مراقبة الأصول الميدانية وريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر الباردة نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت.
- تحليل العينات مباشرة من نظام مراقبة الأصول الميدانية الحصول على 2 × 104 الأحداث في بوابة الخلايا الحية (راجع الخطوة 4، 1).
4-نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل
ملاحظة: تشير إلى الرقم 1 لاستراتيجية النابضة.
- استخدام منطقة المبعثر إلى الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) مقابل الجانب مبعثر منطقة الكثافة (SSC-أ) الأرض، بوابة على الخلايا الحية باستثناء الأحداث التي تنخفض فيها مستويات المبعثر إلى الأمام (أي، من الحطام والخلايا الميتة).
- ضمن السكان الخلية الحية، واستخدام منتدى التعاون الأمني-أ مقابل الارتفاع المبعثر إلى الأمام (منتدى التعاون الأمني-ح) لاستبعاد doublets الخلية والمجاميع. هذا هو بوابة القميص.
- استخدام الأحداث في بوابة القميص، إنشاء مدرج تكراري معلمة واحدة صبغ الأس الهيدروجيني.
- تحديد كثافة يعني الأسفار. تحديد النسبة المئوية للحموضة تاو صبغ الخلايا إيجابية باستثناء الخلايا السلبية كتحديد استخدام التحكم بي-2 فقط.
5-إيمونوكومبليكسيس امتصاص مع القراءة مجهرية
-
1 – البذور الخلايا في اليوم
- إعداد الخلايا بي-2 كما هو موضح في الخطوات 3.1.1 و 3.1.2 و 3.1.3.
- حساب عدد الخلايا وريسوسبيند لهم في استزراع المتوسطة إلى تركيز نهائي 104 خلايا/مل.
- لوحة 150 ميليلتر من تعليق خلية (1.5 × 103) كل بئر في بولي-د-يسين مغلفة باللوحة السوداء 96-جيدا مع واضحة مسطحة القاع.
- احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 48.
-
إعداد يوم 3 – إيمونوكومبليكسيس
ملاحظة: أجرى sonication معتدل المجاميع تاو المسمى قبل الحضانة مع الأجسام المضادة، لتحسين نتائج الفحص المجهري.- ذوبان الجليد الأس الهيدروجيني صبغ-تاو على الجليد و sonicate باستخدام سونيكاتور تحقيق مع الحفاظ على الجليد. استخدام سعة نسبة 15% (سونيكاتور قوة 250 واط). أداء البقول 30 2 s والانتظار 20 ثانية بين النبضات.
- إعداد ميكروليتر 65 كل شرط لحل شمال البحر الأبيض المتوسط 500 درجة الحموضة صبغ-تاو المجاميع في الإدارة المستدامة للغابات.
- تمييع الأجسام المضادة في 65 ميليلتر للإدارة المستدامة للغابات إلى تركيز مزدوجة واحدة نهائية. مزيج المجاميع تاو صبغ الأس الهيدروجيني والأجسام المضادة في صفيحة 96-جيدا u-السفلي. الحجم النهائي لحالة الآن 130 ميليلتر وتركيز المجاميع تاو صبغ الأس الهيدروجيني هو 250 نيوتن متر. إغلاق لوحة تمييع واحتضانها طوال الليل في 37 درجة مئوية.
- إزالة المتوسطة من لوحة الخلية واستبدالها مع 150 ميليلتر من تثقيف المتوسطة وتستكمل مع 200 ميكروغرام/مل الهيبارين. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
-
يوم 4-امتصاص إيمونوكومبليكسيس
- إزالة المتوسطة تثقيف من الخلايا بي-2. نقل ميليلتر 125 من إيمونوكومبليكسيس إلى الخلايا باستخدام ماصة الأقنية.
- احتضان الخلايا مع إيمونوكومبليكسيس ح 1 و 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
وصمة عار نواة الخلية بصبغة معينة الحمض النووي والعضيات الحمضية مع تحقيق الذي البقع مقصورات الهاتف الخلوي pH منخفضة بشكل انتقائي. احتضان الخلايا 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
ملاحظة: يؤدي إلى تمييع الأصباغ في الإدارة المستدامة للغابات. - أداء الخلية يعيش التصوير استخدام محتوى العالي من فحص النظام [كنفوكل]. تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية و 5% CO2. لصور ذات جودة عالية، تستخدم هدفا غمر مياه X 63 واكتساب 0.5 ميكرومتر طائرات (20 كل مكدس Z) كل حقل المصورة.
Representative Results
كان تساهمي المسمى tau المؤتلف مجمعة مع صبغة خضراء حساسة لدرجة الحموضة. هذه الصبغة يزيد بشكل كبير في الأسفار بناء على الاستيعاب في العضيات الحمضية، مما يسمح للقياس الكمي داخل الخلايا. كانت المحتضنة تاو المسمى المجاميع مع تاو المضادة الأجسام المضادة. على وجه الخصوص، قمنا باستخدام إصدار تشيميريك (منطقة IgG1 Fc الماوس) من 28.1 كبتاو. هذا جسم الإنسان بربط منطقة تاو إدراج الطرفي ن، وقادرة على ربط في المختبر ولدت تاو ييفات13. في هذا التحليل، نحن أيضا اختبار إصدار تحسين تقارب من كبتاو-28.1 – دمكبتاو-28.1. تنسيق القوات المسلحة البوروندية شظايا من كبتاو-28.1 في المسخ الأبوية والنسب العالية، وماوس IgG1 ايستب مراقبة كانت تستخدم كعناصر تحكم.
كانت المحتضنة مع إيمونوكومبليكسيس قبل تشكيل خلايا بي-2 أو مجمعة وحدها لمدة ساعتين حضور الهيبارين لمنع امتصاص جسم مستقل تاو تاو. بعد الحضانة، خلايا تم تريبسينيزيد لإزالة تاو منضمة إلى غشاء الخلية وحللت لامتصاص تاو بالتدفق الخلوي. كما وصفت لنا مؤخرا13، لاحظنا أن الإقبال على متغيرات الترويج كبتاو-28.1 تاو في خلايا بي-2 بطريقة تعتمد على الجرعة. وكان الاستيعاب Fc بوساطة منذ شظايا 28.1 كبتاو "القوات المسلحة البوروندية" لم يؤد إلى زيادة الإقبال على تاو القاعدية (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، توسط جسم دمكبتاو-28.1 عالية تقارب امتصاص تاو إلى خلايا بي-2 إلى حد أعلى من جسم البرية من نوع (الشكل 2).
الامتصاص بوساطة جسم تاو والتعريب من المجاميع تاو في حجرة اندوليسوسومال وأكد [كنفوكل] مجهرية (الشكل 3) حيث كان الملون حجرة الخلوية الحمضية باستخدام مجس انتقائي لانخفاض الرقم الهيدروجيني العضيات. بونكتا داخل الخلايا لصبغ الأس الهيدروجيني الأخضر المسمى tau المجاميع لوحظت داخل الخلايا التي كانت المحتضنة مع كبتاو-28.1. وعلاوة على ذلك، كثيرا ما كولوكاليزيد المجاميع تاو داخل الخلايا مع صبغ الأس الهيدروجيني المنخفض الأحمر انتقائية المقصورة مما يشير إلى وجود المجاميع تاو في العضيات الحمضية. شظايا كبتاو-28.1 "القوات المسلحة البوروندية" لم يرتفع الإقبال تاو مرة أخرى تشير إلى إليه استيعاب بوساطة مستقبلات Fc (الشكل 3).
رقم 1: النابضة الاستراتيجية المستخدمة في تحليل التدفق الخلوي لاكتشاف تاو استيعاب خلايا بي-2- نموذج بيانات من بي-2 التحكم فقط (أ-ج) والمراقبة ايستب (د-F) دمكبتاو-28.1 (ز--أنا) وترد. كانت بوابات الخلية بي-2 السكان على قطعة كثافة التعاون بين بلدان الجنوب، مقابل منتدى التعاون الأمني-باستثناء الحطام والخلايا الميتة (أ، د، ز). ثم كانت بوابات الخلايا بي-2 كذلك على مؤامرة كثافة منتدى التعاون الأمني-أ ص ح منتدى التعاون الأمني لاستبعاد doublets الخلية والمجاميع (ب، ه، ح). بوابة خلية مفردة تم استخدامه لإنشاء مدرج تكراري معلمة واحدة صبغ (فيتك في هذه النتائج التمثيلية) الأس الهيدروجيني (ج، و، أنا) وتحديد كثافة fluorescence هندسي. بدلاً من ذلك، تم حساب النسبة المئوية للأس الهيدروجيني تاو صبغ الخلايا إيجابية باستثناء الخلايا السلبية وفقا لما تحدده باستخدام عنصر تحكم فقط بي-2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: كبتاو-28.1 يتوسط الإقبال على المجاميع تاو إلى خلايا microglial بي-2- تساهمي تاو المؤتلف مجمعة المسمى مع صبغة حساسة لدرجة الحموضة الفلورية الخضراء والمحتضنة مع إصدار تشيميريك ماوس من جسم تاو المضادة البشرية كبتاو-28.1، في شكل تحسين تقارب، دمكبتاو-28.1، والقوات المسلحة البوروندية المقابلة شظايا، ماوس IgG1 ايستب مراقبة جسم أو لا جسم (تاو المجاميع وحدها). كانت المحتضنة إيمونوكومبليكسيس في وقت لاحق مع خلايا بي-2 لمدة ساعتين حضور الهيبارين لمنع امتصاص تاو جسم مستقل. الإقبال على إيمونوكومبليكسيس قيمت قبل التدفق الخلوي ومعبرا عنه بالوسط الهندسي (جنرال موتورز) كثافة الفلورية (A) أو النسبة المئوية للايجابية تاو (tau +) خلايا (ب). أشرطة الخطأ في (أ) تشير إلى الانحراف المعياري لتجربتين مستقلة، بينما يظهر (ب) تجربة واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: المجاميع تاو يتم استيعابه بخلايا بي-2 وتعريب في العضيات الخلوية الحمضية. كانت المحتضنة بريفورميد تاو-جسم إيمونوكومبليكسيس مع خلايا بي-2 لمدة ساعتين حضور الهيبارين لمنع امتصاص جسم مستقل. بعد الحضانة، كانت ملطخة نويات صبغة زرقاء محدد الحمض النووي وحجرة الخلوية الحمضية مع pH منخفضة حجرة انتقائية صبغ أحمر. وكشف التصوير خلية يعيش بونكتا داخل الخلايا من المجاميع تاو المسمى (الأخضر) داخل الخلايا التي كانت المحتضنة مع كبتاو-28.1 و 28.1 دمكبتاو، ولكن ليس مع عنصر التحكم ايستب. وعلاوة على ذلك، صبغ المجاميع تاو داخل الخلايا غالباً ما كولوكاليزيد باللون الأحمر (أصفر) مما يشير إلى وجود المجاميع تاو في حجرة الخلوية الحمضية. شظايا كبتاو-28.1 "القوات المسلحة البوروندية" لا تزيد امتصاص تاو تشير إليه استيعاب بوساطة مستقبلات Fc. وتمثل الصور إسقاطات أقصى شدتها طائرات 20 Z-المكدس (طائرات 0.5 ميكرومتر) المكتسبة مع هدف غمر مياه X 63. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
Microglia، المقيم في الدماغ الخلايا المناعية، وقد حددت مؤخرا كعناصر فاعلة هامة في جسم بوساطة النهج العلاجي لمدة10،تاوباثيس11. إزالة تاو جسم بوساطة من microglia، جنبا إلى جنب مع إعاقة امتصاص الخلايا العصبية9أو تثبيط أو زعزعة استقرار فيبريل تشكيل13،14 وتطهير ييفات إينترانيورونال عبر تعويض مسار15، قد تسهم جميعها فعالية جسم تاو المضادة ملاحظة في نموذج الفأر من تاوباثي5،،من67،،من89.
وصفت لنا هنا تحليل يستند إلى الخلية كمياً تقييم امتصاص تاو طريق microglia بهدف إنشاء أداة الفحص لوصف أفضل آليات العمل تاو المضادة الأجسام المضادة.
هذا التحليل، مقتبس من فونك et al. 11، يستخدم خلايا بي-2، وخلايا microglial مورين مخلدة. في حين أنها لا يمكن مقارنة تماما لخلايا microglial الأولية، تمتاز بالعديد من خصائص microglia الأولية، بما في ذلك القدرة قوة phagocytose Aβ وتأو ييفات11،،من1617 ،،من1819. وعلاوة على ذلك، أظهرت أنهم من سلوك استنساخه في المختبر مما جعلها مناسبة جداً لتطوير التحليل والدراسات الكمية، التي تتطلب الحد الأدنى من تقلب التجريبية. إلى جانب هذا، خطوط الخلايا مخلدة تسمح أعلى تحليل الإنتاجية والقضاء على الحاجة إلى التضحية الحيوانية مقارنة باستخدام microglia الأولية.
تم الحصول على المجاميع تاو استخدمنا في هذا التحليل استخدام استنساخه بدرجة عالية في المختبر تجميع الإجراء علينا وصف مؤخرا13، وإظهار مورفولوجيا مماثلة لإقران خيوط حلزونية (ففس) المعزولة من العقول للإعلان المرضى. في حين أننا لم تلاحظ أية نتائج غير متوقعة التي قد يكون ناجماً عن تاو المجاميع التمسك بالأسطح البلاستيكية أو الزجاجية، استخدام المجاميع تاو مستقرة وتتسم أيضا دوراً حاسما في إمكانية تكرار نتائج لهذا التحليل.
وكان الجانب الآخر الذي ساهم مساهمة كبيرة في إمكانية تكرار نتائج الاعتداء كثافة الخلية. تمثل أرقام الخلايا كل بئر الموصوفة في البروتوكول كثافة الخلية الأمثل في الظروف الموصوفة.
بشكل مختلف عن ما فونك et al. 11 الموصوفة، نحن المسمى tau المجاميع مع صبغة حساسة الأس الهيدروجيني مما يزيد بشكل ملحوظ الأسفار عند التدخيل في العضيات الحمضية، مما يسمح للقياس الكمي داخل الخلايا. هذا، جنبا إلى جنب مع التربسين هضم سطح ملزمة إيمونوكومبليكسيس و/أو تاو، الضمانات إشارة الأسفار التي تقاس بالتدفق الخلوي هو نتيجة لامتصاص تاو بدلاً من الربط إلى السطح الخلوي. وعلاوة على ذلك، يتطلب استخدام يخفف صبغة حساسة الأس الهيدروجيني الكشف عن المجاميع تاو المدخلة في تجارب الفحص المجهري دون الحاجة إلى هضم سطح ملزمة إيمونوكومبليكسيس/تاو المجاميع التي سوف ثم إعادة طلاء الخلية والانتعاش.
ونحن أيضا زيادة الأمثل القراءة مجهرية من أعمالنا المقايسة، مقارنة بما قد سبق وصف11، باستخدام صبغة انتقائية للغاية العضيات الحمضية في تجاربنا الفحص المجهري الذي يسمح لنا ليس فقط لتأكيد جسم بوساطة امتصاص تاو، ولكن أيضا التعريب المجاميع تاو في حجرة اندوليسوسومال.
وقد المقايسة وضعنا، التحديد الأمثل الذي ينتج في نافذة تجريبية جيدة مما يتيح فصل قوي بين نماذج إيجابية وسلبية. من المثير للاهتمام، يكشف الفحص غير مباشر الاختلافات في تقارب الأجسام المضادة وبالتالي تمثل أداة قوية لدراسة وظائف المستجيب تاو المضادة الأجسام المضادة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن أشكر ألبرتو كاربينتيرو سواريس له مساعدة تقنية قيمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 10010-015 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| DMEM 4.5 g/dL glucose | Gibco | 41966-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
| pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
| Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
| PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
| Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
| Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
| BSA | Sigma | A7030-100G | |
| EDTA 0.5 M, pH8 | |||
| FACS Canto II | BD | ||
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
| Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |
References
- Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
- Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
- Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
- Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
- Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
- Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
- Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
- Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161 (2015).
- Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).
- Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
- Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
- Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
- Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
- Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).
