Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מבוססת תא Assay ללמוד טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה

Published: November 9, 2018 doi: 10.3791/58576
Automatic Translation
1, 2,3, 3, 3, 4, 3
1Neuroscience Discovery, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, Belgium, 2Department of Hematopoiesis, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, The Netherlands, 3Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, The Netherlands, 4Neuroscience Discovery, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, Pennsylvania

Summary

כאן נתאר וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה עם המטרה של יצירת כלי לניסויים קליניים כדי לאפיין טוב יותר את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו.

Abstract

מחלת אלצהיימר (AD) הוא מצב ניווניות מתקדמת שבה מצטברים טאו ולצבור חלבונים עמילואיד במוח גורם בתפקוד עצביים, מה שמוביל בסופו של דבר ירידה קוגניטיבית. Hyperphosphorylated טאו אגרגטים הנוירון הם האמין כי רוב פתולוגיה הקשורים לספירה. אגרגטים אלה הניחו להשתחרר לתוך תא חוץ-תאית, נלקח על ידי נוירונים סמוכים בריא איפה הם זירוז נוסף צבירת טאו. זה מתפשט "פריון כמו" יכול שתיקטע על-ידי נוגדנים מסוגל מחייב "נטרול" טאו חוץ-תאית אגרגטים כמוצג במודלים פרה העכבר של המודעה. אחד מנגנוני המוצעת שבו נוגדנים טיפולית להפחית פתולוגיה הוא ספיגת בתיווך נוגדנים ואישור של צורות צבורים פתולוגי של טאו מאת מיקרוגלייה. כאן, אנו מתארים כמותיים מבוססת תא הנועד להעריך טאו ספיגת מאת מיקרוגלייה. זה וזמינותו ישתמש בשורת תא microglial העכבר BV-2, מאפשר ירידה לפרטים גבוה, נמוך השתנות של תפוקה בינונית. נתונים שנוצרו עם assay זה יכול לתרום אפיון טוב יותר של פונקציות אפקטור נוגדן אנטי-טאו.

Introduction

מחלת אלצהיימר (AD) הוא מצב ניווניות מתקדמת המאופיינת על ידי השינוי הסתגלותי, הרכבה עצמית של חלבון עמילואיד β פפטיד, טאו לתוך אגרגטים פתולוגי. פפטיד נורמלי β עמילואיד מסיסים מומר β עמילואיד oligomeric ו- fibrillar, בעוד טאו phosphorylated בצורה חריגה מצטברת oligomers ואת הישבן neurofibrillary1,2. אלה אגרגטים חלבון לגרום מוות עצביים המוביל לאובדן זיכרון לאחר מכן ירידה קוגניטיבית מתקדמת. גורמים אחרים, כולל neuroinflammation לא פרודוקטיביים ויכולת מופחתת כדי לנקות חלבונים misfolded, עשוי להחריף ולהאיץ את המחלה. כיום, אסטרטגיות התערבות נגד לספירה לספק הקלה סימפטומטי במידה רבה, אבל אין מחלות שינוי תרופה או מניעה.

הוכחה גוברת מרמזת על תפקיד מפתח של hyperphosphorylated טאו אגרגטים הפתולוגיה של המודעה. במצב שאינם פתולוגיים, טאו הוא מקורי פרש חלבון נקשר microtubules ומקדם את ההרכבה שלהם לתוך שלד התא עצביים. כאשר טאו הופך hyperphosphorylated, הוא מתנתק מן שלד התא, אשכולות לתוך אגרגטים טאו הנוירון, שלפי הסברה כי רוב פתולוגיה הקשורים לספירה3. המצטברים טאו מתחיל לצבור קודם intracellularly, אבל התקדמות המחלה, ההנחה היא להשתחרר מן הנוירונים המושפעת לחלל חוץ-תאית, שממנו זה שאפשר לקחת על ידי נוירונים בריא סמוכות או synaptically מחוברים ב " פריון, כמו אופן". ברגע הפנימו, טאו שסך כל גורם נוסף טאו צבירה באמצעות שינוי בתבניות הסתגלותי4.

על פי השערה זו, טיפולים מסוגל להפריע טאו זריעה עלול להאט או להפוך את הקורס של מחלות ניווניות בתיווך טאו. לתמיכה, להראות עכברים רגישים tauopathy מתוצרת מוטציה גנטית והזריקו פסיבי נוגדנים אנטי-טאו טאו מופחתת פתולוגיה ו פונקציה קוגניטיבית משופרת5,6,7,8 ,9. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו נוגדנים טיפולית להפחית פתולוגיה. עדיין נשארים חמקמקים.

אחד המנגנונים המוצע הוא ספיגת בתיווך נוגדנים ואישור של צורות צבורים פתולוגי של טאו מאת מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח. פרסומים אחרונים מראים כי מיקרוגלייה יכול ביעילות להפנים לבזות את טאו פתולוגיים מינים, יכולת זו מועצמת על ידי נוגדנים אנטי-טאו ויה תלויי-Fc מנגנון מעורבים קולטנים Fc באה לידי ביטוי על פני השטח של מיקרוגלייה, קולטן בתיווך מצרי phagocytosis10,11. נתונים אלה לזהות מיקרוגלייה effectors פוטנציאל חשוב של נוגדנים טיפולית.

נתאר בזאת וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה. נתונים שנוצרו עם assay הזה יכול לעזור שחקרתי את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו ובכך מייצג כלי שימושי כדי להתקדם נוגדנים אנטי-טאו נוספת שלבי התפתחותם כטיפול לספירה פוטנציאליים.

Protocol

1. BV-2 תאים תרבות

הערה: ידית BV-2 תאים תחת בלימה אבטחה ברמה 2. שורת התאים BV-2 מייצרת של רטרווירוס (מסוגלים להדביק תאים מאתר בלבד) מעטפת ecotropic רקומביננטי12; כגון וירוסים ידועים שלהם במבחנה צורה של יכולת ופוטנציאל ויוו tumorigenic.

  1. התרבות התאים BV-2 בגלוקוז גבוהות Dulbecco של שינוי נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), פניצילין U/mL 100, 100 µg/mL סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין (המכונה בינוני culturing מעתה ואילך) על-ידי זריעת תאי-4 x 104 תאים למ"ל.
  2. לשמור על תרבויות באווירה humidified של 5% CO2 ב 37 º C.
    הערה: התאים גדלים באופן רופף המצורפת, ההשעיה.

2. תווית אגרגטים טאו רקומביננטי עם pH רגיש הפלורסנט

הערה: טאו אגרגטים הוכנו כפי שמתואר Apetri. et al. 13 עם הבדל כי אין Thioflavin T (ThT) נוספה למאגר התגובה. צבור דגימות נאספו 1.5 mL צנטריפוגה צינורות. קרינה פלואורסצנטית הסופי אות שנבדקה על ידי ערבוב µL 118 המדגם בריכה עם µL 12 של פתרון ThT 50 מיקרומטר. אגרגטים היו מופרדים על ידי צריך שתוציאו את תערובת התגובה צבירת ב x 20,000 g עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. תגובת שיקוע נותחה על ידי שניה-MALS כדי לוודא כי כל טאו monomeric הוסב אגרגטים. כדורי (טאו אגרגטים) היו הצמד קפוא ומאוחסנים במקפיא ב-80 מעלות צלזיוס.

  1. Resuspend טאו אגרגטים במאגר סודיום ביקרבונט (NaHCO3) של 0.1 M ב- pH 8.5 על ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל (~ 20 מיקרומטר).
    הערה: ריכוז של טאו אגרגטים מבוסס על ריכוז מונומרים הראשונית כפי לאומדן את הספיגה של מונומרים טאו-280 ננומטר באמצעות מקדם של הכחדה של 0.31 mLmg-1ס מ-1.
  2. Sonicate מצרפי resuspended באמצעות sonicator של המכשיר תוך שמירה על קרח כדי למנוע חימום יתר.
    1. השתמש של משרעת של 65% (עם sonicator של כוח 250 ואט).
    2. לבצע 8 פולסים של 3 s עם הפסקות של 15 s בין פולסים כדי למנוע התחממות יתר.
  3. להכין פתרון מניות מ מ 8.9 של pH הרגישים לצבע (מעתה התייחסות כמו צבע pH) דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) בעקבות ההוראה של היצרן.
    הערה: תמיד להכין פתרון טריים ולהשתמש בו רק ביום שזה מוכן.
  4. להוסיף 10 שומות של צבע לכל השומה של חלבון ריכוז לצבוע הסופי של 0.2 מ מ.
  5. מערבבים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
  6. דגירה התערובת תגובה 45 – 60 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
  7. בינתיים, להרכיב ג'ל לתוספי צולבים desalting עמודה ההוראות של היצרן.
  8. Equilibrate את העמודה עם 25 מ של 0.1 M NaHCO3 מאגר pH 8.5 המכיל 3% דימתיל סולפוקסיד. למחוק את הזרימה.
  9. הוסף את המוצר של הנוסעים טאו תיוג תגובה העמודה הנפח הכולל של 2.5 מ. אם המדגם הוא פחות מ 2.5 מ ל, להוסיף מאגר עד הנפח הכולל של 2.5 מ ל מושגת.
  10. תן את הדגימה להזין את הג'ל ארוז לגמרי, למחוק את הזרימה דרך.
  11. Elute עם 3.5 מ של 0.1 M NaHCO3 מאגר pH 8.5 המכיל 3% דימתיל סולפוקסיד ולאסוף את eluate בחלקים שוות ערך 4 צינורות 2 מ"ל.
  12. לקבוע ריכוז חלבון של שברים 4 על ידי assay (BCA) חומצה bicinchoninic.
  13. אחסן את החלבון שכותרתו במקפיא-20 ° C.

3. ספיגת Assay עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) Read-out

  1. יום 1 – הזרע התאים
    1. שטיפת BV-2 תאים הבקבוק על-ידי הסרת culturing בינוני והוספת 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
      הערה: נטילת אמצעי האחסון משתנים בהתאם לגודל של הבקבוק התא המשמש. לדוגמה, עבור בקבוקון T175, לשטוף עם 10 מ"ל של PBS 1 x.
    2. להסיר הבקבוקון PBS ולנתק תאים על-ידי המקננת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) 0.05%-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד התאים לנתק מן הבקבוק (כ- 5 דקות).
      הערה: נפח של טריפסין-EDTA 0.05% תלוי בגודל של הבקבוק תא בשימוש. לדוגמה, עבור בקבוקון T175, השתמש 2 מ של טריפסין-EDTA 0.05%.
    3. Resuspend בתאים culturing בינוני על-ידי pipetting למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים.
      הערה: נפח culturing בינוני משתנה בהתבסס על גודל הבקבוק תא בשימוש ולכן המספר הכולל של התאים הבקבוקון. לדוגמה, עבור בקבוקון T175, השתמש 8 מ ל culturing בינוני.
    4. לספור תאים וליצור השעיה תא עם ריכוז סופי של עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל במדיום תרבות המכיל 200 הפארין μg/mL.
    5. צלחת µL 250 תאים השעיה (2.5 x 104 תאים) לכל טוב בצלחת בתחתית שטוח תרביות רקמה 96-ובכן.
    6. דגירה צלחת בן לילה-CO של 37 ° C ו- 5%-2.
  2. יום 1 – הכנת Immunocomplexes
    1. הפשרת pH לצבוע-טאו על קרח.
    2. להכין μl 65 לכל תנאי של 500 ננומטר פתרון של pH לצבוע-טאו אגרגטים במדיום נטול סרום (SFM) (גלוקוז גבוהה DMEM בתוספת 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו- 200 µg/mL של הפארין).
    3. להכין נוגדן דילולים ב 65 µl SFM, ריכוז כפול אחד הסופי. מערבבים pH לצבוע-טאו אגרגטים נוגדנים בצלחת 96-ובכן u-התחתון. נפח סופי לכל תנאי הוא עכשיו 130 µl והוא הריכוז אגרגטים של צבע-טאו pH 250 ננומטר. לאטום את הצלחת דילול, דגירה במשך הלילה ב 37 º C.
  3. יום 2 – ספיגת Immunocomplexes
    1. הסר בינוני culturing BV-2 תאים. רחץ תאים פעם אחת עם 100 µL בטמפרטורת החדר 1 x PBS.
    2. העברת µL 125 של immunocomplexes על התאים באמצעות פיפטה רב-ערוצי. דגירה התאים עם immunocomplexes עבור 2 h-CO 37 ° C ו-5%2.
    3. הסר המדיום דגירה של התאים ולמחוק את זה. רחץ תאים פעם אחת עם 100 µL בטמפרטורת החדר 1 x PBS.
    4. להסיר 1 x PBS ולטפל תאים עם 50 µL טריפסין-EDTA 0.25% במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2-
    5. להוסיף 200 µL culturing בינוני, resuspend היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. להעביר תאים 96-ובכן U-תחתון צלחת. הצלחת צנטריפוגה x 400 g עבור 5 דקות ב 4 º C.
    6. לשים את הצלחת על קרח, להסיר culturing בינוני ותאי תשטוף פעמיים על-ידי resuspending כדורי תא ב- 150 µL קרח קר 1 x PBS. הצלחת צנטריפוגה x 400 g עבור 5 דקות ב 4 º C.
    7. לשים תאים על קרח, להסיר 1 נוסף-PBS ולשטוף אותם על-ידי resuspending תאים כדורי במאגר 150 µL קר FACS (1 x PBS, 0.5% שור אלבומין (BSA), 2 מ מ EDTA). הצלחת צנטריפוגה x 400 g עבור 5 דקות ב 4 º C.
    8. לשים תאים על קרח, להסיר את מאגר FACS הוסיף, resuspend תאים במאגר 200 µL קר FACS.
    9. לנתח דגימות מיד על ידי FACS רכישת 2 x 104 אירועים בשער תאים חיים (ראה שלב 4.1).

4. FACS ניתוח

הערה: עיין באיור 1 אסטרטגיה חסימה.

  1. תוך שימוש בשטח פיזור קדמי (FSC-A) לעומת הצד פיזור אזור צפיפות (האס-A) העלילה, שער על תאים חיים על ידי למעט אירועים עם פיזור קדימה רמות נמוכות יותר (קרי, פסולת, תאים מתים).
  2. בתוך האוכלוסייה תא חי, השתמש FSC-A לעומת פיזור קדימה גובה (FSC-H) כדי לא לכלול תא doublets, אגרגטים. . זה השער גופיה...
  3. באמצעות האירועים בשער גופיה, ליצור היסטוגרמה פרמטר יחיד לצבוע pH.
  4. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע. לקבוע אחוז pH לצבוע-טאו תאים חיוביים על ידי למעט תאים שלילי נקבע באמצעות השליטה היחידה BV-2.

5. Immunocomplexes ספיגה עם מיקרוסקופ Read-out

  1. יום 1 – הזרע התאים
    1. להכין BV-2 תאים כפי שמתואר שלבים 3.1.1, 3.1.2 ו- 3.1.3.
    2. לספור תאים, resuspend אותם ב culturing בינוניים עד ריכוז סופי של תאים4 10/mL....
    3. צלחת µL 150 תא השעיה (1.5 x 103) לכל טוב בפולי-D-ליזין מצופה צלחת 96-ובכן שחור עם תחתית שטוחה ברור.
    4. דגירה צלחת-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 48 שעות.
  2. יום 3 – להכין Immunocomplexes
    הערה: sonication מתון של טאו שכותרתה אגרגטים לפני הדגירה עם נוגדן, בוצעה לשיפור תוצאות מיקרוסקופיה.
    1. הפשרת pH לצבוע-טאו על קרח, sonicate באמצעות sonicator של המכשיר תוך שמירה על קרח. השתמש של משרעת של 15% (sonicator כוח של 250 ואט). לבצע-30 פולסים של 2 s ו- s חכה 20 בין פולסים.
    2. להכין μl 65 לכל תנאי של 500 ננומטר פתרון של אגרגטים לצבוע-טאו pH SFM.
    3. לדלל נוגדני µl 65 של SFM כדי ריכוז כפול אחד הסופי. מערבבים pH לצבוע-טאו אגרגטים נוגדנים בצלחת 96-ובכן u-התחתון. נפח סופי לכל תנאי הוא עכשיו 130 µl והוא הריכוז אגרגטים של צבע-טאו pH 250 ננומטר. לאטום את הצלחת דילול, דגירה במשך הלילה ב 37 º C.
    4. הסר בינוני תא צלחת והחלף 150 µL culturing בינוני בתוספת 200 הפארין µg/mL. דגירה צלחת בן לילה-CO של 37 ° C ו- 5%-2.
  3. יום 4 – ספיגת Immunocomplexes
    1. הסר בינוני culturing התאים BV-2. העברת µL 125 של immunocomplexes על התאים באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
    2. דגירה התאים עם immunocomplexes עבור 1 h ו- 45 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
      כתם תא גרעינים עם צבע מסוים DNA ו organelles חומצי עם מכשיר בדיקה אשר באופן סלקטיבי את כתמי תאים סלולריים pH נמוך. דגירה התאים 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
      הערה: לדלל את צבעי ב- SFM.
    3. לבצע באמצעות הדמיה לחיות תאים תכולה גבוהה קונאפוקלית מערכת הסינון. להגדיר טמפרטורה CO 37 ° C ו-5%2. לתמונות באיכות גבוהה, להשתמש מטרה טבילה 63 X מים ולרכוש מטוסים מיקרומטר 0.5 (20 לכל Z-מחסנית) לכל שדה תמונה.

Representative Results

טאו רקומביננטי צבורים היה covalently בלוחיות צבע ירוק pH-רגיש. צבע זה מגדיל באופן דרמטי את זריחה על הפנמה שלה ב organelles חומצי, ובכך לאפשר על כימות תאיים. טאו שכותרתו אגרגטים היו מודגרות עם נוגדנים חד-שבטיים אנטי-טאו. בפרט, השתמשנו גרסה chimeric (אזור IgG1 Fc העכבר) של CBTAU-28.1. נוגדן האנושי הזה נקשר לאזור הוספה N-מסוף של טאו, והוא מסוגל לקשור במבחנה שנוצר טאו הסיבים13. ב הזה assay, בדקנו גם גירסה זיקה-משופרת של CBTAU-28.1-dmCBTAU-28.1. Fab שברי CBTAU-28.1, ב החשבונאי הורים ואהדה גבוהה עיצוב ולאחר עכבר IgG1 שימשו השליטה isotype שולט.

BV-2 תאים היו מודגרות עם immunocomplexes הקבועים מראש או מצטברים לבד במשך שעתיים בנוכחות הפארין לחסום את ספיגת נוגדן תלויית טאו טאו. לאחר דגירה, התאים היו trypsinized כדי להסיר את טאו מאוגדים קרום חוץ-תאית, נותחו עבור ספיגת טאו מאת cytometry זרימה. כפי שהסברנו לאחרונה13, הבחנו כי ספיגת גרסאות קידום CBTAU-28.1 של טאו BV-2 תאים באופן תלוי מינון. תפיסה היה Fc מתווכת מאז CBTAU-28.1 Fab קטעים לא להגביר ספיגת טאו הבזליים (איור 2). יתר על כן, הנוגדן dmCBTAU-28.1 זיקה גבוהה מתווכת טאו ספיגת לתאים BV-2 במידה גבוהה יותר מאשר פראי-סוג נוגדן (איור 2).

טאו בתיווך נוגדנים ספיגת ולוקליזציה של טאו אגרגטים בתא endolysosomal אושר ע י מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 3) איפה תא הסלולר חומצי היתה מוכתמת באמצעות בדיקה סלקטיבית עבור pH נמוך organelles. Puncta תאיים של צבע ירוק pH כאנטי אגרגטים נצפו בתוך התאים היו מודגרות עם CBTAU-28.1 טאו. יתר על כן, אגרגטים טאו תאיים colocalized לעיתים קרובות עם pH נמוך תא סלקטיבי צבע אדום שהציעה נוכחות של אגרגטים טאו organelles חומצי. CBTAU-28.1 Fab קטעים לא גדלה ספיגת טאו שוב המציין מנגנון הפנמה Fc-קולטן בתיווך מצרי (איור 3).

Figure 1
איור 1: Gating אסטרטגיה להשתמש בניתוח cytometry זרימה כדי לזהות טאו הפנמה מאת BV-2 תאים. דגום נתונים השליטה היחידה BV-2 (A-C), שליטה isotype (D-F), dmCBTAU-28.1 (G-אני) מוצגים. אוכלוסיית תאים BV-2 היה פיקוח על מגרש האס-A צפיפות לעומת FSC-A, למעט פסולת ותאים מתים (A, D, G). BV-2 תאים היו אז עוד יותר פיקוח על מגרש צפיפות FSC-A vs FSC-H כדי לא לכלול תא doublets, אגרגטים (B, E, H). שער תא בודד שימש כדי ליצור היסטוגרמה פרמטר יחיד צבען (FITC בתוצאות אלה נציג) pH (C, F, אני) קובעים את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגיאומטרי. לחלופין, אחוז תאים חיוביים של צבען-טאו pH מחושב למעט תאי שלילי כפי שנקבע על-ידי שימוש השליטה היחידה BV-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: CBTAU-28.1 שמתווכת ספיגת של טאו אגרגטים לתאים microglial BV-2- טאו רקומביננטי צבורים covalently בלוחיות לצבוע pH תלויית קרינה פלואורסצנטית ירוק, מודגרות עם העכבר גירסה chimeric של הנוגדן אנטי-טאו האנושי CBTAU-28.1, שלו זיקה עיצוב משופר, dmCBTAU-28.1, קטעים Fab המתאימים, עכבר IgG1 isotype שליטה נוגדן או אין נוגדנים (אגרגטים טאו לבד). Immunocomplexes היו לאחר מכן מודגרות עם BV-2 תאים במשך שעתיים בנוכחות הפארין לחסום את ספיגת נוגדן תלויית טאו. קליטת immunocomplexes הוערכה על ידי cytometry זרימה, המבוטא הממוצע הגאומטרי (GM) של עוצמת קרינה פלואורסצנטית (A) או אחוז חיובי טאו (טאו +) תאים (B). קווי שגיאה ב- (א) מציינות סטיית התקן של שני ניסויים עצמאית, תוך כדי (ב) מראה ניסוי יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: טאו הם הפנימו מאת BV-2 תאים אגרגטים לשפה ב הסלולר organelles חומצי. טאו preformed-נוגדן immunocomplexes היו מודגרות עם BV-2 תאים במשך שעתיים בנוכחות הפארין לחסום את ספיגת נוגדן עצמאית. לאחר דגירה, גרעינים היו מוכתמים DNA ספציפיים הצבע הכחול, תא הסלולר חומצי עם pH נמוך תא סלקטיבי אדום צבע. הדמיה לחיות תאים חשף puncta תאיים של אגרגטים שכותרתו טאו (ירוק) בתוך התאים היו מתפשט CBTAU-28.1 ו- dmCBTAU-28.1, אבל לא עם הפקד isotype. יתר על כן, אגרגטים טאו תאיים colocalized לעיתים קרובות עם האדום לצבוע (צהוב) ובכך רומז נוכחות של טאו אגרגטים בתא הסלולר חומצי. CBTAU-28.1 Fab קטעים לא גדלה ספיגת טאו המציינת את מנגנון הפנמה Fc-קולטן בתיווך מצרי. תמונות מייצגות תחזיות העוצמה המקסימלית מטוסים 20 Z-מחסנית (0.5 מיקרומטר מטוסים) רכשה עם יעד טבילה 63 X מים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

מיקרוגלייה, תאי מערכת החיסון של המוח תושב, זוהו לאחרונה כמו שחקנים חשוב בתיווך נוגדנים גישות טיפוליות עבור10,tauopathies11. טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה, יחד עם חסימת ספיגת עצביים9, עיכוב או הקשורה fibril היווצרות13,14 ואישור של הסיבים intraneuronal ויה lysosomal מסלול15, אולי כל מה לתרום היעילות נוגדן אנטי-טאו נצפתה במודל עכבר של tauopathy5,6,7,8,9.

אנו המתואר כאן וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה עם המטרה של יצירת כלי לניסויים קליניים כדי לאפיין טוב יותר את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו.

זה וזמינותו, מ פאנק. et al. 11, משתמשת BV-2 תאים, אשר הם תאים מונצחים מאתר microglial. בעוד הם לחלוטין שלא להתפלא לתאים microglial העיקרי, הם כוללים רבים של מאפייני מיקרוגלייה הראשי, כולל את היכולת של robustly phagocytose Aβ וגם טאו הסיבים11,16,17 ,18,19. יתר על כן, הם הראו על התנהגות לשחזור במבחנה שהפך אותם המתאים מאוד לצרכי assay ופיתוח מחקרים כמותיים, אשר דורשים השתנות ניסיוני מינימלי. לצד זה, שורות תאים מונצחים מאפשרות תפוקה גבוהה יותר assay, לבטל את הצורך להקריב חיה לעומת השימוש מיקרוגלייה העיקרי.

מצרפי טאו שהשתמשנו ב- assay זו התקבלו באמצעות מאוד לשחזור במבחנה צבירת ההליך כי אנו המתואר לאחרונהבת 13, ואת הצג המורפולוגיה דומה כדי לזווג חוטים לוליינית (PHFs) מבודד מן המוח של AD מטופלים. אמנם לא נתבונן כל תוצאה לא צפויה אולי נגרמו על-ידי דבקות אגרגטים טאו משטחי פלסטיק או זכוכית, השימוש של טאו טוב מאופיין ויציבה אגרגטים שיחק תפקיד מכריע הפארמצבטית של זה וזמינותו.

היבט נוסף שלא תרמה בצורה משמעותית assay הפארמצבטית הייתה צפיפות התאים. המספרים של תאים לכל באר תיאר בפרוטוקול מייצגים את צפיפות תא אופטימלית בתנאים המתוארים.

באופן שונה ממה הפאנק et al. 11 תיאר, אנחנו כאנטי אגרגטים טאו עם צבע רגיש pH אשר מגביר באופן משמעותי את זריחה על הפנמה של organelles חומצי, ובכך מאפשר על כימות תאיים. זה, יחד עם טריפסין העיכול של השטח מאוגדים immunocomplexes ו/או טאו, ערבויות שאותות פלורסצנטיות נמדדת cytometry זרימה הוא התוצאה של טאו ספיגת ולא מחייב השטח הסלולר. יתר על כן, השימוש מקל על צבען רגיש pH גילוי של טאו למביטה אגרגטים בניסויים מיקרוסקופ ללא צורך לעכל משטח מאוגד אגרגטים immunocomplexes/טאו אשר היה אז דורש תא ציפוי מחדש ושחזור.

אנחנו גם הלאה ממוטב את read-out מיקרוסקופיה של שלנו assay, לעומת מה שהיה בעבר תיאר11, באמצעות צבע סלקטיבי מאוד עבור organelles חומצי בניסויים שלנו-מיקרוסקופיה אשר אפשרה לנו לא רק כדי לאשר נוגדן בתיווך ספיגת טאו, אך גם לוקליזציה של טאו אגרגטים בתוך התא endolysosomal.

וזמינותו שפיתחנו, יש ירידה לפרטים אופטימלי אשר התוצאות בחלון ניסיוני טוב המאפשר הפרדה חזק בין דגימות חיוביות ושליליות. מעניין, וזמינותו בעקיפין מזהה הבדלים זיקה נוגדן ובכך מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד נוגדן אנטי-טאו אפקטור פונקציות.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות אלברטו Carpinteiro סוארש לסיוע טכני יקר שלו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV-2 cells ICLC Interlab Cell Line Collection ATL03001
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) Gibco 10010-015
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300-054
DMEM 4.5 g/dL glucose Gibco 41966-029
Fetal Bovine Serum Gibco 10091-148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
L-Glutamine 200 mM Lonza 17-605E
EasYFlask Nunc 156499 / 159910
pHrodo Green STP ester Life Technologies P35369 
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM
DMSO Sigma D2650-100ml
PD10 columns GE Healthcare 17-0851-01
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Greiner 665180
Falcon 96-Well Assay Plates Falcon 353910
Heparin Sigma  H3393-50KU
Trypsin-EDTA 0.25% Sigma T4049-100ml
BSA Sigma A7030-100G
EDTA 0.5 M, pH8
FACS Canto II BD
Hoechst 33342 Solution (20 mM) Thermo Fisher Scientific 62249
LysoTracker Deep Red Thermo Fisher Scientific L12492
Opera Phenix Perkin Helmer HH14000000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
  2. Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
  3. Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
  4. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  5. Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
  6. Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
  7. Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
  8. Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
  9. Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
  10. Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161 (2015).
  11. Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
  12. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
  13. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).
  14. Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
  15. Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
  16. Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
  17. Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
  18. Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
  19. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).

Tags

מדעי המוח גיליון 141 אלצהיימר tauopathy טאו צבירה מיקרוגלייה BV-2 ספיגת סיווג.
מבוססת תא Assay ללמוד טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Marco, D., Taggenbrock, R.,… More

De Marco, D., Taggenbrock, R., Crespo, R., Koudstaal, W., Ramsburg, E., Apetri, A. Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia. J. Vis. Exp. (141), e58576, doi:10.3791/58576 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter