Summary
여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.
Abstract
Alzheimer의 질병 (광고)는 진보적인 신경 상태 집계 타우 이며 녹말 체 단백질 인지 감소를 이끌어 결국 신경 장애를 일으키는 두뇌에 축적. Hyperphosphorylated 타우 집계 신경에서 광고와 관련 된 병 리의 대부분을 일으키는 것으로 추정 된다. 이러한 집계는 extracellular 구획에 나올 생각 하 고 어디 그들은 유도 타우 집계 추가 인접 한 건강 한 신경에 의해 촬영. 이 "프리온-같은" 확산 항 체 바인딩 및 "중화" 광고의 전 임상 마우스 모델에서와 같이 extracellular 타우 집계에 의해 중단 될 수 있습니다. 항 체 중재 통풍 관 및 병 적인 집계 형태의 microglia에 의해 타우의 치료 항 체 병 리를 줄일 제안 된 메커니즘 중 하나입니다. 여기, 우리 타우 글귀 microglia 평가를 양적 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 마우스 microglial 셀 라인 BV-2를 사용 하 여, 높은 특이성, 낮은 변동성 및 중간 처리량에 대 한 수 있습니다. 이 분석 결과 함께 생성 된 데이터는 안티 타우 항 체 effector 기능 더 나은 특성화에 기여할 수 있다.
Introduction
Alzheimer의 질병 (광고)은 병 적인 집계에 아 밀 로이드 β 펩 티 드와 타우 단백질의 구조적 변화에 의해 및 자기 조립 특징 진보적인 신경 퇴행 성 조건. 비정상적으로 phosphorylated 타우 올리고 neurofibrillary tangles1,2로 축적 하는 동안 정상적인 성 아 밀 로이드 β 펩 티 드 oligomeric 및 원 아 밀 로이드 β로 변환 됩니다. 이러한 단백질 집계 발생할 메모리 손실 및 연속적인 진보적인 인식 쇠퇴에 지도 하는 신경 죽음. 비 생산적 neuroinflammation를 misfolded 단백질 감소 능력 등 다른 요인 악화 하 고 질병을 가속 수 있습니다. 현재, 주로 징후 기복을 제공 하는 광고에 대 한 개입 전략 하지만 질병 수정 치료 또는 예방.
증거를 증가 광고의 병리학에서 hyperphosphorylated 타우의 중요 한 역할을 건의 한다. 비 병 적인 상태로 타우 microtubules에 바인딩하고 촉진 신경 세포 골격에 해당 어셈블리는 기본적으로 펼쳐진된 단백질입니다. 타우 된다 hyperphosphorylated, 골격에서 분리 하 고는 대부분 광고3와 관련 된 병 리 현상의 원인으로 신경, 타우 집계에 클러스터. 처음 침, 축적 하는 타우 시작 되지만 질병 진행에서 그것은 채택 될 수 있다 인접 또는 synaptically 연결 된 건강 한 신경에 의해 세포 외 공간으로 영향 받은 신경에서 출시 될 가정에 " 프리온과 같은 방식으로 ". 내 면, 일단 타우 집계 추가 타우 집계를 통해 템플릿 기반 구조적 변화4을 유도 합니다.
이 가설에 따르면 타우 시드 중단 수 요법 감속 하거나 타우 중재 신경 질환의 과정을 반전 수 있습니다. 이, 지원 쥐 유전자 변이 의해 tauopathy에 취약 하 고 수 동적으로 안티 타우 항 체 주사 쇼 감소 타우 병리학과 향상 된 인지 기능5,6,7,8 ,9. 그러나, 치료 항 체 병 리를 줄일 메커니즘은 여전히 애매 남아.
항 체 중재 통풍 관 및 병 적인 집계 형태의 microglia, 두뇌의 주민 면역 세포에 의해 타우의 제안 된 메커니즘 중 하나입니다. 최근 간행물 microglia 수 효율적으로 내 면화 하 고 병 적인 타우 종족 저하 안티 타우 항 체를 통해 Fc-종속 메커니즘의 표면에 Fc 수용 체를 포함 하 여이 능력은 향상 하 고 좋습니다. microglia 및 수용 체 중재 먹어서10,11. 이러한 데이터는 치료 항 체의 잠재적으로 중요 한 이펙터로 microglia를 식별합니다.
여기 타우 글귀 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 사용 하 여 생성 하는 데이터 사전 방지 타우 항 체 잠재적인 광고 치료로 그들의 발달의 더 단계에 유용한 도구를 대표 하는 따라서 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 elucidating 도울 수 있다.
Protocol
1. BV-2 셀 문화
참고: 핸들 BV-2 셀 Biosafety 수준 2 포함에서. BV-2 셀 라인 생산는 엔벌로프된 재조합 ecotropic 레트로 바이러스 (murine 세포만 감염 가능)12. 이러한 바이러스는 그들의 생체 외에서 vivo에서 tumorigenic 잠재력과 능력에 대 한 알려져 있다.
- 높은 포도 당 Dulbecco의 문화 BV-2 셀이 글 중간 (DMEM) 4 x 104 셀 시드 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스와 2 mM L-글루타민 (라고도 자란 매체에서)와 보완 수정 셀/mL.
- 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 문화를 유지
참고: 셀 성장 느슨하게 연결 된 서 스 펜 션에.
2. 레이블 재조합 타우 집계 pH에 민감한 형광 염료
참고: 타우 집계 Apetri 외 에 설명 된 대로 준비 했다 13 차이 없음 Thioflavin T (ThT) 반응 버퍼에 추가 되었습니다. 집계 된 샘플은 원심 분리기 튜브 1.5 mL에서에서 수집 되었습니다. 최종 형광 신호를 50 µ M ThT 솔루션의 12 µ L로 풀 샘플의 118 µ L를 혼합 하 여 확인 했다. 집계에서 20000 x g 1 h 4 ° c.에 대 한 집계 반응 혼합물 centrifuging 구분 했다 상쾌한 초-MALS 모든 단위체 타우 집계로 변환 되었습니다 확인 하 여 분석 했다. 펠 릿 (타우 집계) 스냅 냉동 고-80 ° c.에 냉동 고에 저장 되었다
- 1 mg/mL의 농도에 pH 8.5에서 타우 집계 0.1 M 탄산 버퍼 (NaHCO3)에서 resuspend (~ 20 µ M).
참고: 타우의 농도 280에서 타우 단위체의 흡수에 의해 평가 초기 단위체 농도에 따라은 nm 0.31 mLmg-1c m-1의 소 광 계수를 사용 하 여. - 과열을 피하기 위해 얼음에 유지 하는 동안 프로브 sonicator를 사용 하 여 resuspended 집계 sonicate
- (전력 250 W sonicator)와 65%의 진폭을 사용 합니다.
- 3의 8 펄스 수행 s 15의 일시 중지로 과열 방지를 위해 펄스 사이 s.
- 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 제조업체의 명령 다음에 pH에 민감한 염료 (이제부터 참조 pH 염료로)의 8.9 m m 재고 솔루션을 준비 합니다.
참고: 항상 새로운 솔루션을 준비 하 고 그것은 준비 하는 날에만 그것을 사용 하 여. - 0.2 m m의 최종 염료 농도에 단백질의 두더지 당 염료의 10 두더지를 추가 합니다.
- 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.
- 실내 온도, 빛에서 보호에 45-60 분에 대 한 반응 혼합물을 품 어.
- 한편, 제조업체의 지침에 따라 열 담 복사해올된 dextran 젤 조립.
- 25 mL의 0.1 M NaHCO3 버퍼 pH 8.5 포함 3 %DMSO 열 equilibrate 삭제를 통해 흐름.
- 타우 집계 라벨 2.5 mL의 총 볼륨에 열에 반응의 제품을 추가 합니다. 샘플은 2.5 mL 미만, 2.5 mL의 총 볼륨 달성 될 때까지 버퍼를 추가 합니다.
- 샘플 포장된 젤을 완전히 입력, 흐름을 통해 삭제 하자.
- 0.1 m M NaHCO3 버퍼 pH 8.5 포함 3 %DMSO 3.5 mL와 함께 elute 고 4 해당 분수 2 mL 튜브에에서 eluate 수집 합니다.
- Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 의해 4 분수의 단백질 농도 결정 합니다.
- -20 ° C 냉장고에 레이블이 지정 된 단백질을 저장 합니다.
3. 통풍 관 분석 결과 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 읽기
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제 1 일 – 씨 셀
- 워시 BV-2 세포 배양 매체 및 추가 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x를 제거 하 여 플라스 크에.
참고: 사용 하는 셀 플라스 크의 크기에 따라 달라 집니다 볼륨을 세척. 예를 들어 T175 플라스 크에 대 한 1 x PBS의 10 mL로 씻어. - 플라스 크에서 PBS를 제거 하 고 세포를 플라스 크 (약 5 분)에서 분리 될 때까지 트립 신-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 0.05%에서 37 ° C, 5% CO2 배양 하 여 세포를 분리.
참고: 트립 신-EDTA 0.05%의 볼륨 사용 셀 플라스 크의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어 T175 플라스 크에 대 한 트립 신-EDTA 0.05%의 2 개 mL를 사용 합니다. - 3-5 번 위아래로 pipetting으로 매체를 경작에 셀 resuspend
주: 매체를 경작의 볼륨 사용 셀 플라스 크의 크기 및 따라서 플라스 크에 세포의 총 수에 따라 다릅니다. 예를 들어 T175 플라스 크 배양 매체의 8 mL 사용. - 셀 하 고 200 μ g/mL 헤 파 린을 포함 하는 문화 매체에 1 x 105 셀/mL의 최종 농도와 세포 현 탁 액을 만듭니다.
- 세포 현 탁 액 (2.5 x 104 셀) 당 96 잘 조직 문화 플랫 바닥 접시에 잘의 250 µ L 플레이트.
- 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 플레이트를 품 어.
- 워시 BV-2 세포 배양 매체 및 추가 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x를 제거 하 여 플라스 크에.
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제 1 일 – 준비 Immunocomplexes
- PH 염료-타우 얼음에 녹여
- 혈 청 무료 매체 (SFM) (높은 포도 당 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스와 200 µ g/mL 헤 파 린 보충 DMEM)에 염료-타우 집계 pH의 500 nM 솔루션의 조건 당 65 μ를 준비 합니다.
- 항 체 희석 65 µ l에 SFM의 고 농도에 마지막 한 두 번 준비 합니다. 믹스 pH 염료-타우 집계, 96-잘 u-하단 플레이트에 항 체. 마지막 볼륨 상태 당 지금 130 µ l 이며 pH 염료-타우 집계 농도 250 nM. 희석 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
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제 2 일 – Immunocomplexes 통풍 관
- BV-2 세포에서 자란 매체를 제거 합니다. 셀 100 µ L 실내 온도 1 x PBS로 한 번 씻는 다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀에 immunocomplexes의 125 µ L를 전송 합니다. 2 h 37 ° C, 5% CO2에 대 한 immunocomplexes 셀을 품 어.
- 셀에서 인큐베이션 매체를 제거 하 고 그것을 폐기. 셀 100 µ L 실내 온도 1 x PBS로 한 번 씻는 다.
- 1 x PBS를 제거 하 고 치료 셀 50 µ L 37 ° C에서 20 분에 대 한 트립 신-EDTA 0.25%와 5 %CO2.
- 자란 매체의 200 µ L을 추가 하 고 셀을 분리 하려면 아래로 pipetting에 의해 잘 resuspend. 96-잘 U-아래쪽 셀 전송 접시. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 플레이트
- 얼음에 접시를 넣어, 150 µ L 얼음 감기 1 x PBS에 셀 알 약 resuspending에 의해 두 번 매체 및 세척 세포 배양을 제거 합니다. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 플레이트
- 얼음에 셀, PBS와 resuspending에 의해 그들 150 µ L 찬 FACS 버퍼 (1 x PBS, 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 2 mM EDTA) 펠 릿 세포 세척 추가 1 제거. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 플레이트
- 얼음에 셀을 넣어, 추가 FACS 버퍼를 제거 하 고 셀 200 µ L 찬 FACS 버퍼에 resuspend.
- 2 × 104 이벤트 라이브 셀 게이트에서 인수 FACS에 의해 즉시 샘플을 분석 (단계 4.1 참조).
4. FACS 분석
참고: 제어 전략에 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.
- 앞으로 분산형 영역을 사용 하 여 (FSC-A) 쪽 지역 (SSC-A) 밀도 점도, 낮은 앞으로 분산형 수준 (즉, 파편 및 죽은 세포)와 함께 이벤트를 제외 하 여 라이브 셀에 게이트 대.
- 사용 하 여 살아있는 세포 인구 FSC-A 앞으로 살포 높이 (FSC-H) 셀 남자 및 집계 제외 하 대. 이것은 내의 게이트 이다.
- 이벤트를 사용 하 여 내의 게이트, pH 염료 단일 매개 변수 히스토그램을 생성 합니다.
- 말은 형광 강도 결정 합니다. 로 부정적인 셀을 제외 하 여 pH 염료-타우 긍정적인 세포의 비율 결정 BV-2만 컨트롤을 사용 하 여 결정 합니다.
5. Immunocomplexes 현미경 읽기와 이해
-
제 1 일 – 씨 셀
- 3.1.1 3.1.2, 3.1.3 단계에 설명 된 대로 BV-2 셀을 준비 합니다.
- 셀의 개수 및 매체 104 셀/mL의 최종 농도에 경작에 그들을 resuspend.
- 세포 현 탁 액의 150 µ L 플레이트 (1.5 x 103) 폴 리-D-리 신에 잘 당 96 잘 검정 분판으로 분명 평면 바닥 코팅.
- 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어.
-
제 3 일 – 준비 Immunocomplexes
참고: 이전에 항 체를 가진 외피 이라는 타우의 가벼운 쥡니다 현미경 결과 개선 하기 위해 수행 되었다.- PH 염료-타우 얼음에 녹여 고 프로브 sonicator를 사용 하 여 얼음에 유지 하면서 sonicate. 15% (250 W의 sonicator 힘)의 진폭을 사용 합니다. 2 s와 펄스 사이 대기 20 s 30 펄스를 수행.
- SFM에 pH 염료-타우의 500 nM 솔루션의 조건 당 65 μ를 준비 합니다.
- 마지막 한 두 배 농도에 SFM의 65 µ l에 항 체 희석. 믹스 pH 염료-타우 집계, 96-잘 u-하단 플레이트에 항 체. 마지막 볼륨 상태 당 지금 130 µ l 이며 pH 염료-타우 집계 농도 250 nM. 희석 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 셀 접시에서 매체를 제거 하 고 자란 매체 200 µ g/mL 헤 파 린으로 보충의 150 µ L를 바꿉니다. 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 플레이트를 품 어.
-
제 4 일-Immunocomplexes 통풍 관
- BV-2 세포에서 자란 매체를 제거 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀에 immunocomplexes의 125 µ L를 전송 합니다.
- 1 h 45 분 5% CO2와 37 ° C에서 immunocomplexes 셀을 품 어.
세포 핵 DNA 특정 염료와와 산 성 세포는 프로브는 낮은 pH 세포 구획을 선택적으로 얼룩 얼룩. 셀 5% CO2와 37 ° C에서 15 분을 품 어.
참고: SFM에 염료 희석. - 라이브 셀 이미징 사용 하 여 높은 콘텐츠 confocal 시스템 심사를 수행 합니다. 37 ° C, 5% CO2온도 설정 합니다. 높은 품질의 이미지에 대 한 63 X 물 침수 목표를 사용 하 고 이미지 필드 당 0.5 µ m 평면 (Z-스택 당 20) 취득.
Representative Results
집계 된 재조합 타우 pH에 민감한 녹색 염료와 covalently 이라는 했다. 이 염료는 극적으로 그것의 형광 세포내 정량화에 대 한 수 있도록 산 성 세포에서의 국제화에 따라 증가 합니다. 레이블이 지정 된 타우 집계 했다 안티 타우 단일 클론 항 체와 알을 품을. 특히, 우리는 CBTAU 28.1의 공상 버전 (마우스 IgG1 Fc 영역)를 사용합니다. 이 인간 항 체의 N 맨끝 삽입 영역에 한다 생체 외에서 생성 된 타우 소13바인딩할 수 있습니다. 이 분석 결과에서 우리는 또한 CBTAU-28.1-dmCBTAU-28.1의 선호도 향상 버전 테스트. 보호자 및 높은 선호도 돌연변이에서 CBTAU-28.1, fab 조각 서식 하 고 제어 하는 마우스 IgG1 isotype 제어로 사용 되었다.
BV-2 셀 미리 형성 된 immunocomplexes와 incubated 했다 또는 헤 파 린 항 체 독립적인 타우 통풍 차단 하 면 전에 서 2 시간 동안 혼자 타우를 집계. 부 화, 이후 세포 세포 외 막에 바인딩된 타우를 제거 하려면 trypsinized 했다 고 cytometry 타우 통풍 관에 대 한 분석 했다. 우리는 최근에13설명, 복용량 의존 방식으로 그 CBTAU 28.1 변종 승진 통풍 관 BV-2 셀에의 관찰 합니다. 글귀 Fc CBTAU 28.1 팹 조각 기저 타우 통풍 관 (그림 2)를 증가 하지 않았다 때문에 중재 했다. 또한, 높은 선호도 dmCBTAU 28.1 항 체 야생 형 항 체 (그림 2) 보다 더 높은 정도로 BV-2 셀으로 타우 글귀를 중재.
항 체 중재 타우 통풍 관 및 endolysosomal 구획에 타우의 지역화 confocal 현미경 검사 법 (그림 3)에 의해 확인 되었다 어디 산 성 세포질 구획은 낮은 pH 세포에 대 한 선택적 프로브를 사용 하 여 스테인드. 세포내 puncta 녹색 pH 염료의 분류 타우 집계와 CBTAU 28.1 incubated 했다 셀 안에 관찰 되었다. 낮은 pH 구획 선택적 붉은 염료와 산 성 세포에 타우의 존재를 제안 하는 따라서 세포내 타우 집계 자주 colocalized 또한, CBTAU-28.1 팹 조각 다시 Fc 수용 체 중재 국제화 메커니즘 (그림 3)를 나타내는 타우 통풍 관을 증가 하지 않았다.
그림 1: 타우 국제화 BV-2 셀에 의해 감지 흐름 cytometry 분석에 사용 되는 전략 게이팅. BV-2만 제어 (A C) isotype 제어 (D-F), dmCBTAU-28.1에서 데이터 샘플 (G-난) 표시 됩니다. BV-2 셀 인구 파편과 죽은 세포 (A, D, G)를 제외 하 고 금감위 A vs SSC-A 밀도에 문이 되었다. BV-2 셀 추가 셀 남자 및 집계 (B, E, H)를 제외 하 FSC-A vs FSC-H 밀도에 문이 다음 했다. 단일 셀 게이트 pH 염료 (이 대표 결과에 FITC) 단일 매개 변수 히스토그램을 생성 하는 데 사용 되었다 (C, F, 난)은 형광 강도 결정 하 고. 또는 pH 염료-타우 긍정적인 세포의 백분율 BV-2만 컨트롤을 사용 하 여 결정으로 부정적인 세포를 제외 하 고 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: CBTAU 28.1 중재 microglial BV-2 셀으로 타우 집계의. 집계 된 재조합 타우 covalently 녹색 형광 pH에 민감한 염료와 분류 그리고 incubated 인간의 안티 타우 항 체의 선호도 향상 된 포맷, dmCBTAU-28.1, CBTAU-28.1의 마우스 공상 버전 해당 팹 조각, 한 마우스 IgG1 isotype 제어 항 체 또는 아무 항 체 (타우 혼자 집계). Immunocomplexes 헤 파 린 항 체 독립적인 타우 통풍 차단 하 면 전에 서 2 시간 동안 BV-2 셀 이후에 incubated 했다. Immunocomplexes의 cytometry에 의해 평가 되었다 고 셀 (B) 형광 강도 (A) 또는의 긍정적인 (타우 +) 비율의 기 평균 (GM)으로 표시. 오차 막대 (A)에서 두 개의 독립적인 실험의 표준 편차, (B) 쇼 동안 단일 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 타우 집계 BV-2 세포에 의해 내 면화 및 셀룰러 산 성 세포에서 지역화. 미리 형성한 타우-항 immunocomplexes 항 체 독립적인 통풍 관을 차단 하는 헤 파 린 존재 2 시간 동안 BV-2 셀 incubated 했다. 외피, 후 핵 DNA 특정 파란색 염료와 낮은 pH 구획 선택적 붉은 염료와 산 성 세포질 구획 얼룩이 있었다. 라이브 셀 이미징 28.1 CBTAU와 dmCBTAU-28.1, 하지만 하지 isotype 컨트롤 incubated 했다 셀 안에 레이블된 타우 집계 (녹색)의 세포내 puncta를 밝혔다. 또한, 세포내 타우 집계 자주 빨간색으로 colocalized 염료 (노란색) 따라서 산 성 세포질 구획에 타우의 존재를 제안. CBTAU-28.1 팹 조각 국제화 하는 Fc 수용 체 중재 메커니즘을 나타내는 타우 통풍 관을 증가 하지 않았다. 이미지는 63 X 물 침수 목표 획득 20 비행기 Z-스택 (비행기 0.5 µ m)의 최대 강도 계획을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
Microglia, 거주 뇌의 면역 세포, 항 체 중재 치료 접근 tauopathies10,11에 대 한 중요 한 선수로 최근 확인 되었습니다. Microglia 차단 신경 통풍 관9, 억제 또는 fibril 형성13,14 의 불안 및 intraneuronal 소 통해 의 클리어런스는 lysosomal 함께 의해 항 체 중재 타우 클리어런스 통로15, 모든 tauopathy5,6,7,,89의 마우스 모델에서 안티 타우 항 체 효능에 기여할 수 있습니다.
우리 여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.
이 분석 결과, 펑크 외. 에서 적응 11, 불멸 하 게 murine microglial 셀 BV-2 세포를 사용 합니다. 그들은 완전히 기본 microglial 셀에 비교 될 수 없다, 그러나 그들은 많은 기능이 기본 microglia 특성의 Aβ와 타우 소11,,1617 phagocytose 견고의 기능을 포함 하 여 ,1819. 또한, 그들은를 재현할 동작에서 보여주었다 생체 외에서 분석 결과 개발 및 최소한의 실험적인 변화를 요구 하는 양적 연구에 매우 적합 한 그들을 만든. 이 옆에 불멸 하 게 셀 라인 높은 분석 결과 처리량을 허용 하 고 기본 microglia의 사용에 비해 동물 희생에 대 한 필요성을 제거.
우리는이 분석 결과에서 사용 하는 타우 집계 높은 재현성 생체 외에서 집계 설명 하는 절차는 우리가 최근13및 쇼에 유사한 형태학 짝 나선형 필 라 멘 트 (PHFs) 광고의 두뇌에서 격리를 사용 하 여 얻은 했다 환자입니다. 우리 타우 집계 준수 플라스틱이 나 유리 표면에 의해 발생 했을 수 있습니다 어떤 예기치 않은 결과 관찰 하지 않았다, 그러나 안정적이 고 잘 특징이 타우 집계를 사용 하 여가 분석이 결과의 재현성에 중요 한 역할을 했다.
또 다른 측면을 크게 시험의 재현성은 셀 밀도. 프로토콜에서 설명 잘 당 셀의 숫자 설명된 조건에서 최적의 셀 밀도를 나타냅니다.
다르게 무엇 보다 펑크 외. 11 설명, 우리가 분류는 크게 산 성 세포에서 국제화에는 형광 증가 pH 민감한 염료와 타우 집계 되므로 세포내 정량화에 대 한. 이, 표면의 트립 신 소화 함께 immunocomplexes 및 타우, 보장 그 형광 신호 측정 cytometry 타우 이해 보다는 세포 표면에 바인딩의 결과 이다. 또한, pH 민감한 염료 부드럽게 표면 소화의 필요성 없이 현미경 실험에서 내 면된 타우의 탐지 바인딩된 다음 것이 immunocomplexes/타우 집계를 사용 하 여 셀이 다시 도금 및 복구 필요 합니다.
우리는 또한 더 설명된11했던 이전에 비해, 우리의 분석 결과의 현미경 읽기 최적화, 산 성 세포는 안 봐도 우리의 현미경 실험에 대 한 매우 선택적인 염료를 사용 하 여 확인 하는 유일한 항 체-중재 타우 통풍 관, 아니라 endolysosomal 구획에 타우의 지역화.
우리가 개발 하 고, 분석 결과 긍정적이 고 부정적인 샘플 사이 강한 별거를 허용 하는 좋은 실험 창 최적의 특이성이 있다. 흥미롭게도, 분석 결과 직접 감지 하지 따라서 안티 타우 항 체 효과 기 기능을 공부 하는 강력한 도구를 대표 하는 항 체 선호도에 차이.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그의 귀중 한 기술 지원을 알베르토 Carpinteiro Soares 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 10010-015 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| DMEM 4.5 g/dL glucose | Gibco | 41966-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
| pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
| Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
| PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
| Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
| Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
| BSA | Sigma | A7030-100G | |
| EDTA 0.5 M, pH8 | |||
| FACS Canto II | BD | ||
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
| Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |
References
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