Summary
Här presenteras ett protokoll för den snabba oförstörande screeningen av bomulls genotyper för reniform nematodresistens. Protokollet innebär visuellt undersöka rötterna av Nematoden-infekterade bomullsplantor för att avgöra infektions svaret. Vegetativt skott från varje planta sprids sedan för att återvinna växter för fröproduktion.
Abstract
En snabb icke-förstörande reniform Nematoden (Rotylenchulus reniformis) screening protokoll behövs för utveckling av resistenta bomull (Gossypium hirsutum) sorter för att förbättra Nematoden förvaltning. De flesta protokoll innebär att utvinna MASKFORMIG nematoder eller ägg från bomull rotsystemet eller krukväxtjord för att bestämma befolkningstäthet eller reproduktionstakt. Dessa tillvägagångssätt är i allmänhet tidskrävande med ett litet antal genotyper utvärderas. En alternativ metod beskrivs här där rotsystemet granskas visuellt för nematodinfektion. Protokollet innebär inokulering av bomullsplantor 7 dagar efter plantering med MASKFORMIG nematoder och bestämning av antalet honor som är knutna till rotsystemet 28 dagar efter inympning. Data uttrycks som antalet honor per gram färsk rot vikt att justera för variation i rottillväxt. Protokollet ger en utmärkt metod för att utvärdera värd-Plant resistens i samband med förmågan hos Nematoden att etablera en infektions plats; emellertid, resistens som hindrar Nematoden reproduktion bedöms inte. Som med andra screening protokoll, variation observeras vanligen i nematodinfektion bland enskilda genotyper inom och mellan experiment. Data presenteras för att illustrera det variationsintervall som observeras med hjälp av protokollet. För att justera för denna variation, kontroll genotyper ingår i experiment. Icke desto mindre, protokollet ger en enkel och snabb metod för att utvärdera värd-Plant motstånd. Protokollet har använts framgångsrikt för att identifiera resistenta anslutningar från G. Arboretum arvsmassa insamling och utvärdera segregerande populationer av mer än 300 individer att bestämma genetik av resistens. En vegetativt förökningsmetod för att återvinna växter för resistens avel utvecklades också. Efter avlägsnande av rotsystemet för Nematoden utvärdering, vegetativt shoot omplanteras för att möjliggöra utveckling av ett nytt rotsystem. Mer än 95% av skotten utvecklar vanligtvis ett nytt rotsystem med växter som når mognad.
Introduction
Mer från Rotylenchulus reniformis (Linford och Oliveira), vanligen kallad reniform Nematoden, är en av de stora parasitiska Nematoden arter som finns i jordar av sydöstra USA1,2,3. Nematoden är en obligate, stillasittande semi-endoparasiten som kräver en värd växt för att avsluta dess livscykel2,4. Vermiform preadult kvinnlig nematoder penetrera värd rotsystem för att etablera en utfodring plats i stele2,3. Som Nematoden feeds och mognar, den bakre delen kvar utanför värd roten kommer att svälla på äggproduktion, bildar en karakteristisk njure form (figur 1). Rotylenchulus reniformis kan utfodra på rotsystemet av mer än 300 växtarter, inklusive bomull4. Upland bomull (Gossypium hirsutum L.) odlas allmänt i sydöstra USA, men avsaknaden av R. reniformis resistenta sorter hindrar Nematoden Management2,3. Förvaltningsstrategier som nematicid behandling och rotation med icke-värd gröda arter har använts för att minska mark R. reniformis befolkningstäthet5,6, men utsäde bomull avkastning förluster kan vanligen variera från 1 till 5%2. Symtom på R. reniformis infektion kan omfatta växten dvärgväxt, undertryckt rottillväxt, näringsbrist, frukt abort, och fördröjd mognad2. Emellertid, symtomen kan inte vara uppenbara på grund av enhetlighet av symtom över fältet; Därför bör metoder för att bedöma R. reniformis infektion behövs för att identifiera och utveckla resistenta Upland bomull sorter. Utvärdering av R. reniformis motstånd i bomull anses svårt7, eftersom det infekterade rotsystemet kan tyckas normalt även om anläggningen kan visa symtom på infektion8.
Ett effektivt protokoll för Nematoden screening krävs för identifiering av R. reniformis resistenta anslutningar från bomull arvsmassa insamling, och för bestämning av resistens genetik för dessa anslutningar. Ett sådant protokoll kommer att hjälpa till med överföring av resistensgener till Upland bomull. Olika bioassay metoder har använts för att bedöma R. reniformis infektion i bomull8,9,10,11,12,13,14,15. I allmänhet har två viktiga metoder använts för att identifiera R. reniformis resistenta bomulls genotyper. Den mest använda metoden innebär att utvinna ägg och/eller MASKFORMIG nematoder från smittade växter eller mark8,11,12,14,15. Den allmänna metoden för detta tillvägagångssätt innebär plantering frön för enskilda bomull genotyper i separata krukor, så att plantorna att utveckla för 7 till 14 dagar, vaccinera plantorna genom att lägga till en blandning av MASKFORMIG stadier av R. reniformis till marken, och låta nematoder att infektera rotsystemet för 30 till 60 dagar. Därefter utvinns MASKFORMIG nematoder och/eller ägg från den infekterade rotsystem av varje planta eller från krukväxtjord. Antalet extraherade nematoder eller ägg bestäms sedan för att uppskatta befolkningstätheten och reproduktions graden, som jämförs med kontroll genotyper för att identifiera resistenta genotyper.
Ett alternativt tillvägagångssätt, som beskrivs här, innebär mikroskopiskt undersöker bomull rotsystem som har smittats med nematoder att bestämma antalet kvinnliga nematoder parasitera rötterna10,16. I likhet med andra metoder, är bomull genotyper planterade i separata krukor och inokuleras med MASKFORMIG nematoder cirka 7 dagar efter plantering. Inom 30 dagar efter inympning avlägsnas rotsystemet från enskilda plantor och jorden sköljs från rötterna. Därefter är nematoder bifogas rotsystemet färgas med röd karamellfärg17, och rötter mikroskopiskt undersökas för att fastställa antalet infektions platser med resistenta genotyper bomull (identifierad baserat på antalet nematoder per gram av roten) jämfört med en känslig kontroll16. Den andra metoden har fördelen att öka genomströmningen genom att minska antalet dagar som krävs för utvärdering och öka antalet enskilda genotyper utvärderas i ett enda experiment. Screening metoder som utvärderar befolkningstäthet eller reproduktionsfrekvens är ofta mer tidskrävande än de som baseras på visuella observationer av infektions tecken7. En begränsning av detta tillvägagångssätt är dock att värd-växt-resistens som hindrar Nematoden reproduktion som bestäms av äggproduktion inte bedöms13.
Screening protokoll för R. reniformis motstånd förstör ofta rotsystemet under utvärderingen7 och involvera vegetativt skjuta kasseras. För att övervinna denna begränsning har en vegetativt förökningsmetod utvecklats för att möjliggöra återvinning av växter för produktion av utsäde18. Efter avlägsnande av rotsystemet för Nematoden utvärdering, vegetativt skjuta planteras i krukväxtjord för att låta rotsystemet att återföds ständigt. Denna metod har breda tillämpningar för de flesta R. reniformis screening protokoll. En enkel och snabb metod för vegetativ förökning är av avgörande betydelse för avel R. reniformis resistenta Upland bomulls sorter, där återhämtningen av avkomman krävs för att främja resistenta genotyper till nästa generation.
Ett protokoll presenteras för storskalig screening av bomulls genotyper för reniform nematodresistens. Målet är att utveckla en enkel och snabb oförstörande screeningmetod för att utvärdera bomull häckande populationer för Nematoden motstånd för att underlätta uppfödning av resistenta Upland bomull sorter. Med detta protokoll, data erhålls vanligtvis inom 35 dagar, med mer än 300 genotyper utvärderas i ett enda experiment. Data presenteras för resistenta och mottagliga genotyper för att illustrera den variation som vanligen observeras med dessa metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. upprätthålla en källa till R. reniformis Inokulum
- Fyll Terra Cotta lerkrukor (15 cm i diameter, 13,5 cm i höjd) med en ånga pastöriserad blandning av 1-del Sandy loam och 2-delar sand. Plantera en mottaglig tomat (Solanum Lycopersicon) sort i varje kruka och placera krukor i ett växthus.
Anmärkning: andra mottagliga växtsorter som bomull kan användas i stället för tomat. - Inokulera tomatplantor med MASKFORMIG reniform nematoder (se steg 3,3). Underhålla växterna i Glasshouse vid en temperatur av ungefärligt 28 ° c.
2. plantering av genotyper av bomull för R. reniformis Utvärdering av resistens
- Förbered jorden genom att kombinera 2-delar fin sand med 1-del Sandy loam samlats in från fältet.
- Ångpastörisera jordblandningen för att säkerställa att jorden är fri från nematoder och jordburna växtpatogener.
- Tillsätt jordblandningen till koniska plastkrukor (4 cm i diameter, 21 cm i höjd). Innan du fyller potterna, placera en boll av bomull i botten av potten för att förhindra jord förlust. Delvis fylla krukor med jord ca 2 cm från toppen.
- Förbered en plastinsats för varje kruka för att utse den genotyp som ska planteras.
- Växtfrön av de bomulls genotyper som valts ut för utvärdering.
- Plantera ett enda frö i varje kruka för utvärdering av segregering populationer, där varje utsäde representerar en unik genotyp.
- För bomull sorter eller arvsmassa anslutningar, växt 2 till 3 frön i en enda kruka för att försäkra grobarheten av minst en planta med andra plantor bort från krukor före Nematoden inympning.
Obs: Alternativt kan frön grodd för 24 till 72 h före plantering för att minimera antalet krukor med icke-livskraftiga frön.
- Växtfrön av utvalda resistenta och mottagliga kontroll genotyper.
Anmärkning: kontroll genotyper replikeras 5 till 10 gånger för att bedöma naturliga variationer i screening metodiken. - Fyll krukor med ytterligare jord för att täcka fröet i varje kruka.
- Placera krukorna i tillväxt kammaren. Bibehålla en konstant temperatur på 28 ° c, en omgivningstemperatur, för tillväxt kammaren. Ge artificiell belysning med en blandning av lysrör och glödlampor med en 16 h fotoperiod.
- Placera vatten sändare i varje kruka och vattna potterna två gånger per dag med hjälp av ett automatiskt bevattningssystem. Justera bevattningssystemet för att leverera ytterligare vatten som växten växer.
3. nematodympning av bomullsplantor och beredning av Rotprover
- Extrahera MASKFORMIG reniform nematoder upprätthålls på mottagliga tomatplantor (se steg 1) med hjälp av elutriation19 och centrifugal flotation20 metoder dagen före inympning. Förvara de extraherade nematoder vid 4 ° c.
Anmärkning: Baermann Funnel extraktion21 är en alternativ metod för Nematoden extraktion. - Bestäm antalet nematoder som extraheras genom att räkna antalet nematoder i ett subprov på 100 μL och Bered en suspension av 1 000 nematoder/mL i kranvatten för vaccinationer.
- Inokulera bomulls plantorna 7 d efter plantering med nematodsus pensionen. Skapa en liten depression i marken bredvid växten, och Pipettera 1 mL av reniform Nematoden suspensionen i depression.
- Ta bort plantor från krukor 28 d efter inympning för Nematoden utvärdering.
Obs: i detta skede, växter är cirka 15 cm hög med 4 till 6 helt expanderad blad.- Ta bort de flesta av de helt expanderade bladen från växterna med hjälp av sax innan du tar bort växterna från krukorna.
- För att ta bort växter från krukor, pressa potten och skjut jorden ut i handen.
- Ta försiktigt bort jorden från rötterna genom att agitera rotsystemet i kranvatten i en 10 L behållare. Skölj rotsystemet en kort stund i en behållare med rent kranvatten.
- Ta bort rotsystemet från växten ca 1 cm under jord linjen med hjälp av saxar.
- Placera rotsystemet i en 120 mL plast, icke-steril, disponibel provbehållare tillsammans med plastinsatsen från potten används för identifiering.
Obs: flera prover bearbetas innan du fortsätter till steg 3,7. Fortsätt till steg 4 för vegetativt förökning av anläggningen shoot. - Förbered en 12,5% (v/v) lösning av röd karamellfärg17 i kranvatten för att färga nematoder bifogas rotsystemet.
- Tillsätt cirka 30 mL av den röda mat färglösningen till rot provet i preparatbehållaren för att helt täcka rotsystemet.
- Placera preparatbehållaren i en mikrovågsugn och värm rot provet tills infärgnings lösningen börjar koka. Ta bort provet från mikrovågsugnen och låt provet svalna i rumstemperatur.
- Dekanera den röda mat färglösningen från rot provet och tillsätt ca 100 mL kranvatten till preparatbehållaren för att avlägsna överflödig fläck. Placera locket på preparatbehållaren och förvara provet i kylskåp vid 4 ° c. Gå vidare till steg 5 för utvärdering av rot infektion.
Obs: protokollet kan pausas här innan du fortsätter till steg 5.
4. vegetativ förökning för att återvinna växter för utsädesproduktion
- Placera en bomullstuss i botten av en konisk plastkruka (se steg 2,3) och fyll delvis potten med torv mossa. Sedan placera vegetativt skjuta i potten och stadigt lägga kruk växt media att fylla potten. Placera en ny märkt plaststav i varje kruka för att utse bomull genotyp.
- Placera brickan av krukor i en plastbehållare (73,6 cm längd x 45,7 cm Bredd x 15,2 cm höjd) med vatten och kort vattenväxterna för att fukta kruk växt media. Placera krukorna i en tillväxt kammare med en konstant temperatur på 28 ° c med en fotoperiod på 16 timmar. Tillsätt ytterligare vatten till plast behållaren som behövs för att bibehålla markens fuktighet.
- Transplantera växterna till större krukor för fröproduktion efter ca 30 d. delvis fylla en 6 L plastkruka med kruk material (se steg 4,1), ta bort växten från den lilla potten, placera växten i 6 L potten, och stadigt lägga kruk material för att fylla potten.
- Placera växterna i ett växthus och tillsätt vatten för att fukta kruk växt media. Håll temperaturen i Glasshouse vid ca 28 ° c (artificiell belysning krävs inte).
- Vattenväxter för hand som behövs för ca 30 d.
- När cirka 75% av växterna kräver dagliga vattning, vattenväxter dagligen med hjälp av ett automatiskt bevattningssystem. Justera det automatiska bevattningssystemet till vatten oftare vid behov för växternas tillväxt.
- Tillsätt cirka 10 g av en långsam frisättning gödselmedel till varje pott innan början av blom initiering.
- Skörda plantor på förfallodagen och bearbeta bomullsfrö proverna för att få frön för vidare utvärdering.
- För att skörda bomullsfrö, ta bort bomullen från den öppna frökapslar på fabriken för hand och placera den i en märkt papperspåse. Fröna fästas till bomullsfibrerna, som tas bort i efter kliver.
- Ta bort luddfibrer från utsädesproverna med hjälp av en 10-SAW laboratorium gin.
- Ta bort fuzz fibrer från utsädesproverna med koncentrerad svavelsyra. Neutralisera frö prov i en 15% (v/v) lösning av natriumkarbonat, skölj proverna med kranvatten, och torka proverna i en forcerad luft torrare.
- Placera utsädesproverna i märkta kuvert för förvaring.
5. utvärdering av R. reniformis Rot infektion
- Ta bort rot provet från preparatbehållaren och räkna antalet kvinnliga nematoder som är fästa vid rotsystemet med hjälp av ett stereomikroskop (20X förstoring).
Anmärkning: endast kvinnliga reniform nematoder kan infektera växternas rötter. - Placera rotsystemet på pappershanddukar i ca 10 min för att ta bort överflödig fukt. Väg rotsystemet för att bestämma den färska roten vikt.
- Ange Nematoden räkna och färsk rot vikt data i en dator kalkylprogram och beräkna antalet honor per gram root.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rotylenchulus reniformis -infektion i rotsystemet för två sorter presenteras i figur 1. Relativt färre kvinnliga reniform nematoder kan etablera en utfodring plats för resistenta bomull genotyp jämfört med mottagliga genotyp. Variation i rottillväxt är vanligt mellan anslutningar, vilket illustreras i figur 2. Denna variation mätt med färsk rot vikt kan också observeras mellan växter med samma genotyp (tabell 1). Gossypium Arboretum genotyper visar ofta lägre rottillväxt takt än Upland bomull genotyper. För att kompensera för denna variation samlas data in på färska rot vikter, som används för att beräkna antalet kvinnliga reniform Nematoden per gram rot vävnad för varje genotyp. Antalet kvinnliga reniform nematoder per gram rot för resistenta genotyper är i allmänhet mindre än 10, medan mottagliga genotyper typiskt har mer än 30 nematoder per gram rot.
En utmaning för screening av bomulls genotyper för R. reniformis resistens är den potentiella variation som kan förekomma inom och mellan experiment. För att utvärdera och justera för denna variation, resistenta och mottagliga genotyper bomull ingår som kontroller och replikeras i varje experiment. Tabell 1 visar data för två genotyper som används som kontroller i två separata experiment med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan. Genotyperna replikeras 10 gånger och inokulerades 7 dagar efter plantering med 1 000 MASKFORMIG nematoder, då rotsystem skördades 28 dagar efter inympning att räkna nematoder bifogas rötterna. Eftersom experimenten utfördes vid olika tidpunkter var källan till de nematoder som användes för vaccinationer annorlunda. annars var alla andra parametrar likartade. Dessa data illustrerar variationen som kan observeras i reniform Nematoden utvärderingar. Antalet kvinnliga nematoder och rot vikter var högre i experiment 1 för de två kontrollerna jämfört med experiment 2, vilket resulterade i ett högre antal honor per gram rot för experiment 1. Eftersom de kvinnliga grevarna var betydligt högre för experiment 1, ökade inte ökningen av rot vikter antalet honor per gram rot till de nivåer som observerats för experiment 2. Betydande variation mellan replikationer av enskilda genotyper observerades också. Emellertid, den resistenta G. Arboretum genotyp PI 615699 visade ofta betydligt lägre kvinnliga antal och lägre antal honor per gram rot än den mottagliga G. hirsutum genotyp PI 529251. Genotyperna kan lätt klassificeras som resistenta eller mottagliga när dessa medel används för jämförelse. Genotyper klassificeras som resistenta när antalet honor per gram rot är cirka 10% av den mottagliga kontrollen.
En delmängd av data från en segregerande F2 -population som utvärderades med hjälp av protokollet visas i tabell 2. Populationen inkluderade 300 F2 plantor och data för 50 plantor som representerar utbredningsområdet presenteras. För populationen av 300 plantor varierade antalet observerade nematoder som infekterar rotsystemen från 0 till 50, med ett medelvärde på 9,4. Rot vikter varierade från 0,01 till 1,22 g, med ett medelvärde på 0,38 g. kvinnliga nematoder per gram rot varierade från 0-400, med ett medelvärde på 33,6. Föräldrarna replikerades i utvärderingen. Den resistenta föräldern (PI 417895) visade ett medelvärde på 5,8 honor per gram rot, med en genomsnittlig rot vikt på 0,8 g; Däremot visade den mottagliga föräldern (PI 529729) ett medelvärde på 40,8 honor per gram rot, med en genomsnittlig rot vikt på 0,35 g. tjugo plantor visade ingen nematodinfektion och klassificerades som resistenta, men detta kan representera rymningar. Både dessa växter och växter med dålig rottillväxt är vanligtvis bort från dataanalys. Detta intervall i variation för rottillväxt och nematodinfektion i rotsystem observeras vanligen för Nematoden utvärderingar; Sålunda, förmågan att avskärma ett stort antal växter i ett enda experiment kan minimera denna variation och möjliggöra en noggrann bedömning av genetik av resistens. Populationen visade kvantitativ variation för nematodinfektion, och växter klassificerades som resistenta baserat på data från den mottagliga föräldern, vilket tydde på att resistens förlänades av två recessiva gener för denna population. Dessutom användes det vegetativa föröknings protokoll som beskrivits ovan framgångsrikt för att återvinna växter från denna population. Klassificeringen av f3 -avkomman som härrör från enskilda f2 -anläggningar motsvarade ofta klassificeringen av f2 -anläggningen.
Figur 1: rotylenchulus reniformis infekterade rotprover. Roten provet från en resistent bomull genotyp (nedre vänstra) visar en enda kvinnlig nematod fäst vid roten, medan mottagliga genotyp (övre högra) visar flera kvinnor som är knutna till roten. Den svarta stapeln motsvarar en 0,1 mm skala. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Variation som observerats i rottillväxt för två genotyper av bomull. Rotsystem för två reniform Nematoden resistenta G. Arboretum har anslutningar presenteras för att illustrera den variation som kan observeras för rottillväxt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: variation som observerats vid nematodinfektionsrespons i reniform för två genotyper av bomull som ingår som kontroller. Dessa data illustrerar variationen som kan förekomma inom och mellan experiment för den mottagliga g. hirsutum genotyp PI 529251 och resistent g. Arboretum genotyp PI 615699; Datamedel var dock signifikant olika, vilket gör att genotyperna lätt kan klassificeras som resistenta eller mottagliga.
| Genotyp beteckning | Kvinnor | Rotvikt (g) | Honor/g-rot | Klassificering |
| 88 | 0 | 0,67 | 0,0 | Resistenta |
| 156 | 0 | 0,10 | 0,0 | Resistenta |
| 75 | 2 | 1,05 | 1,9 | Resistenta |
| 298 | 2 | 0,58 | 3,4 | Resistenta |
| 259 | 3 | 0,77 | 3,9 | Resistenta |
| 208 | 1 | 0,21 | 4,8 | Resistenta |
| 322 | 4 | 0,82 | 4,9 | Resistenta |
| 189 | 2 | 0,35 | 5,7 | Resistenta |
| 147 | 6 | 0,94 | 6,4 | Resistenta |
| 267 | 2 | 0,18 | 11,1 | Måttligt motståndskraftig |
| 198 | 5 | 0,43 | 11,6 | Måttligt motståndskraftig |
| 251 | 2 | 0,17 | 11,8 | Måttligt motståndskraftig |
| 95 | 6 | 0,46 | 13,0 | Måttligt motståndskraftig |
| 248 | 3 | 0,23 | 13,0 | Måttligt motståndskraftig |
| 79 | 11 | 0,84 | 13,1 | Måttligt motståndskraftig |
| 340 | 4 | 0,29 | 13,8 | Måttligt motståndskraftig |
| 114 | 9 | 0,64 | 14,1 | Måttligt motståndskraftig |
| 168 | 6 | 0,40 | 15,0 | Måttligt motståndskraftig |
| 117 | 7 | 0,44 | 15,9 | Måttligt motståndskraftig |
| 77 | 10 | 0,57 | 17,5 | Måttligt motståndskraftig |
| 277 | 9 | 0,44 | 20,5 | Måttligt motståndskraftig |
| 47 | 8 | 0,34 | 23,5 | Måttligt mottagliga |
| 96 | 20 | 0,85 | 23,5 | Måttligt mottagliga |
| 139 | 15 | 0,60 | 25,0 | Måttligt mottagliga |
| 253 | 2 | 0,08 | 25,0 | Måttligt mottagliga |
| 247 | 15 | 0,53 | 28,3 | Måttligt mottagliga |
| 308 | 8 | 0,28 | 28,6 | Måttligt mottagliga |
| 152 | 9 | 0,31 | 29,0 | Måttligt mottagliga |
| 123 | 8 | 0,26 | 30,8 | Måttligt mottagliga |
| 296 | 18 | 0,58 | 31,0 | Måttligt mottagliga |
| 138 | 10 | 0,31 | 32,3 | Måttligt mottagliga |
| 151 | 5 | 0,15 | 33,3 | Måttligt mottagliga |
| 102 | 31 | 0,77 | 40,3 | Måttligt mottagliga |
| 67 | 5 | 0,12 | 41,7 | Mottagliga |
| 51 | 18 | 0,43 | 41,9 | Mottagliga |
| 311 | 21 | 0,48 | 43,8 | Mottagliga |
| 334 | 4 | 0,09 | 44,4 | Mottagliga |
| 266 | 33 | 0,74 | 44,6 | Mottagliga |
| 260 | 7 | 0,14 | 50,0 | Mottagliga |
| 49 | 16 | 0,32 | 50,0 | Mottagliga |
| 149 | 20 | 0,39 | 51,3 | Mottagliga |
| 104 | 22 | 0,34 | 64,7 | Mottagliga |
| 238 | 39 | 0,57 | 68,4 | Mottagliga |
| 144 | 24 | 0,33 | 72,7 | Mottagliga |
| 225 | 24 | 0,30 | 80,0 | Mottagliga |
| 87 | 38 | 0,43 | 88,4 | Mottagliga |
| 126 | 50 | 0,51 | 98,0 | Mottagliga |
| 272 | 3 | 0,03 | 100,0 | Mottagliga |
| 154 | 24 | 0,12 | 200,0 | Mottagliga |
| 286 | 3 | 0,01 | 300,0 | Mottagliga |
Tabell 2: svar på reniform nematodinfektion observerades i en delmängd av 50 genotyper från en G. Arboretum F2 population. Dessa data illustrerar variationsintervallet som kan observeras för segregerande populationer. Rot vikter, nematodantal och antal honor per gram rot presenteras för varje genotyp, med växter som klassificeras som resistenta, måttligt resistenta, måttligt mottagliga, eller mottagliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett effektivt screening protokoll krävs för 1) identifiering av R. reniformis resistenta bomull genotyper för att utvärdera genetik av resistens och 2) uppfödning av resistenta sorter. De flesta protokoll bedömer R. reniformis befolkningstäthet eller reproduktions frekvenser genom att utvinna MASKFORMIG nematoder eller ägg från bomulls rotsystemet eller krukväxtjord8,11,12,14,15 . Dessa metoder är ofta mer tidskrävande och resultaten tenderar att vara mer varierade inom och mellan experiment. Dessutom kan genotyper av bomull oftare klassificeras i icke-replikerade växthus experiment med hjälp av dessa protokoll11. Liknande resultat kan dock uppnås för de olika protokollen eller parametrarna som utvärderas9,13.
Ett alternativt screening protokoll presenteras i vilket screening av genotyper av bomull utförs genom att man bedömer antalet kvinnliga reniform-nematoder som parasiserar på rotsystemet. Resistenta och mottagliga genotyper av bomull kan initialt Visa ett liknande antal kvinnliga nematoder som tränger in i rotsystemen inom 16 timmar efter inokuleringen, men inom 36 timmar börjar resistenta genotyper att Visa signifikant färre bifogade nematoder och Nematoden utveckling hindras9. Således ger detta screening protokoll ett mer direkt mått på nematodinfektion i bomulls rotsystemet jämfört med protokoll som förlitar sig på utvinning av nematoder eller ägg från rotsystemet eller krukväxtjord. Metoden för ympning av bomullsplantor med MASKFORMIG nematoder är likartad bland metoderna. Vaccinationer utförs vanligtvis 7 till 14 dagar efter plantering, men tidpunkten för inympningen är mindre kritisk, eftersom frön kan också vara direkt planterade i reniform nematode-angripet jord. Vaccinationer utförs med hjälp av 1 000 MASKFORMIG nematoder, men protokollet kan ändras för att öka eller minska det antal som används för ympning, eller två vaccinationer kan utföras vid 7 och 14 dagar efter plantering för att försäkra tillräcklig kvinnliga nematoder är närvarande för rot infektion. I sojabönor hade antalet nematoder som användes för inympning ingen signifikant effekt på klassificeringen av äggmassan 21 dagar efter plantering. även om, högre betyg observerades vanligtvis vid högre Nematoden befolkningstäthet22. Protokollet kan optimeras för att bestämma den lägsta nematoddensiteten för inympning.
Nematodinfektion i rotsystemet bedöms 28 dagar efter inympning för detta protokoll, vilket är i allmänhet tidigare än i andra protokoll. Detta är ett kritiskt steg i protokollet, eftersom bedömningar görs innan ägg kläckas. En betydande fördröjning i skörd rotprover kan resultera i en andra omgång av infektion. Denna tidigare utvärdering har dock fördelen av att öka genomströmningen. För det presenterade protokollet, är bomull genotyper planterade i en blandning av sand och jord, vilket är avgörande för den enkla och snabba avlägsnande av rotsystemet från potten. Användning av ett automatiskt bevattningssystem är viktigt när man använder små krukor med en sand-och jord blandning för att förhindra att krukorna torkar ut. Röd karamellfärg används för att färga nematoder knutna till rotsystemet, vilket är en enkel och säker metod17. När rotsystemen är färgade kan de lagras i kranvatten vid 4 ° c innan de räknar antalet nematoder som är fästa vid rotsystemet. Således kan ett större antal av olika typer av bomull utvärderas i ett enda experiment, eftersom ingen ytterligare bearbetning av proverna krävs innan bedömningen av Nematoden räknas. Det är också fördelaktigt att lagra rotproverna i kranvatten i flera dagar, vilket gör att rötterna att de-fläcken, vilket gör att räkna lättare.
Det beskrivna protokollet möjliggör screening av större populationer för att minska den miljö variation som sker mellan försöken. Med hjälp av en 900 m2 planttillväxt kammare utrustad med ett automatiskt bevattningssystem, populationer av 480 enskilda växter kan utvärderas. Protokollet har framgångsrikt använts för att utvärdera segregerande populationer av 300 eller fler individer för att karakterisera genetiken av resistens10,18. Dessa populationer visade att kvantitativ variation för nematodinfektion och resistens i G. Arboretum kan oftare förknippas med flera recessiva gener; Därför krävs större populationer för genetiska studier. Dessutom, kvantitativ variation observeras i segregering populationer, oavsett det protokoll som används, att utvärdera Nematoden infektions svar.
Host-Plant resistens i bomull kan hindra Nematoden förmåga att infektera rotsystemet och etablera en utfodringsställe, men det kan också påverka fortplantningsförmågan hos Nematoden. Det screening protokoll som beskrivs utvärderar antalet nematoder som kan etablera en utfodringsställe på bomulls rotsystemet. Reproduktion av nematode mätt som äggproduktion bedömdes inte i detta protokoll, vilket är en viktig begränsning. Protokollet kan dock ändras för att samla in den här typen av data. Alternativt kan andra metoder användas för att samla in dessa data efter resistenta genotyper har identifierats, vilket minskar behovet av att skärmen ett stort antal individer.
Data från Nematoden utvärderingar av enskilda genotyper kan variera inom och mellan experiment, vilket är ett vanligt problem med alla screening protokoll som används för att bedöma R. reniformis -resistens för genotyper av bomull. Användningen av en experimentell design med multipla replikeringar för screening av arvsmassa anslutningar kommer att hjälpa till att bedöma denna variation för identifiering av resistenta genotyper. Dessutom, inklusive samma resistenta och mottagliga kontroll genotyper mellan experiment är till hjälp vid bedömningen av denna variation och jämföra resultaten från flera experiment. Dessa kontroller används också för att övervaka framgången av Nematoden inympning. Dessutom används data från dessa kontroller för att klassificera genotyper som resistenta eller mottagliga10,16. Genotyper av bomull klassificeras vanligen som resistenta om de uppvisar mindre än 10% av den infektion som observerats på den mottagliga kontrollen16,23. Rottillväxt är en annan faktor som bidrar till den variation som observerats i data med hjälp av protokollet, eftersom växter som har en kran rot med färre laterala rötter erbjuder mindre platser för infektion, vilket kan resultera i färre nematoder per gram rot.
Svårigheten att utveckla nya Upland bomulls sorter med hjälp av andra bomulls arter som en källa till resistens gener kräver ett vegetativt föröknings protokoll för att främja avel linjer till nästa generation för ytterligare urval eller ytterligare Avel. En enkel vegetativt förökning protokoll som beskrivs utvecklades för att återvinna växter efter Nematoden utvärdering. Protokollet har använts framgångsrikt för att återvinna växter från stora populationer18. Typiskt, rotsystemet återvinns inom 30 dagar efter vegetativt shoot planteras. Överlevnadstalen är ofta större än 95%. Växter som visar dålig kraft kan förloras när man sprider ett stort antal växter. I allmänhet, mindre än 1% av växterna misslyckats med att Visa rot eller skjuta tillväxt. Protokollet kan enkelt modifieras och användas med andra protokoll för Nematoden-screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Förenta staternas jordbruksdepartement, lantbruks forskningstjänst. Omnämnandet av handelsnamn och kommersiella produkter i denna artikel är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och inte innebär rekommendationer eller påskrifter av det amerikanska jordbruksdepartementet. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare. Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera. Tekniskt bistånd tillhandahölls av Kristi Jordan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
