Her, vi beskriver en metode til at rense intakt grønkorn fra Arabidopsis blade og deres tre vigtigste sub rum (kuvert, stroma og tylakoiderne), ved hjælp af en kombination af differentieret centrifugations, kontinuerlig Percoll forløb, og diskontinuerlig saccharose forløb. Metoden er værdifuld for subplastidial og subcellulært lokalisering af proteiner af immunoblotting og proteomics.
Kloroplaster er væsentlige bestanddele af planteceller. Sådanne plastids opfylde mange livsvigtige funktioner, som assimilation af kulstof, svovl og kvælstof samt syntese af væsentlige metabolitter. Disse organeller består af de følgende tre centrale sub rum. Kuvert, karakteriseret ved to membraner, omgiver organelle og styrer kommunikationen af plastid med andre celle rum. Stroma er den opløselige fase af chlorplasttransitpeptidsekvensen og de vigtigste site hvor kuldioxid er omdannet til kulhydrater. Tylakoid membran er den indre membran netværk bestående af grana (flad komprimeret sække) og lameller (mindre tætte strukturer), hvor iltdannende fotosyntese finder sted. Denne protokol beskriver trin for trin-procedurer, der kræves til rensning, ved hjælp af differentieret centrifugations og Percoll farveforløb, af intakt grønkorn fra Arabidopsisog deres fraktionering, ved hjælp af saccharose forløb, i tre sub rum (dvs. kuvert, stroma og tylakoiderne). Denne protokol giver også anvisninger på hvordan man skal vurdere renhedsgraden af disse fraktioner ved hjælp af datamærker forbundet til de forskellige grønkorn sub rum. Metoden beskrevet her er værdifuld for subplastidial lokalisering af proteiner ved hjælp af immunoblotting, men også subcellulært og subplastidial proteomics og andre undersøgelser.
Kloroplaster er væsentlige bestanddele af planteceller. De hidrører fra en cyanobakteriel forfader, der har undergået en endosymbiosis og til sidst udviklede sig som en organelle under udvikling1,2. Disse organeller indeholder tre hovedrum (figur 1). Kuvert system består af en indre og en ydre membraner omgiver organelle. Denne dobbelt membran system indeholder forskellige enzymer involveret i metaboliseringen af lipider og pigmenter og er for det meste afsat til kontrol af kommunikationen mellem plastids og cytosol. Det indeholder forskellige transportsystemer, der tillader import af nuklear-kodet proteiner, og udvekslingen af ioner og metabolitter mellem cytosol og chlorplasttransitpeptidsekvensen dermed regulerer væsentlige metaboliske funktioner af anlægget celle3,4 . Stroma, den opløselige fase af grønkorn, indeholder enzymer i Calvins cyklus (CO2 assimilation), syntese af forskellige metabolitter, herunder aminosyrer, vitaminer og plastid transskription og translation machineries. Tylakoid membran er et almindeligt organiseret indre membran netværk hvor den lette fase af fotosyntesen foregår. Dermed, er kloroplaster det sted, hvor væsentlige stofskifteveje forekomme5.
For at dechifrere nye reguleringsmekanismer, der styrer grønkorn dynamics og fysiologi, er definere de sub-plastidial lokalisering af grønkorn proteiner derfor kritisk at støtte målrettede undersøgelser med henblik på at bedre at forstå proteiner funktioner i model organismer6. For at få adgang til den ægte subplastidial lokalisering af disse proteiner, er det således vigtigt at starte fra yderst rene subplastidial fraktioner (kuvert membraner, stroma og tylakoiderne). I denne forbindelse formålet med denne protokol er at rense intakt grønkorn fra Arabidopsis blade ved hjælp af differentieret centrifugations og kontinuerlig Percoll forløb, og at fractionate dem ved hjælp af diskontinuert saccharose forløb, i tre sub rum (dvs. kuvert, stroma og tylakoiderne). Metoden beskrevet her indeholder også vejledning til vurdering af renheden af renset sub-organellar fraktioner ved hjælp af datamærker forbundet til de forskellige grønkorn sub rum. Denne protokol er værdifuld for subplastidial lokalisering af proteiner ved hjælp af immunoblotting og for yderligere analyse af renset fraktioner ved hjælp af massespektrometri (MS)-baseret proteom undersøgelser.
Denne artikel har til formål at detaljer trin for trin-protokol, der bruges til at rense grønkorn (og deres sub rum) fra Arabidopsis thaliana. Siden tilgængelighed af dens komplet genomet sekvens næsten to årtier siden, og store samlinger af indsættelse mutanter stilles til rådighed for Fællesskabet, er Arabidopsis nu almindeligt accepteret som en model plante. Men mens denne plante var perfekt tilpasset til genetiske metoder, plante forskere nødvendige for at tilpasse biokemiske og fysiologiske værktøjer til denne nye model. Protokoller gør det muligt for at rense photosynthetically aktive grønkorn fra bladene af veletablerede biokemiske modeller som spinat12 eller ært13 således skulle tilpasses. Den første metode beskriver rensning af Arabidopsis grønkorn blev offentliggjort i 199814, lige før udgivelsen af Arabidopsis genomet sekvens. Flere år senere, enkle metoder til isolering af Arabidopsis grønkorn kompatibel med undersøgelser med henblik på at analysere in vitro- import af proteiner i renset organeller blev gjort tilgængelige15,16. Men disse metoder ikke tillod for at kombinere høj renhed og bevarelse af fotosyntetiske aktivitet renset grønkornene. For nylig blev17, en hurtig metode etableret, som bygger på anvendelse af Percoll forløb, og gør det muligt for at bevare næsten 90% af fotosyntese målt i Arabidopsis begynder bladene.
Protokollen beskrevet her giver mulighed for at rense Arabidopsis grønkorn på et fremragende niveau af renhed. Faktisk, immunologiske påvisning af forurenende stoffer fra andre celle rum viste, at de renset organeller er blottet for mitokondrie og plasma membran markører9,10. Denne protokol blev også effektivt at rense grønkorn fra flere Arabidopsis økotyper18, som Columbia (Col) eller Wassilewskija (WS), dvs., de økotyper, der blev brugt til genom eller udtrykt sequence tags (interesser) sekventering projekter, men også til at generere T-DNA indsættelse mutanter i Arabidopsis. Med andre ord, når proteomics undersøgelser skal udføres, er i denne protokol kompatibel med disse to reference økotyper fra Arabidopsis. Endelig er udbyttet af grønkorn ved hjælp af denne protokol magen til det opnås, når start fra spinat eller ært blade (dvs. 3%, målt fra Percoll-renset chlorplasttransitpeptidsekvensen i forhold til samlet indhold af klorofyl klorofyl beløb i starter blade). Med hensyn til proteiner er udbyttet tæt på 50 mg af grønkorn proteiner, når organeller er renset fra 500 g af 5-uge-forhenværende Arabidopsis blade.
At nå frem til sådan en god udbytte (og grønkorn integritet), man bør dog være særlig opmærksom flere trin, når du bruger denne protokol. Grønkorn i Arabidopsis er en yderst skrøbelig struktur (dette ikke er tilfældet for pea grønkorn, for eksempel). Særlig opmærksomhed er dermed nødvendigt for at undgå store brud på organeller under rensningen. Antallet og størrelsen af stivelse granulat i kloroplaster er afgørende for forberedelsen af intakt grønkorn. Faktisk, grønkorn indeholdende store stivelse korn generelt bliver brudt under indledende differentieret centrifugations skridt med henblik på at koncentrere rå grønkorn fraktioner12. Derfor, bør planterne opbevares natten over i et mørkt og koldt værelse (4 ° C) før forsøget, at reducere mængden af stivelse.
Nye brugere af denne protokol kan blive fristet til at starte fra større mængder af blad materiale (store rosetter fra gamle Arabidopsis anlæg med større blade) forsøger at fremme genanvendelsen af renset grønkorn. Men i vores hænder, startende fra unge blade (5-uge-forhenværende) er det bedste kompromis at kombinere udbytte, renhed og integriteten af de oprensede organeller. Faktisk, for gamle blade er stærkt beriget i phenolforbindelser, der blev vist sig at have en negativ indvirkning på grønkorn integritet19.
Endelig, indledende ekstraktionstrinet (slibning af væv) er en anden afgørende skridt. Blending processen skal være begrænset til par sekunder. Som anført ovenfor, kunne nye brugere fristes til at bruge længere blanding, således forventer at kraftigt forbedre udbyttet af renset organeller. Hvis længere blanding effektivt frigiver mere materiale fra blade, synes det imidlertid at andelen af knækkede grønkorn hurtigt øger i rå celle ekstrakt. På grund af denne høj forholdet mellem brudt til intakt kloroplaster i medium, yderligere rensning trin (adskillelse på Percoll forløb) påvirkes kraftigt og udbyttet af rensning er uventet lavere.
Tilgængeligheden af specifikke protokoller til at rense organeller har tilladt en serie af høj overførselshastighed proteomics-baserede eksperimenter skal gennemføres på grønkorn prøver. Disse data blev stillet til rådighed i flere offentlige databaser6, hvilket giver at biologer i feltet en nøjagtig subcellulært (og subplastidial) lokalisering for mange grønkorn proteiner. Dette var især tilfældet for kuvert proteiner hvis identitet og placering forblev for det meste ukendte før disse analyser, da kuverten membraner repræsenterer en mindre grønkorn komponent (1-2% af proteinerne, grønkorn) mens du spiller en nøglerolle i grønkornets stofskifte og Biogenese5,20. Ved hjælp af protokollen beskrevet her, vi for nylig analyseret sammensætningen af de tre vigtigste grønkorn rum fra Arabidopsis (dvs. stroma, tylakoiderne og kuvert membran system)9. Baseret på en semi-kvantitative proteomics tilgang (spektrale tælle), har vi kunnet vurdere partitionering af hundredvis af proteiner i disse tre grønkorn rum.
Mens denne protokol giver mulighed for at rense de tre vigtigste rum af chlorplasttransitpeptidsekvensen fra Arabidopsis, er det også muligt at skelne yderligere sub rum i chlorplasttransitpeptidsekvensen. Faktisk, kuvert membran system er lavet af indre og de ydre konvolut membraner (figur 1). Til bedste af vores viden er en metode til at rense indre og ydre konvolut membraner fra Arabidopsis grønkorn imidlertid fastsættes. Indre og ydre konvolut membraner kan blive renset fra spinat21 eller ært22 grønkorn. Den største begrænsning af Arabidopsis resultater for det meste fra de begrænsende beløb for at starte materiale. Start fra 500 g Arabidopsis blade (som allerede kræver 1 m2 overflade i et vækst kammer) giver mulighed for rensning kun 100 µg kuvert proteiner. På den anden side er det let at starte med, 5-10 kg af spinat blade fra markedet, at rense store mængder af grønkorn8 og ender med et udbytte på 3 til 10 mg af kuvert proteiner fra dette materiale.
Det samme gælder for tylakoid sub rum. Faktisk tylakoiderne er lavet af lys membran vesikler (lamellae) og tætte strukturer (grana) (figur 1). Særlige protokoller er tilgængelige til at skelne mellem disse to rum i Arabidopsis23,24. Igen, baseret på en kvantitativ proteomics analyser, vi for nylig fortegnelserne proteiner til stede i disse to sub rum24. Disse tilgange, sammen med en grundig undersøgelse af litteraturen, tilladt validering, eller foreslår hypoteser for subplastidial placeringen af hundredvis af tylakoid proteiner. Det er dog vigtigt at bemærke, at yderligere membran microdomains er til stede på de buede kanter af tylakoiderne. Disse lipoprotein sub rum, eller plastoglobules, er permanent tilkoblet tylakoid membraner og indeholder et bestemt sæt af proteiner25. Ved hjælp af denne protokol, er det således ikke muligt at skelne disse specifikke proteiner fra andre tylakoid komponenter.
Nogle ægte (kendte) kuvert, stroma eller tylakoid komponenter mangler stadig fra listerne over registrerede proteiner. Samt målrettede biokemiske og immunologiske analyser, vil den løbende forbedring af MS følsomhed være til stor hjælp at gense grønkorn indhold mod et komplet repertoire af sammensætningen af dens forskellige sub rum.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en fælles ph.d.-stipendium til IB fra INRA plantebiologi og avl Division og Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Vi ønsker også at anerkende projektets Musikvogn ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) for antistoffer mod LHCP og Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) for antistoffer mod KARI.
Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
Tricine | Roth | 6977.2 | |
Sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | H5032 | |
NaHCO3 | Roth | 8551.1 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.5 | |
MgCl2 | Roth | 2189.1 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Benzamidine | Sigma | B6506 | |
ε-amino caproic acid | Fluka | 21530 | |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Roth | 6979.3 | |
Sucrose | Roth | 9286.2 | |
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide | Roth | 3029.1 | |
Tris | Fisher | BP152-5 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Roth | 1057.1 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T-8133 | |
Ammonium persulfate (APS) | Roth | 9592.1 | |
Glycerol | Roth | 3783.1 | |
Bromophenol blue | USB | US12370 | |
Glycin | Roth | 3908.3 | |
Gel staining medium | Clini-sciences | GEN-QC-STAIN | |
Ethanol | CARLO ERBA | 528151 | |
NaCl | Euromedex | 1112-A | |
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
Fat-free milk powder | Régilait | ||
HCl | Fisher | H/1150/PB15 | |
KOH pellets | Sigma | 1.05012 | |
NaOH pellets | CARLO ERBA | 480507 | |
Anti-HMA1 antibody | Seigneurin-Berny et al, 2006 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-KARI antibody | Ferro et al, 2010 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-LHCP antibody | Vallon et al, 1991 | Used at a 1:25,000 dilution | |
P-coumaric acid | Sigma | C-9008 | |
Luminol (3-aminophalhydrazin) | Fluka | 9253 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO). | Sigma | D5879 | |
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases | Puteaux | 162135 | |
A. thaliana seeds | Around 30 mg of seeds for a whole case | ||
Compost "Floragard" | Puteaux | 16311770 | |
Growth rooms | 12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s. | ||
Muslin or cheesecloth | Raffin | 70116 | 80-cm-large |
Nylon blutex 50 μm aperture | Tripette et Renaud, Sailly Saillisel | 50 μm aperture | |
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity | Waring Blender | ||
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles) | Beckman Coulter | ||
Beckman JA-20 rotor | Beckman Coulter | ||
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes) | Sorvall instruments | ||
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
Ultracentrifuge (Beckman L7) | Beckman Coulter | ||
Centrifuge (Beckman JSE-06D18) | Beckman Coulter | ||
Microcentrifuge | Eppendorf 5415D or equivalent | ||
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube. | |||
Nitrocellulose membranes | BA85, Schleicher and Schuell | ||
Filter paper | 3MM, Whatman, Maidstone | ||
Liquid nitrogen | |||
Peristaltic pump | Gilson | ||
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus). | Bio-Rad Protean 3 or equivalent | ||
System for protein transfer to nitrocellulose membranes | Bio-Rad Protean 3 or equivalent |