Qui, descriviamo un metodo per purificare i cloroplasti intatti da foglie di Arabidopsis e loro tre sub-scomparti principali (busta, lo stroma e tilacoidi), utilizzando una combinazione di centrifugazione differenziale, gradienti di Percoll continui, e pendenze del saccarosio discontinuo. Il metodo è utile per subplastidial e localizzazione subcellulare delle proteine mediante immunoblotting e proteomica.
Cloroplasti sono componenti importanti delle cellule vegetali. Tali plastidi compiono molte funzioni cruciali, come assimilazione di carbonio, zolfo e azoto, come pure la sintesi dei metaboliti essenziali. Questi organelli consistono dei seguenti tre sub-compartimenti chiavi. La busta, caratterizzata da due membrane, circonda l’organello e controlla la comunicazione del plastidio con altri compartimenti cellulari. Lo stroma è la fase solubile del cloroplasto e il sito principale dove l’anidride carbonica viene convertita in carboidrati. La membrana tilacoide è la rete di membrana interna che consiste della grana (piatto compresso ZSC) e lamelle (meno strutture dense), dove la fotosintesi oxygenic ha luogo. Il presente protocollo descrive passo per passo le procedure necessarie per la purificazione, utilizzando centrifugazione differenziale e gradienti di Percoll, dei cloroplasti intatti da Arabidopsise loro frazionamento, con pendenze del saccarosio, in tre Sub-compartimenti (cioè, busta, lo stroma e tilacoidi). Questo protocollo fornisce inoltre le istruzioni su come valutare la purezza di queste frazioni utilizzando marcatori associati ai vari sub-compartimenti cloroplasto. Il metodo qui descritto è prezioso per subplastidial la localizzazione delle proteine mediante immunoblotting, ma anche per subcellulare e subplastidial proteomica e altri studi.
Cloroplasti sono componenti importanti delle cellule vegetali. Essi derivano da un antenato cianobatterica che ha subito un’endosimbiosi e finalmente si è evoluto come un organulo durante evolution1,2. Tali organelli contengono tre scomparti principali (Figura 1). Il sistema di busta è composto di un interno e un esterno membrane che circondano l’organello. Questo sistema di doppia membrana contiene vari enzimi coinvolti nel metabolismo dei lipidi e pigmenti ed è per lo più dedicato al controllo della comunicazione tra plastidi e cytosol. Esso contiene vari sistemi di trasporto che consentono l’importazione delle proteine codificate e lo scambio di ioni e metaboliti tra il citosol e il cloroplasto regolando le funzioni metaboliche essenziali della pianta cella3,4 . Lo stroma, la fase solubile del cloroplasto, contiene gli enzimi del ciclo di Calvin (CO2 assimilazione), la sintesi di vari metaboliti tra cui aminoacidi e vitamine ed i macchinari di trascrizione e traduzione del plastidio. La membrana tilacoide è una rete di membrana interna ampiamente organizzato dove avviene la fase luminosa della fotosintesi. In tal modo, i cloroplasti sono il luogo dove vie metaboliche essenziali si verificano5.
Al fine di decifrare i nuovi meccanismi di regolazione che controllano la dinamica del cloroplasto e fisiologia, definendo la localizzazione sub-plastidiali delle proteine cloroplasto è così critico per supportare studi mirati con l’obiettivo di comprendere meglio le funzioni di proteine organismi di modello6. Per poter accedere alla localizzazione di vera subplastidial di queste proteine, è quindi essenziale per cominciare dalle frazioni di subplastidial altamente puro (busta membrane, stroma e tilacoidi). In questo contesto, l’obiettivo del presente protocollo è per purificare cloroplasti intatti da foglie di Arabidopsis mediante centrifugazione differenziale e pendenze continue di Percoll e frazionare li utilizzando pendenze del saccarosio discontinuo, in tre Sub-compartimenti (cioè, busta, lo stroma e tilacoidi). Il metodo qui descritto fornisce inoltre le istruzioni per valutare la purezza delle frazioni sub-organellari purificate mediante marcatori associati ai vari sub-compartimenti cloroplasto. Questo protocollo è prezioso per la localizzazione di subplastidial delle proteine mediante immunoblotting e per un’ulteriore analisi delle frazioni purificate mediante spettrometria di massa (MS)-basato su studi di proteomica.
Il presente articolo mira al dettaglio il protocollo di passo dopo passo utilizzato per purificare i cloroplasti (e loro sub-compartimenti) da Arabidopsis thaliana. Poiché la disponibilità della sua sequenza completa del genoma quasi due decenni fa e di grandi raccolte di mutanti di inserimento resi disponibile alla comunità, Arabidopsis ora è ampiamente accettata come una pianta di modello. Tuttavia, mentre questa pianta è stato perfettamente adattata per approcci genetici, pianta gli scienziati dovuti adattare strumenti biochimici e fisiologici per questo modello emergente. Protocolli che permette di purificare fotosinteticamente attivi cloroplasti da foglie di affermati modelli biochimici come spinaci12 o pisello13 così ha dovuto essere adattato. Il primo metodo che descrive la purificazione dei cloroplasti di Arabidopsis è stato pubblicato nel 199814, poco prima del rilascio della sequenza del genoma di Arabidopsis . Diversi anni più tardi, semplici metodi per isolare i cloroplasti di Arabidopsis compatibili con studi volti ad analizzare in vitro importazione delle proteine in organelli purificati sono stati fatti disponibili15,16. Tuttavia, questi metodi non permetteva di combinare l’elevato grado di purezza e la conservazione di attività fotosintetica di cloroplasti purificati. Più recentemente i17, un metodo rapido è stata stabilita, che si basa sull’uso di gradienti di Percoll e permette di conservare quasi il 90% del tasso di fotosintesi misurato nelle foglie partenza di Arabidopsis.
Il protocollo descritto qui permette di purificare Arabidopsis cloroplasti a un eccellente livello di purezza. Infatti, immunologico rilevamento di contaminanti da altri compartimenti cellulari hanno dimostrato che gli organelli purificati sono privi di mitocondriale e della membrana plasmatica marcatori9,10. Questo protocollo è stato anche efficiente per purificare i cloroplasti da diversi ecotipi Arabidopsis 18, come Columbia (Col) o Wassilewskija (WS), vale a dire, gli ecotipi che sono stati utilizzati per genoma o espresso sequence tags (ESTs) sequenziamento progetti ma anche di generare mutanti di inserimento del T-DNA in Arabidopsis. In altre parole, quando gli studi di proteomica devono essere eseguite, il presente protocollo è compatibile con questi due ecotipi di riferimento da Arabidopsis. Infine, la resa dei cloroplasti utilizzando il presente protocollo è simile a quello ottenuto quando a partire dalle foglie di spinaci o piselli (cioè, 3%, come misurato dal contenuto clorofilla nel cloroplasto Percoll-purificato rispetto al totale quantità di clorofilla presente in partenza lascia). In termini di proteine, il rendimento è vicino a 50 mg di proteine cloroplasto, quando gli organelli sono purificati da 500 g di foglie di Arabidopsis 5-settimana-vecchio.
Raggiungere una buona resa (e l’integrità del cloroplasto), uno dovrebbe tuttavia prestare particolare attenzione a diversi passi quando si utilizza il presente protocollo. Il cloroplasto in Arabidopsis è una struttura estremamente fragile (questo non è il caso per i cloroplasti di pisello, per esempio). Specifica attenzione è così necessaria al fine di evitare la rottura su larga scala degli organelli durante purificazione. Il numero e le dimensioni dei granuli di amido presenti nei cloroplasti sono fondamentali per la preparazione dei cloroplasti intatti. Infatti, cloroplasti contenenti grano grande amido generalmente verrà interrotti durante le fasi di centrifugazione differenziale iniziale con l’obiettivo di concentrare il cloroplasto greggio frazioni12. Pertanto, le piante dovrebbero essere tenute durante la notte in una stanza buia e fredda (4 ° C) prima dell’esperimento, per ridurre la quantità di amido.
Nuovi utenti del presente protocollo potrebbero essere tentati di iniziare da grandi quantità di materiale fogliare (enorme rosette da vecchie piante di Arabidopsis con foglie più grandi) cercando di migliorare il recupero dei cloroplasti purificati. Tuttavia, nelle nostre mani, a partire da foglie giovani (5-week-old) è il miglior compromesso per combinare la resa, la purezza e l’integrità degli organelli purificati. Infatti, troppo vecchie foglie sono altamente arricchiti in composti fenolici che sono stati indicati per avere un impatto negativo su cloroplasto integrità19.
Infine, la fase di estrazione iniziale (rettifica del tessuto) è un altro passo fondamentale. Il processo di miscelazione deve essere limitato a pochi secondi. Come detto sopra, nuovi utenti potrebbero essere tentati di utilizzate la fusione dei più a lungo, così mi aspettavo di migliorare fortemente la resa degli organelli purificati. Tuttavia, se la fusione più efficacemente rilascia più materiale da foglie, sembra che la proporzione dei cloroplasti rotti aumenta rapidamente nell’estratto grezzo delle cellule. A causa di questo alto rapporto di rotto a cloroplasti intatti nel mezzo, ulteriori fasi di purificazione (separazione su gradienti di Percoll) sono fortemente influenzati e il rendimento della purificazione è inaspettatamente inferiore.
Disponibilità di protocolli specifici per purificare gli organelli hanno permesso una serie di alta velocità di trasmissione basato su proteomics esperimenti per essere condotti su campioni del cloroplasto. Questi dati sono stati resi disponibili in diverse banche dati pubbliche6, fornendo così ai biologi nel campo un’accurata localizzazione subcellulare (e subplastidial) per molte proteine del cloroplasto. Questo era particolarmente vero per le proteine dell’involucro in cui identità e posizione rimasta in gran parte sconosciuto prima di queste analisi, poiché le membrane busta rappresentano una componente minore cloroplasto (1-2% delle proteine cloroplasto) giocando un ruolo chiave nel cloroplasto metabolismo e biogenesi5,20. Mediante il protocollo descritto qui, abbiamo recentemente analizzato la composizione dei tre comparti principali cloroplasto da Arabidopsis (cioè, lo stroma, i tilacoidi e il sistema a membrana busta)9. Basato su un approccio di proteomica semi-quantitativa (contando spettrale), siamo stati in grado di valutare il partizionamento di centinaia di proteine in questi tre scomparti del cloroplasto.
Mentre il presente protocollo permette di purificare i tre scomparti principali del cloroplasto da Arabidopsis, è anche possibile distinguere ulteriori vani secondari nel cloroplasto. Infatti, il sistema a membrana busta è costituito l’interno e le membrane di busta esterna (Figura 1). Tuttavia, al meglio della nostra conoscenza, un metodo per purificare le membrane busta interna ed esterna da cloroplasti di Arabidopsis rimane essere stabilita. Membrane di busta interna ed esterna possono essere purificate da cloroplasti di22 21 o pisello di spinaci. La limitazione principale di Arabidopsis risultati per lo più dagli importi limitanti del materiale base. A partire da 500 g di foglie di Arabidopsis (che già richiede 1 m2 superficie in una camera di crescita) permette di purificare solo 100 µ g di proteine dell’involucro. D’altra parte, è facile iniziare con 5-10 kg di spinaci foglie dal mercato, per purificare grandi quantità di cloroplasti8 e terminare con una resa di 3-10 mg di proteine dell’involucro da questo materiale.
Lo stesso vale per i sub-compartimenti thylakoid. Infatti, i tilacoidi sono fatti di luce vescicole di membrana (lamelle) e strutture dense (grana) (Figura 1). Protocolli specifici sono disponibili per distinguere questi due compartimenti in Arabidopsis23,24. Ancora una volta, sulla base di un’analisi di proteomica quantitativa abbiamo recentemente inventariati le proteine presenti in questi due sub-compartimenti24. Questi approcci, insieme a un’indagine approfondita della letteratura, ha permesso la convalida o proporre ipotesi, la posizione di subplastidial di centinaia di proteine thylakoid. Tuttavia, è importante notare che microdomini di membrana aggiuntive sono presenti presso i margini ricurvi dei tilacoidi. Questi sub-compartimenti lipoproteina, o plastoglobuli, sono permanentemente accoppiati a membrane tilacoidali e contengono un insieme specifico di proteine25. Utilizzando il presente protocollo, così non è possibile distinguere queste proteine specifiche da altri componenti di tilacoide.
Alcuni componenti originali di busta, lo stroma o thylakoid (ben noti) mancano ancora dagli elenchi delle proteine rilevate. Insieme con analisi mirata di biochimiche ed immunologiche, il miglioramento continuo delle MS sensibilità sarà di grande aiuto per rivedere il contenuto del cloroplasto verso un repertorio completo della composizione dei suoi vari sub compartimenti.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da una borsa di dottorato congiunta a IB dalla biologia vegetale INRA e divisione di allevamento e dal Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Vorremmo anche ringraziare il progetto ANR ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Parigi) per gli anticorpi contro LHCP e Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) per gli anticorpi contro KARI.
Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
Tricine | Roth | 6977.2 | |
Sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | H5032 | |
NaHCO3 | Roth | 8551.1 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.5 | |
MgCl2 | Roth | 2189.1 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Benzamidine | Sigma | B6506 | |
ε-amino caproic acid | Fluka | 21530 | |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Roth | 6979.3 | |
Sucrose | Roth | 9286.2 | |
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide | Roth | 3029.1 | |
Tris | Fisher | BP152-5 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Roth | 1057.1 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T-8133 | |
Ammonium persulfate (APS) | Roth | 9592.1 | |
Glycerol | Roth | 3783.1 | |
Bromophenol blue | USB | US12370 | |
Glycin | Roth | 3908.3 | |
Gel staining medium | Clini-sciences | GEN-QC-STAIN | |
Ethanol | CARLO ERBA | 528151 | |
NaCl | Euromedex | 1112-A | |
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
Fat-free milk powder | Régilait | ||
HCl | Fisher | H/1150/PB15 | |
KOH pellets | Sigma | 1.05012 | |
NaOH pellets | CARLO ERBA | 480507 | |
Anti-HMA1 antibody | Seigneurin-Berny et al, 2006 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-KARI antibody | Ferro et al, 2010 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-LHCP antibody | Vallon et al, 1991 | Used at a 1:25,000 dilution | |
P-coumaric acid | Sigma | C-9008 | |
Luminol (3-aminophalhydrazin) | Fluka | 9253 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO). | Sigma | D5879 | |
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases | Puteaux | 162135 | |
A. thaliana seeds | Around 30 mg of seeds for a whole case | ||
Compost "Floragard" | Puteaux | 16311770 | |
Growth rooms | 12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s. | ||
Muslin or cheesecloth | Raffin | 70116 | 80-cm-large |
Nylon blutex 50 μm aperture | Tripette et Renaud, Sailly Saillisel | 50 μm aperture | |
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity | Waring Blender | ||
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles) | Beckman Coulter | ||
Beckman JA-20 rotor | Beckman Coulter | ||
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes) | Sorvall instruments | ||
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
Ultracentrifuge (Beckman L7) | Beckman Coulter | ||
Centrifuge (Beckman JSE-06D18) | Beckman Coulter | ||
Microcentrifuge | Eppendorf 5415D or equivalent | ||
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube. | |||
Nitrocellulose membranes | BA85, Schleicher and Schuell | ||
Filter paper | 3MM, Whatman, Maidstone | ||
Liquid nitrogen | |||
Peristaltic pump | Gilson | ||
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus). | Bio-Rad Protean 3 or equivalent | ||
System for protein transfer to nitrocellulose membranes | Bio-Rad Protean 3 or equivalent |