Här, vi beskriver en metod för att rena intakt kloroplaster från Arabidopsis blad och deras tre sub huvudfack (kuvert, stroma, och thylakoids), med en kombination av differential centrifugations, kontinuerlig Percoll lutningar, och diskontinuerliga sackaros övertoningar. Metoden är värdefull för subplastidial och subcellulär lokalisering av proteiner av immunoblotting och proteomik.
Kloroplaster är viktiga komponenter i växtceller. Sådan plastids uppfylla många avgörande funktioner, såsom assimilering av kol, svavel och kväve samt syntes av viktiga metaboliter. Dessa organeller består av de följande tre viktiga sub fack. Kuvertet, kännetecknas av två membran, omger organell och kontroller av meddelande av plastid med andra cell-fack. Stroma är lösliga fasen av kloroplast och den viktigaste platsen där koldioxid omvandlas till kolhydrater. Tylakoida membranet är den inre membran nätverk bestående av grana (platt komprimerade SBO) och lamellerna (mindre täta strukturer), där syrerik fotosyntesen tar plats. Protokolls beskriver steg för steg förfaranden som krävs för rening, med hjälp av differentiell centrifugations och Percoll lutningar, av intakt kloroplaster från Arabidopsisoch deras fraktionering, använder sackaros lutningar, i tre sub fack (dvs. kuvert, stroma och thylakoids). Detta protokoll innehåller också instruktioner om hur man bedömer renheten av dessa fraktioner med hjälp av markörer associerade till olika kloroplast sub facken. Den metod som beskrivs här är värdefullt för subplastidial lokalisering av proteiner med immunoblotting, men också för subcellulär och subplastidial Proteomik och andra studier.
Kloroplaster är viktiga komponenter i växtceller. De härrör från en cyanobakterie förfader som har genomgått en endosymbios och så småningom utvecklades som en organell under evolution1,2. Dessa organeller innehåller tre huvudsakliga fack (figur 1). De kuvert består av ett inre och ett yttre membran som omger organell. Detta dubbla membran system innehåller olika enzymer som är involverade i metabolismen av lipider och pigment och är mestadels ägnas åt kontroll av kommunikationen mellan plastids och cytosolen. Den innehåller olika transportsystem som tillåter import av kärn-kodade proteiner och utbyte av joner och metaboliter mellan cytosolen och den kloroplast således reglerar viktiga metaboliska funktioner av plant cell3,4 . Stroma, den lösliga fasen av kloroplast, innehåller enzymer av Calvin cykeln (CO2 assimilering), syntesen av olika metaboliter inklusive aminosyror och vitaminer, och de transkription och translation machineries av plastid. Tylakoida membranet är ett allmänt organiserade inre membran nätverk där den lätta fasen av fotosyntesen sker. Kloroplaster är därmed, den plats där grundläggande metaboliska vägar uppstår5.
För att dechiffrera nya reglerande mekanismer som styr kloroplast dynamics och fysiologi, är definiera den sub-plastidial lokaliseringen av kloroplast proteiner således avgörande för att stödja riktade undersökningar som syftar till att bättre förstå proteiner funktioner i modell organismer6. För att få tillgång till den äkta subplastidial lokaliseringen av dessa proteiner, är det därför nödvändigt att starta från högt rena subplastidial fraktioner (kuvert membran, stroma och thylakoids). I detta sammanhang, syftet med detta protokoll är att rena intakt kloroplaster från Arabidopsis blad med hjälp av differentiell centrifugations och kontinuerlig Percoll övertoningar och fractionate dem med diskontinuerlig sackaros lutningar, i tre sub fack (dvs. kuvert, stroma och thylakoids). Den metod som beskrivs här ger också instruktioner att bedöma renheten av renat sub-organellar fraktioner med hjälp av markörer associerade till olika kloroplast sub facken. Detta protokoll är värdefull för subplastidial lokalisering av proteiner med hjälp av immunoblotting och för ytterligare analys av renat fraktioner med hjälp av masspektrometri (MS)-baserat proteomiska studier.
Denna artikel syftar till att detalj steg protokollet som används för att rena kloroplaster (och deras sub fack) från Arabidopsis thaliana. Eftersom tillgängligheten av dess komplett genomsekvens nästan två decennier sedan, och av stora samlingar av införande mutanter till gemenskapens förfogande, är Arabidopsis nu allmänt accepterade som en modell växt. Men medan denna anläggning var perfekt anpassad för genetiska metoder, plantera forskare behövs för att anpassa biokemiska och fysiologiska verktyg till denna nya modell. Protokollen tillåter för att rena photosynthetically active kloroplaster från bladen av väletablerade biokemiska modeller som spenat12 eller ärta13 således hade anpassas. Den första metoden som beskriver rening av Arabidopsis kloroplaster publicerades 199814, strax före utgivningen av sekvensen Arabidopsis genomet. Flera år senare, enkla metoder för att isolera Arabidopsis kloroplaster kompatibel med studier som syftar till att analysera in vitro- import av proteiner i renat organeller gjordes tillgängliga15,16. Dock tillät dessa metoder inte för att kombinera hög grad av renhet och bevarande av fotosyntetiska aktivitet av de renade kloroplaster. Mer nyligen fastställdes17, en snabb metod, som bygger på användning av Percoll övertoningar, och gör det möjligt för att behålla nästan 90% av photosynthesis mätt i börjar bladen av Arabidopsis.
Protokollet beskrivs här tillåter för att rena Arabidopsis kloroplaster på en utmärkt nivå av renhet. Faktiskt, immunologisk upptäckt av föroreningar från andra cell fack visat att renat organeller som saknar mitokondrie och plasmamembranet markörer9,10. Detta protokoll var också effektivt att rena kloroplaster från flera Arabidopsis ekotyper18, som Columbia (Col) eller Wassilewskija (WS), dvs de ekotyper som används för genomet eller uttryckt sekvens Taggar (EST) sekvensering projekt men också för att generera T-DNA införande mutanter i Arabidopsis. Med andra ord, när proteomik studier måste utföras, är detta protokoll kompatibel med dessa två referens ekotyper från Arabidopsis. Slutligen, utbytet av kloroplaster som använder detta protokoll är liknande den som erhålls när start från spenat eller ärt blad (dvs 3%, mätt från klorofyll innehållet i den Percoll-renat kloroplast jämfört med totalen klorofyll belopp i börjar bladen). När det gäller proteiner är avkastningen nära 50 mg kloroplast proteiner, när organeller renas från 500 g 5 veckor gamla Arabidopsis blad.
Att nå sådan god avkastning (och kloroplast integritet), en bör emellertid ägna särskild uppmärksamhet åt flera steg när du använder detta protokoll. Kloroplast i Arabidopsis är en ytterst bräcklig struktur (detta inte är fallet för ärt kloroplaster, till exempel). Särskild uppmärksamhet krävs således för att undvika storskaliga bristning av organeller under reningen. Antal och storlek av stärkelse granulat i kloroplaster är kritiska för beredning av intakt kloroplaster. Faktiskt, kloroplaster som innehåller stora stärkelse korn kommer generellt brytas under inledande differential centrifugations steg som syftar till att koncentrera de rå kloroplast fraktioner12. Växterna bör därför hållas över natten i ett mörkt och kallt rum (4 ° C) före experimentet, att minska mängden stärkelse.
Nya användare av detta protokoll skulle vara frestade att starta från större mängder löv material (stora rosetter från gamla Arabidopsis växter med större blad) försöker förbättra återhämtningen av renat kloroplaster. Men i våra händer, start från unga blad (5 veckor gamla) är den bästa kompromissen att kombinera avkastning, renhet och integritet av renat organeller. Alltför gamla löv är faktiskt mycket berikad med fenolföreningar som visade sig ha en negativ inverkan på kloroplast integritet19.
Slutligen är steget initial utvinning (slipning av vävnaden) ett annat viktigt steg. Blandning processen måste begränsas till några sekunder. Som nämnts ovan, kan nya användare frestas att använda längre blandning, således förväntar sig att starkt förbättra avkastningen av renat organeller. Om längre blandning effektivt släpper mer material från bladen, verkar det dock att andelen trasiga kloroplaster snabbt ökar i rå cell extrakt. På grund av denna hög andel brutna till intakt kloroplaster i mediet, ytterligare reningssteg (separation på Percoll lutningar) påverkas starkt och utbytet av rening är oväntat lägre.
Tillgänglighet av särskilda protokoll att rena organeller har låtit en rad högt dataflöde proteomik-baserade experiment skall utföras på kloroplast prover. Dessa data har gjorts tillgängliga i flera offentliga databaser6, vilket ger för biologer i fältet en korrekt subcellulär (och subplastidial) lokalisering för många kloroplast proteiner. Detta var särskilt sant för kuvert proteiner vars identitet och läge förblev mestadels okända innan dessa analyser, sedan kuvertet membran utgör en mindre kloroplast komponent (1-2% av kloroplast proteiner) medan du spelar en nyckelroll i kloroplast metabolism och biogenes5,20. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, vi nyligen analyserat sammansättningen av de tre viktigaste kloroplast fack från Arabidopsis (dvs, stroma, thylakoids och kuvert membran systemet)9. Baserat på en semi Kvantitativ proteomik strategi (spektral räkna), har vi kunnat bedöma delningen av hundratals proteiner i dessa tre kloroplast-fack.
Medan detta protokoll tillåter för att rena de tre avdelningarna av kloroplast från Arabidopsis, är det också möjligt att urskilja ytterligare sub fack i kloroplast. Kuvert membran systemet är faktiskt gjord av inre och de yttre kuvertet membran (figur 1). Dock till bäst av vår kunskap, en metod att rena inre och yttre kuvert membran från Arabidopsis kloroplaster fortfarande fastställas. Inre och yttre kuvert membran kan renas från spenat21 eller ärt22 kloroplaster. Den största begränsningen av Arabidopsis resulterar mestadels från de begränsande mängder av utgångsmaterial. Start från 500 g Arabidopsis blad (som redan kräver 1 m2 yta i en tillväxt kammare) tillåter renande bara 100 µg av kuvert proteiner. Däremot, är det lätt att börja med 5-10 kg spenat blad från marknaden, att rena stor mängd kloroplaster8 och avsluta med en avkastning på 3 till 10 mg av kuvert proteiner från detta material.
Samma sak gäller för tylakoida sub fack. Ja, thylakoids är gjorda av ljus membranet blåsor (lameller) och täta strukturer (grana) (figur 1). Särskilda protokoll finns att skilja dessa två avdelningar i Arabidopsis23,24. Igen, utifrån en kvantitativ proteomik analys, vi nyligen inventerats proteinerna som finns i dessa två sub fack24. Dessa metoder, tillsammans med en fördjupad undersökning av litteraturen, tillåtet validera eller föreslår hypoteser för, subplastidial platsen för hundratals tylakoida proteiner. Det är dock viktigt att Observera att ytterligare membran microdomains finns på thylakoids böjda marginaler. Dessa lipoprotein sub fack, eller plastoglobules, är permanent kopplad till tylakoida membran och innehålla en specifik uppsättning proteiner25. Använder detta protokoll, går det således inte att skilja dessa specifika proteiner från andra tylakoida komponenter.
Vissa äkta (välkänd) kuvert, stroma eller tylakoida komponenter saknas fortfarande från förteckningarna över identifierade proteiner. Tillsammans med riktade biokemiska och immunologiska analyser, kommer kontinuerlig förbättring av MS känslighet vara till stor hjälp att återbesöka kloroplast innehållet mot en komplett repertoar av sammansättningen av dess olika sub fack.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av en gemensam PhD stipendium till IB från INRA växtbiologi och avel Division och från Labex GRALEN (ANR-10-LABX-49-01). Vi vill också uppmärksamma ANR projektet ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) för antikroppar mot LHCP och Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) för antikroppar mot KARI.
Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
Tricine | Roth | 6977.2 | |
Sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | H5032 | |
NaHCO3 | Roth | 8551.1 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.5 | |
MgCl2 | Roth | 2189.1 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Benzamidine | Sigma | B6506 | |
ε-amino caproic acid | Fluka | 21530 | |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Roth | 6979.3 | |
Sucrose | Roth | 9286.2 | |
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide | Roth | 3029.1 | |
Tris | Fisher | BP152-5 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Roth | 1057.1 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T-8133 | |
Ammonium persulfate (APS) | Roth | 9592.1 | |
Glycerol | Roth | 3783.1 | |
Bromophenol blue | USB | US12370 | |
Glycin | Roth | 3908.3 | |
Gel staining medium | Clini-sciences | GEN-QC-STAIN | |
Ethanol | CARLO ERBA | 528151 | |
NaCl | Euromedex | 1112-A | |
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
Fat-free milk powder | Régilait | ||
HCl | Fisher | H/1150/PB15 | |
KOH pellets | Sigma | 1.05012 | |
NaOH pellets | CARLO ERBA | 480507 | |
Anti-HMA1 antibody | Seigneurin-Berny et al, 2006 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-KARI antibody | Ferro et al, 2010 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-LHCP antibody | Vallon et al, 1991 | Used at a 1:25,000 dilution | |
P-coumaric acid | Sigma | C-9008 | |
Luminol (3-aminophalhydrazin) | Fluka | 9253 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO). | Sigma | D5879 | |
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases | Puteaux | 162135 | |
A. thaliana seeds | Around 30 mg of seeds for a whole case | ||
Compost "Floragard" | Puteaux | 16311770 | |
Growth rooms | 12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s. | ||
Muslin or cheesecloth | Raffin | 70116 | 80-cm-large |
Nylon blutex 50 μm aperture | Tripette et Renaud, Sailly Saillisel | 50 μm aperture | |
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity | Waring Blender | ||
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles) | Beckman Coulter | ||
Beckman JA-20 rotor | Beckman Coulter | ||
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes) | Sorvall instruments | ||
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
Ultracentrifuge (Beckman L7) | Beckman Coulter | ||
Centrifuge (Beckman JSE-06D18) | Beckman Coulter | ||
Microcentrifuge | Eppendorf 5415D or equivalent | ||
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube. | |||
Nitrocellulose membranes | BA85, Schleicher and Schuell | ||
Filter paper | 3MM, Whatman, Maidstone | ||
Liquid nitrogen | |||
Peristaltic pump | Gilson | ||
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus). | Bio-Rad Protean 3 or equivalent | ||
System for protein transfer to nitrocellulose membranes | Bio-Rad Protean 3 or equivalent |