Summary
Her, vi beskriver en metode til at rense intakt grønkorn fra Arabidopsis blade og deres tre vigtigste sub rum (kuvert, stroma og tylakoiderne), ved hjælp af en kombination af differentieret centrifugations, kontinuerlig Percoll forløb, og diskontinuerlig saccharose forløb. Metoden er værdifuld for subplastidial og subcellulært lokalisering af proteiner af immunoblotting og proteomics.
Abstract
Kloroplaster er væsentlige bestanddele af planteceller. Sådanne plastids opfylde mange livsvigtige funktioner, som assimilation af kulstof, svovl og kvælstof samt syntese af væsentlige metabolitter. Disse organeller består af de følgende tre centrale sub rum. Kuvert, karakteriseret ved to membraner, omgiver organelle og styrer kommunikationen af plastid med andre celle rum. Stroma er den opløselige fase af chlorplasttransitpeptidsekvensen og de vigtigste site hvor kuldioxid er omdannet til kulhydrater. Tylakoid membran er den indre membran netværk bestående af grana (flad komprimeret sække) og lameller (mindre tætte strukturer), hvor iltdannende fotosyntese finder sted. Denne protokol beskriver trin for trin-procedurer, der kræves til rensning, ved hjælp af differentieret centrifugations og Percoll farveforløb, af intakt grønkorn fra Arabidopsisog deres fraktionering, ved hjælp af saccharose forløb, i tre sub rum (dvs. kuvert, stroma og tylakoiderne). Denne protokol giver også anvisninger på hvordan man skal vurdere renhedsgraden af disse fraktioner ved hjælp af datamærker forbundet til de forskellige grønkorn sub rum. Metoden beskrevet her er værdifuld for subplastidial lokalisering af proteiner ved hjælp af immunoblotting, men også subcellulært og subplastidial proteomics og andre undersøgelser.
Introduction
Kloroplaster er væsentlige bestanddele af planteceller. De hidrører fra en cyanobakteriel forfader, der har undergået en endosymbiosis og til sidst udviklede sig som en organelle under udvikling1,2. Disse organeller indeholder tre hovedrum (figur 1). Kuvert system består af en indre og en ydre membraner omgiver organelle. Denne dobbelt membran system indeholder forskellige enzymer involveret i metaboliseringen af lipider og pigmenter og er for det meste afsat til kontrol af kommunikationen mellem plastids og cytosol. Det indeholder forskellige transportsystemer, der tillader import af nuklear-kodet proteiner, og udvekslingen af ioner og metabolitter mellem cytosol og chlorplasttransitpeptidsekvensen dermed regulerer væsentlige metaboliske funktioner af anlægget celle3,4 . Stroma, den opløselige fase af grønkorn, indeholder enzymer i Calvins cyklus (CO2 assimilation), syntese af forskellige metabolitter, herunder aminosyrer, vitaminer og plastid transskription og translation machineries. Tylakoid membran er et almindeligt organiseret indre membran netværk hvor den lette fase af fotosyntesen foregår. Dermed, er kloroplaster det sted, hvor væsentlige stofskifteveje forekomme5.
For at dechifrere nye reguleringsmekanismer, der styrer grønkorn dynamics og fysiologi, er definere de sub-plastidial lokalisering af grønkorn proteiner derfor kritisk at støtte målrettede undersøgelser med henblik på at bedre at forstå proteiner funktioner i model organismer6. For at få adgang til den ægte subplastidial lokalisering af disse proteiner, er det således vigtigt at starte fra yderst rene subplastidial fraktioner (kuvert membraner, stroma og tylakoiderne). I denne forbindelse formålet med denne protokol er at rense intakt grønkorn fra Arabidopsis blade ved hjælp af differentieret centrifugations og kontinuerlig Percoll forløb, og at fractionate dem ved hjælp af diskontinuert saccharose forløb, i tre sub rum (dvs. kuvert, stroma og tylakoiderne). Metoden beskrevet her indeholder også vejledning til vurdering af renheden af renset sub-organellar fraktioner ved hjælp af datamærker forbundet til de forskellige grønkorn sub rum. Denne protokol er værdifuld for subplastidial lokalisering af proteiner ved hjælp af immunoblotting og for yderligere analyse af renset fraktioner ved hjælp af massespektrometri (MS)-baseret proteom undersøgelser.
Protocol
1. fremstilling af buffere, stamopløsninger og forløb
- Forberede følgende stock løsninger, der kan gemmes til 6 måneder ved 4 ° C.
- Forberede 1 L Tricine buffer (1 M, pH 8.4) og Tricine buffer (1 M, pH 7,6). Justere pH ved at tilføje KOH pellets.
- Forberede 1 L ethylendiamintetra syre (EDTA, 0,5 M, pH 8) og 3-(N-morpholino) propan ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (MOPPER) buffer (1 M, pH 7,8). Justere pH ved at tilføje NaOH pellets.
- Forberede 50 mL af MgCl2 (1 M).
- Forberede 50 mL af protease inhibitorer løsninger: phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF oprettet i isopropanol, 100 mM), benzamidine-hydrochlorid hydrat (100 mM), og ε-amino capronsyre (50 mM).
Bemærk: Mens PMSF og amino capronsyre er stabile i løsning for måneder ved 4 ° C, benzamidine løsning skal opbevares ved-20 ° C.
- Forberede følgende løsninger dagen før eksperimentet og gemme alle løsninger ved 4 ° C.
- Forbered 4 L slibning medium pH 8.4 indeholdende Tricine-KOH (20 mM, pH 8.4), sorbitol (0,4 M), EDTA (10 mM, pH 8) og NaHCO3 (10 mM). Justere pH ved at tilføje NaOH pellets. Tilføje bovint serumalbumin (BSA) på 0,1% (w/v) umiddelbart før brugen og bland godt.
- Forberede 500 mL vask medium (2 x) pH 7,6 indeholdende Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6), sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) og EDTA (2,5 mM). Justere pH ved at tilføje NaOH pellets. Fortynd sådan løsning efter forberedelse af Percoll gradient løsning at opnå vask medium (1 x).
- Forberede 200 mL af Percoll gradient løsning for grønkorn rensning ved at blande Percoll med vask medium (2 x) på en tilsvarende mængde til at få en endelig løsning på 50% (v/v) Percoll / 0,4 M sorbitol.
- Forberede 50 mL af saccharose løsninger for grønkorn fraktionering af blande MOPPER (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM) og saccharose (0,3 M, 0,6 M og 0,93 M) i forskellige koncentrationer.
- Forberede følgende forløb og buffere før du starter eksperimentet.
- Forberede seks rør af Percoll forløb (hver indeholdende 30 mL i en 50% Percoll / 0,4 M sorbitol) ved centrifugering ved 38.700 x g i 55 min. ved 4 ° C. Holde bremsen ud for at forhindre blanding af gradienter. Efter centrifugering, gemme rør indeholdende de preformed forløb i et koldt rum indtil brug.
- Forberede fire rør af saccharose forløb, med hvert farveforløb, dannet af tre følgende saccharose lag: 3 mL af 0.93 M, 2,5 mL 0,6 M og 2 mL 0,3 M saccharose. Omhyggeligt overlay hvert lag, ved hjælp af en peristaltisk pumpe starter med 0,93 M i bunden og efterbehandling med 0,3 M på toppen.
- Forberede grønkorn lysis indeholdende MOPPER (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, oprettet i isopropanol), benzamidine-hydrochlorid hydrat (1 mM) og ε-amino capronsyre (0,5 mM) 50 mL af hypotonic medium. Gemme bufferen på køl indtil brug.
- Forberede 50 mL af membran vask buffer indeholdende MOPPER (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), benzamidine-hydrochlorid hydrat (1 mM) og ε-amino capronsyre (0,5 mM). Gemme bufferen på køl indtil brug.
2. vækst og høst af Arabidopsis blade
- For vækst i Arabidopsis planter, forberede 4 store plast pander (en total overflade på 0,5 til 1 m2) af Arabidopsis planter ved såning 30 mg af frø i hver gryde. Vokse Arabidopsis planter i 5 uger ved 12-h lys cyklus ved 23 ° C (dag) / 18 ° C (nat) med en lysintensitet af 150 μM m-2 s-1.
- Der inkuberes planter i et mørkt og koldt værelse (4 ° C) natten før eksperimentet (til at reducere mængden af stivelse granulat i grønkornene).
- Pre vejer et 1 L bæger og derefter placere den på is før høst af blad materiale.
- Høste Arabidopsis blade ved at undgå jord (kompost). Re vejer bægerglasset og optage væv vægt.
Bemærk: 400-500 g blad materiale forventes fra fire pander. - Homogeniseres blade i et koldt rum med 2 L slibning buffer (tilføje BSA før brug) tre gange / 2 s hver gang, i en blender på høj hastighed.
- Filtrer homogenatet i et koldt værelse med 4 lag af musselin og et lag af nylon blutex. Forsigtigt klemme homogenatet blade indeni musselin nylon blutex hen til uddrag al væsken.
- Genskab de resterende væv i blenderen kop til en anden ekstraktion. Gentag trin 2.5 og 2.6 bruger 2 L slibning medium og nye 4-5 lag af musselin (i et koldt rum).
3. rensning af rå grønkorn ved hjælp af differentieret centrifugering
- Lige så distribuere rå celle ekstrakt i seks 500 mL flasker og Placer flasker på køl inden centrifugering. Der centrifugeres i 2 min så snart den maksimale hastighed (2,070 x g) er nået (maksimal acceleration og bremse på 4 ° C).
- Forsigtigt supernatanten.
- Opsug den resterende supernatanten ved hjælp af en vandpumpe og holde de piller, der indeholder koncentrerede rå grønkorn på is.
- Forsigtigt resuspend pellets ved at tilføje en minimal mængde af vask medium (1 x) (endelige mængden af kombinerede grønkorn suspensioner = 36 mL) ved hjælp af et paintbrush eller en buet plastik spatel. Bruge en 10 mL pipette til tilsættes 3 mL vask medium i hver flaske.
Bemærk: Brug ikke pipette med meget fine tips til at undgå brud på grønkorn. Alternativt, skæres den blå spids af en pipette med et barberblad til at generere et større hul. - Indsamle de resuspenderede kloroplaster i ét rør ved hjælp af en 10 mL pipette. Forsigtigt blandes ved at vende røret for at opnå en homogen suspension før pålæsningen på Percoll forløb.
4. rensning af intakt grønkorn på kontinuerlig Percoll Gradient
- Langsomt hæld 6 mL grønkorn suspension oven på hver af seks Percoll forløb ved hjælp af en 10 mL pipette til at undgå brud på grønkorn.
- Der centrifugeres forløb i 10 min på 13,300 x g, 4 ° C ved hjælp af en svinge spanden rotor.
Bemærk: Accelerationen skal være langsom, og bremsen skal afbrydes (bremse off eller langsom deceleration) for at undgå blanding af Percoll forløb. - Opsug den øverste fase, der indeholder brudte grønkorn og intakt mitokondrier ved hjælp af en vandpumpe, og derefter hente intakt grønkorn til stede i nederst fase (den brede mørke-grøn band) med en 10 mL pipette. Vær omhyggelig med ikke at Aspirér kerner og celle debris (findes i bunden af røret) med de intakte grønkorn (figur 2A).
- Fortyndes 3-4-fold intakt grønkorn suspension med vask buffer (1 x). Der centrifugeres i 2 min så snart den maksimale hastighed (2,070 x g, 4 ° C) er nået (maksimal acceleration og bremse på).
- Omhyggeligt supernatanten.
- Helt Opsug den resterende supernatanten med en vandpumpe og holde pellet af koncentreret intakt grønkorn på is.
- Før grønkorn lysis, holde en alikvot af intakt grønkorn brøkdel i ca. 1 mL vask medium (1 x) for yderligere analyser ved hjælp af sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og western blotting. Holde en lille alikvot af disse intakt grønkorn til bestemmelse af proteinkoncentration. Gemme intakt grønkorn brøkdel i flydende nitrogen til yderligere forsøg.
5. lysering af intakt grønkorn ved hjælp af en Hypotonic Buffer og rensning af grønkorn sub rum på diskontinuert saccharose forløb
- Lyse renset intakt grønkornene af resuspending pellet i hypotonic medium, der indeholder proteasehæmmere (endelige volumen ikke bør overstige 12 mL).
Bemærk: Fra dette trin, brugen af pipette med fine tips (blå tips) er muligt da handelsformer af kloroplaster er ikke mere væsentlige (pipettering grønkorn op og ned så længe pellet ikke er helt genopslemmes). Arabidopsis kloroplaster er meget skrøbeligt (i forhold til ært grønkorn, for eksempel) og deres lysis er næsten øjeblikkelig efter inkubation i hypotonic medium. - Langsomt indlæse 3 mL lysed grønkornene på toppen af hver præfabrikerede saccharose forløb ved hjælp af en peristaltisk pumpe.
- Ultracentrifuge forløb for 1 h (70.000 x g, 4 ° C). Balance par af rørene ved hjælp hypotonic medium buffer inden centrifugering.
- Omhyggeligt genoprette de opløselige stromale proteiner af pipettering den øverste fase af gradient (3 mL fra hver gradient) (figur 2B). Tage en prøve til bestemmelse af protein koncentration7. Gemme stroma i flydende nitrogen til yderligere forsøg.
- Opsug den resterende øverste fase af hvert forløb op til gule bandet ved hjælp af en vandpumpe.
- Hent den gule band (konvolutten) med en pipette (ca. 1 mL fra hver forløb). Pool konvolutter i et rør.
- Fjern de resterende fase af hvert forløb op til tylakoid pellet ved hjælp af en vandpumpe.
6. vask og koncentration af tylakoid og kuvert membran systemer
- Resuspend tylakoid pellets (grøn pellets) i en mindstemængde (2 mL) af membran vask buffer (1 x) (med proteasehæmmere).
- Fortynd kuvert og tylakoid suspensionerne 3-4-fold i membranen vask medium (justere lydstyrken til 10 mL) og ultracentrifuge for 1 h (110.000 x g, 4 ° C). Balance par rør ved hjælp af membran vask buffer inden centrifugering.
- Omhyggeligt Aspirér analysere ved hjælp af en vandpumpe.
- Tilføje ca 100 µL af membran vask buffer (med proteasehæmmere) til kuvert pellet. Tage en prøve til bestemmelse af protein koncentration7. Gemme renset kuvert membran forberedelse i flydende kvælstof.
- Resuspend tylakoiderne pellet i 3 mL af membran vask buffer (med proteasehæmmere). Tage en prøve til bestemmelse af protein koncentration7. Gemme tylakoid membran brøkdel i flydende kvælstof.
Representative Results
Successive trin af proceduren resulterer i renset grønkorn og deres sub rum er genoptaget i figur 2. Percoll gradient (figur 2A) kan skelne intakt grønkorn fra brudt grønkorn og mitokondrier (toppen af gradient) eller kerner og celle debris (bunden af gradient). Efter ruptur af Percoll-renset organeller takket være en osmotisk chok, er de deraf følgende fraktioner adskilt på en saccharose gradient (figur 2B). Stroma (opløselige del af chlorplasttransitpeptidsekvensen) flyder på overfladen af saccharose gradient. Lys kuvert membran vesikler er inddrevet som en diskret gule band på 0,6/0,93 M saccharose interface. De tungeste tylakoid membraner vesikler er koncentreret i bunden af røret. Efter gendannelse, vask og koncentrationen af to membran fraktioner, proteiner er kvantificeret og sammensætningen af alle fire fraktioner er analyseret på en SDS-PAGE (figur 2 c). Banerne er indlæst på grundlag af lige protein (20 µg for hver renset fraktion). Vel vidende at grønkorn indeholder kun 1% af kuvert proteiner og 50% af proteiner fra stroma eller tylakoiderne, denne tendens til at overvurdere krydskontaminering af renset kuvert præparater med andre grønkorn sub rum. Men denne metode giver mulighed for at opdage små mængder af proteiner cross-forurenende kuvert brøkdel. Markører fra hvert rum (dvs., rigelige proteiner) er meget hjælpsom med at evaluere krydskontaminering af fraktioner. Faktisk forventes tylakoid og kuvert membran fraktioner at indeholde meget lave mængder af store subunit af RuBisCO (RBCL), den mest rigelige protein fra stroma (50 kDa). Brudt grønkorn kan let skelnes fra intakt grønkorn på grund af tabet af denne stromale protein8. Lyset høst komplekse proteiner (LHCP) er 25-kDa rigelige tylakoid komponenter, der bør næppe (mindre end 3%) forurene kuvert membraner9. Endelig, fosfat-Triosefosfatisomerase-fosfat translocator (TPT) er en 30-kDa protein, der er kun synlige i renset kuvert fraktion på grund af sin stærke berigelse (dvs. 50 til 100 x) i kuvert-fraktionen i forhold til hele grønkorn ekstrakter. Ved hjælp af metoden beskrevet her, grønkorn sub rum er generelt dårligt cross-forurenet som bekræftet ved hjælp af western-skamplet analyser (figur 2D) afhængige af antistoffer rettet mod kendte markører for alle tre sub rum: den opløselige ketol syre reductoisomerase (KARI) fra stroma, grønkorn kuvert kobber ATPase (HMA1), og lyset høst komplekse proteiner (LHCP) fra tylakoid membraner. Krydskontaminering af tre sub rum kan kvantificeres ved hjælp af både immunoblotting og en masse massespektrometri analyser9. Mens stroma ikke er normalt forurenet af kuvert eller tylakoid fraktioner, renset kuvert fraktioner indeholder 3% af tylakoid proteiner og op til 10% af proteiner fra stroma. Proteiner fra stroma forurene dårligt tylakoid membraner (mindre end 1%) men tylakoiderne indeholder op til 3% af kuvert Membranproteiner. Mere end at have en afgørende rolle i at identificere ægte subplastidial placeringen af grønkorn proteiner, den nuværende metode således også begrænser fejlagtige konklusioner om subplastidial lokalisering af proteiner som følge af cross forureninger.
Figur 1: repræsentative ordningen grønkorn sub rum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: oprensning af intakte grønkorn og deres tre vigtigste sub rum ved hjælp af Percoll og saccharose gradienter. A. Percoll graduering giver mulighed for adskillelse af brudt og intakt grønkorn. B. saccharose graduering giver mulighed for adskillelse af stroma, kuvert og tylakoid fraktioner. C. repræsentant SDS-PAGE af proteiner fra intakt grønkorn og deres tre vigtigste sub rum gør det muligt for at visualisere rigelige markører fra hvert sub rum. Hver bane indeholder 10 µg af proteiner. Molekylær vægt markører: RBCL, store subunit af RuBisCO (markør for stroma); TPT, Triosefosfatisomerase-fosfat-phosphat translocator (markør for konvolutten); LHCP, lys, høst komplekse proteiner (markør for tylakoid). D. Western-skamplet eksperimenter giver mulighed for at opdage specifikke markører (ved hjælp af specifikke antistoffer) fra hver sub rum: grønkorn kuvert kobber ATPase HMA110, lyset høst komplekse proteiner LHCP fra tylakoid membraner11, og ketol-syre reductoisomerase KARI fra stroma9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne artikel har til formål at detaljer trin for trin-protokol, der bruges til at rense grønkorn (og deres sub rum) fra Arabidopsis thaliana. Siden tilgængelighed af dens komplet genomet sekvens næsten to årtier siden, og store samlinger af indsættelse mutanter stilles til rådighed for Fællesskabet, er Arabidopsis nu almindeligt accepteret som en model plante. Men mens denne plante var perfekt tilpasset til genetiske metoder, plante forskere nødvendige for at tilpasse biokemiske og fysiologiske værktøjer til denne nye model. Protokoller gør det muligt for at rense photosynthetically aktive grønkorn fra bladene af veletablerede biokemiske modeller som spinat12 eller ært13 således skulle tilpasses. Den første metode beskriver rensning af Arabidopsis grønkorn blev offentliggjort i 199814, lige før udgivelsen af Arabidopsis genomet sekvens. Flere år senere, enkle metoder til isolering af Arabidopsis grønkorn kompatibel med undersøgelser med henblik på at analysere in vitro- import af proteiner i renset organeller blev gjort tilgængelige15,16. Men disse metoder ikke tillod for at kombinere høj renhed og bevarelse af fotosyntetiske aktivitet renset grønkornene. For nylig blev17, en hurtig metode etableret, som bygger på anvendelse af Percoll forløb, og gør det muligt for at bevare næsten 90% af fotosyntese målt i Arabidopsis begynder bladene.
Protokollen beskrevet her giver mulighed for at rense Arabidopsis grønkorn på et fremragende niveau af renhed. Faktisk, immunologiske påvisning af forurenende stoffer fra andre celle rum viste, at de renset organeller er blottet for mitokondrie og plasma membran markører9,10. Denne protokol blev også effektivt at rense grønkorn fra flere Arabidopsis økotyper18, som Columbia (Col) eller Wassilewskija (WS), dvs., de økotyper, der blev brugt til genom eller udtrykt sequence tags (interesser) sekventering projekter, men også til at generere T-DNA indsættelse mutanter i Arabidopsis. Med andre ord, når proteomics undersøgelser skal udføres, er i denne protokol kompatibel med disse to reference økotyper fra Arabidopsis. Endelig er udbyttet af grønkorn ved hjælp af denne protokol magen til det opnås, når start fra spinat eller ært blade (dvs. 3%, målt fra Percoll-renset chlorplasttransitpeptidsekvensen i forhold til samlet indhold af klorofyl klorofyl beløb i starter blade). Med hensyn til proteiner er udbyttet tæt på 50 mg af grønkorn proteiner, når organeller er renset fra 500 g af 5-uge-forhenværende Arabidopsis blade.
At nå frem til sådan en god udbytte (og grønkorn integritet), man bør dog være særlig opmærksom flere trin, når du bruger denne protokol. Grønkorn i Arabidopsis er en yderst skrøbelig struktur (dette ikke er tilfældet for pea grønkorn, for eksempel). Særlig opmærksomhed er dermed nødvendigt for at undgå store brud på organeller under rensningen. Antallet og størrelsen af stivelse granulat i kloroplaster er afgørende for forberedelsen af intakt grønkorn. Faktisk, grønkorn indeholdende store stivelse korn generelt bliver brudt under indledende differentieret centrifugations skridt med henblik på at koncentrere rå grønkorn fraktioner12. Derfor, bør planterne opbevares natten over i et mørkt og koldt værelse (4 ° C) før forsøget, at reducere mængden af stivelse.
Nye brugere af denne protokol kan blive fristet til at starte fra større mængder af blad materiale (store rosetter fra gamle Arabidopsis anlæg med større blade) forsøger at fremme genanvendelsen af renset grønkorn. Men i vores hænder, startende fra unge blade (5-uge-forhenværende) er det bedste kompromis at kombinere udbytte, renhed og integriteten af de oprensede organeller. Faktisk, for gamle blade er stærkt beriget i phenolforbindelser, der blev vist sig at have en negativ indvirkning på grønkorn integritet19.
Endelig, indledende ekstraktionstrinet (slibning af væv) er en anden afgørende skridt. Blending processen skal være begrænset til par sekunder. Som anført ovenfor, kunne nye brugere fristes til at bruge længere blanding, således forventer at kraftigt forbedre udbyttet af renset organeller. Hvis længere blanding effektivt frigiver mere materiale fra blade, synes det imidlertid at andelen af knækkede grønkorn hurtigt øger i rå celle ekstrakt. På grund af denne høj forholdet mellem brudt til intakt kloroplaster i medium, yderligere rensning trin (adskillelse på Percoll forløb) påvirkes kraftigt og udbyttet af rensning er uventet lavere.
Tilgængeligheden af specifikke protokoller til at rense organeller har tilladt en serie af høj overførselshastighed proteomics-baserede eksperimenter skal gennemføres på grønkorn prøver. Disse data blev stillet til rådighed i flere offentlige databaser6, hvilket giver at biologer i feltet en nøjagtig subcellulært (og subplastidial) lokalisering for mange grønkorn proteiner. Dette var især tilfældet for kuvert proteiner hvis identitet og placering forblev for det meste ukendte før disse analyser, da kuverten membraner repræsenterer en mindre grønkorn komponent (1-2% af proteinerne, grønkorn) mens du spiller en nøglerolle i grønkornets stofskifte og Biogenese5,20. Ved hjælp af protokollen beskrevet her, vi for nylig analyseret sammensætningen af de tre vigtigste grønkorn rum fra Arabidopsis (dvs. stroma, tylakoiderne og kuvert membran system)9. Baseret på en semi-kvantitative proteomics tilgang (spektrale tælle), har vi kunnet vurdere partitionering af hundredvis af proteiner i disse tre grønkorn rum.
Mens denne protokol giver mulighed for at rense de tre vigtigste rum af chlorplasttransitpeptidsekvensen fra Arabidopsis, er det også muligt at skelne yderligere sub rum i chlorplasttransitpeptidsekvensen. Faktisk, kuvert membran system er lavet af indre og de ydre konvolut membraner (figur 1). Til bedste af vores viden er en metode til at rense indre og ydre konvolut membraner fra Arabidopsis grønkorn imidlertid fastsættes. Indre og ydre konvolut membraner kan blive renset fra spinat21 eller ært22 grønkorn. Den største begrænsning af Arabidopsis resultater for det meste fra de begrænsende beløb for at starte materiale. Start fra 500 g Arabidopsis blade (som allerede kræver 1 m2 overflade i et vækst kammer) giver mulighed for rensning kun 100 µg kuvert proteiner. På den anden side er det let at starte med, 5-10 kg af spinat blade fra markedet, at rense store mængder af grønkorn8 og ender med et udbytte på 3 til 10 mg af kuvert proteiner fra dette materiale.
Det samme gælder for tylakoid sub rum. Faktisk tylakoiderne er lavet af lys membran vesikler (lamellae) og tætte strukturer (grana) (figur 1). Særlige protokoller er tilgængelige til at skelne mellem disse to rum i Arabidopsis23,24. Igen, baseret på en kvantitativ proteomics analyser, vi for nylig fortegnelserne proteiner til stede i disse to sub rum24. Disse tilgange, sammen med en grundig undersøgelse af litteraturen, tilladt validering, eller foreslår hypoteser for subplastidial placeringen af hundredvis af tylakoid proteiner. Det er dog vigtigt at bemærke, at yderligere membran microdomains er til stede på de buede kanter af tylakoiderne. Disse lipoprotein sub rum, eller plastoglobules, er permanent tilkoblet tylakoid membraner og indeholder et bestemt sæt af proteiner25. Ved hjælp af denne protokol, er det således ikke muligt at skelne disse specifikke proteiner fra andre tylakoid komponenter.
Nogle ægte (kendte) kuvert, stroma eller tylakoid komponenter mangler stadig fra listerne over registrerede proteiner. Samt målrettede biokemiske og immunologiske analyser, vil den løbende forbedring af MS følsomhed være til stor hjælp at gense grønkorn indhold mod et komplet repertoire af sammensætningen af dens forskellige sub rum.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en fælles ph.d.-stipendium til IB fra INRA plantebiologi og avl Division og Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Vi ønsker også at anerkende projektets Musikvogn ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) for antistoffer mod LHCP og Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) for antistoffer mod KARI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
| Tricine | Roth | 6977.2 | |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | H5032 | |
| NaHCO3 | Roth | 8551.1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.5 | |
| MgCl2 | Roth | 2189.1 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzamidine | Sigma | B6506 | |
| ε-amino caproic acid | Fluka | 21530 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Roth | 6979.3 | |
| Sucrose | Roth | 9286.2 | |
| Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide | Roth | 3029.1 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Roth | 1057.1 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T-8133 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Roth | 9592.1 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Bromophenol blue | USB | US12370 | |
| Glycin | Roth | 3908.3 | |
| Gel staining medium | Clini-sciences | GEN-QC-STAIN | |
| Ethanol | CARLO ERBA | 528151 | |
| NaCl | Euromedex | 1112-A | |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| Fat-free milk powder | Régilait | ||
| HCl | Fisher | H/1150/PB15 | |
| KOH pellets | Sigma | 1.05012 | |
| NaOH pellets | CARLO ERBA | 480507 | |
| Anti-HMA1 antibody | Seigneurin-Berny et al, 2006 | Used at a 1:1000 dilution | |
| Anti-KARI antibody | Ferro et al, 2010 | Used at a 1:1000 dilution | |
| Anti-LHCP antibody | Vallon et al, 1991 | Used at a 1:25,000 dilution | |
| P-coumaric acid | Sigma | C-9008 | |
| Luminol (3-aminophalhydrazin) | Fluka | 9253 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO). | Sigma | D5879 | |
| Large (30 cm × 45 cm) plastic cases | Puteaux | 162135 | |
| A. thaliana seeds | Around 30 mg of seeds for a whole case | ||
| Compost "Floragard" | Puteaux | 16311770 | |
| Growth rooms | 12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s. | ||
| Muslin or cheesecloth | Raffin | 70116 | 80-cm-large |
| Nylon blutex 50 μm aperture | Tripette et Renaud, Sailly Saillisel | 50 μm aperture | |
| Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity | Waring Blender | ||
| Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles) | Beckman Coulter | ||
| Beckman JA-20 rotor | Beckman Coulter | ||
| JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes) | Sorvall instruments | ||
| Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes) | Beckman Coulter | ||
| SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
| SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
| Ultracentrifuge (Beckman L7) | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge (Beckman JSE-06D18) | Beckman Coulter | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf 5415D or equivalent | ||
| Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube. | |||
| Nitrocellulose membranes | BA85, Schleicher and Schuell | ||
| Filter paper | 3MM, Whatman, Maidstone | ||
| Liquid nitrogen | |||
| Peristaltic pump | Gilson | ||
| Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus). | Bio-Rad Protean 3 or equivalent | ||
| System for protein transfer to nitrocellulose membranes | Bio-Rad Protean 3 or equivalent |
References
- Zimorski, V., Ku, C., Martin, W. F., Gould, S. B. Endosymbiotic theory for organelle origins. Current Opinion in Microbiology. 22, 38-48 (2014).
- Gould, S. B., Waller, R. F., McFadden, G. I. Plastid evolution. Annual Review of Plant Biology. 59, 491-517 (2008).
- Linka, N., Weber, A. P. Intracellular metabolite transporters in plants. Molecular Plant. 3 (1), 21-53 (2010).
- Block, M. A., Douce, R., Joyard, J., Rolland, N. Chloroplast envelope membranes: a dynamic interface between plastids and the cytosol. Photosynthesis Research. 92 (2), 225-244 (2007).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Agrawal, G. K., et al. Plant organelle proteomics: collaborating for optimal cell function. Mass Spectrometry Reviews. 30 (5), 772-853 (2011).
- Chua, N. -H. [40] Electrophoretic analysis of chloroplast proteins. Methods in Enzymology. 69, 434-446 (1980).
- Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Joyard, J., Rolland, N. Purification of intact chloroplasts from Arabidopsis and spinach leaves by isopycnic centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 30 (2008).
- Ferro, M., et al. AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins. Molecular & Cell Proteomics. 9 (6), 1063-1084 (2010).
- Seigneurin-Berny, D., et al. HMA1, a new Cu-ATPase of the chloroplast envelope, is essential for growth under adverse light conditions. Journal of Biological Chemistry. 281 (5), 2882-2892 (2006).
- Vallon, O., et al. Lateral redistribution of cytochrome b6/f complexes along thylakoid membranes upon state transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8262-8266 (1991).
- Douce, R. J. J. Purification of the chloroplast. Methods in Chloroplast Molecular Biology. Edelman, M., Hallick, R. B., Chua, N. -H. , Elsevier Science Publishers BV. Amsterdam. 239-256 (1982).
- Cerovic, Z. G., Plesnicar, M. An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity. Biochemical Journal. 223 (2), 543-545 (1984).
- Kunst, L. Preparation of physiologically active chloroplasts from Arabidopsis. Methods in Molecular Biology. 82, 43-48 (1998).
- Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).
- Ling, Q., Jarvis, P. Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Seigneurin-Berny, D., Salvi, D., Dorne, A. J., Joyard, J., Rolland, N. Percoll-purified and photosynthetically active chloroplasts from Arabidopsis thaliana leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 46 (11), 951-955 (2008).
- Salvi, D., Rolland, N., Joyard, J., Ferro, M. Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments. Methods in Molecular Biology. 432, 19-36 (2008).
- Walker, D. The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis. , Oxygraphics Ltd, University of Sheffield. South Yorkshire, UK. (1990).
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Block, M. A., Dorne, A. J., Joyard, J., Douce, R. Preparation and characterization of membrane fractions enriched in outer and inner envelope membranes from spinach chloroplasts. II. Biochemical characterization. Journal of Biological Chemistry. 258 (21), 13281-13286 (1983).
- Soll, J. Phosphoproteins and protein-kinase activity in isolated envelopes of pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 166 (3), 394-400 (1985).
- Moyet, L., Salvi, D., Tomizioli, M., Seigneurin-Berny, D., Rolland, N. Preparation of Membrane Fractions (Envelope, Thylakoids, Grana, and Stroma Lamellae) from Arabidopsis Chloroplasts for Quantitative Proteomic Investigations and Other Studies. Methods in Molecular Biology. 1696, 117-136 (2018).
- Tomizioli, M., et al. Deciphering thylakoid sub-compartments using a mass spectrometry-based approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2147-2167 (2014).
- Spicher, L., Kessler, F. Unexpected roles of plastoglobules (plastid lipid droplets) in vitamin K1 and E metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 25, 123-129 (2015).
