Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت

doi: 10.3791/58594 Published: March 19, 2019
* These authors contributed equally

Summary

ونقدم استخدام بروتوكول ميشاندكوليكت للحصول على مجموعة بيانات حيود كاملة، لاستخدامها في تصميم هيكل اللاحقة، تتألف من مجموعات البيانات حيود الجزئية التي تم جمعها من العديد من بلورات صغيرة من البروتين نيون أزرق.

Abstract

علم البلورات بالأشعة السينية هو التقنية الرئيسية المستخدمة للحصول على معلومات عالية الدقة بشأن هياكل ثلاثية الأبعاد للجزيئات البيولوجية. وحتى وقت قريب، كان شرط رئيسي توافر كبيرة نسبيا، كذلك ديفراكتينج البلورات، التي غالباً ما تكون صعبة للحصول على. ومع ذلك، يعني ظهور المسلسل علم البلورات ونهضة في أساليب جمع البيانات متعددة كريستال أن التوافر بلورات كبيرة لم تعد بحاجة إلى أن عاملاً يحد. هنا، نحن لتوضيح استخدام بروتوكول ميشاندكوليكت الآلي، الذي يحدد مواقف العديد من بلورات صغيرة محمولة على حامل العينة نفسها أولاً وثم توجه جمع من البلورات سلسلة من مجموعات البيانات حيود الجزئي دمج اللاحقة واستخدامها في تصميم الهيكل. ميشاندكوليكت يمكن تطبيقها على أي نوع من مايكرو-بلورات، حتى لو كان ضعيفا ديفراكتينج. على سبيل مثال، نحن الحاضرين هنا باستخدام تقنية لحل هيكل كريستال أزرق سماوي الفلورسنت البروتين (CFP).

Introduction

الجزيئات في علم البلورات بالأشعة السينية (MX) هو، إلى حد بعيد، الأسلوب الأكثر استخداماً لاكتساب نظرة ثاقبة القرار الذري هياكل ثلاثية الأبعاد للجزيئات البيولوجية. ومع ذلك، أعناق زجاجة رئيسي هو الشرط لبلورات كبيرة نسبيا، وكذلك ديفراكتينج.

كثير من الأحيان، ولا سيما عند بلورة البروتينات الغشاء، يمكن الحصول على بلورات صغيرة جداً فقط من بضعة ميكرونات في البعد أكبر. أضرار الإشعاع الحد آثار تعيين الدقة البيانات حيود كاملة التي يمكن جمعها من كريستال الصغير واحد2، وفي كثير من الأحيان، فإنه من الضروري تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء، ومن ثم تعيين بيانات القرار، عن طريق دمج عدة مجموعات البيانات حيود جزئية من بلورات مختلفة، ولكن إيسومورفيك. الزيادات في كثافة التدفق للأشعة السينية الشعاع السنكروتروني مصادر وأماكن أخرى (مثل الأشعة السينية مجاناً-إلكترون ليزر (إكس-فيلس))، وقد يعني أنه يمكن جمع مجموعات البيانات حيود جزئية مفيدة من بلورات صغيرة جداً حتى البيولوجية الجزيئات الكبيرة. هذا، بدوره، أدى إلى تطوير تقنيات جديدة لجمع ودمج مجموعات البيانات حيود الجزئية التي تم جمعها من بلورات مختلفة كثيرة من أجل إنتاج مجموعة بيانات كاملة لهيكل الحل. هذه التقنيات يشار عادة إلى البلورات المسلسل (SX)3،4،5،6،،من78. مثال تنميط SX هو استخدام الأجهزة حاقن ﻹدخال تيار ضيقة من الملاط كريستال الأشعة السينية شعاع3،،من45. يتم تسجيل نمط حيود كل مرة يتعرض بلورة للأشعة السينية مما يؤدي إلى جمع ومن عدة آلاف من بلورات منفردة، من 'لا يزال' حيود الصور والمعلومات التي يتم دمجها ثم إنتاج مجموعة كاملة من البيانات. عيب كبير هذا النوع من جمع البيانات التسلسلية غير أن معالجة الصور الثابتة يمكن أن يمثل مشكلة. هو إلى حد كبير تحسين نوعية البيانات إذا بلورات يمكن تدويرها و/أو جمعت العديد من الصور الحيود من الكريستال نفس خلال تجارب البلوري المسلسل6.

ميشاندكوليكت1 وضعت بهدف الجمع بين SX 'قياسي' MX التناوب جمع البيانات، ويسمح، بطريقة تلقائية، المجربون تجميع مجموعات البيانات حيود جزئية من بلورات العديد من الجزيئات نفس الهدف شنت على المكلفين بعينه نفس أو مختلفة. ثم يتم الحصول على مجموعة بيانات كاملة حيود عن طريق دمج إيسومورفوس معظم مجموعات البيانات الجزئية التي تم جمعها. ميشاندكوليكت ومتوافق مع أي بيمليني الأشعة السينية السنكروتروني الدولة للفنون للإرسال المتعدد (مثالي إدراج جهاز منشأة صغيرة نسبيا (20 ميكرون أو أقل) شعاع الحجم في الموضع عينة). بالإضافة إلى تجميع مجموعات البيانات كاملة من سلسلة من بلورات صغيرة، ديفراكتينج جيدا، يكون الأسلوب أيضا مناسبة جداً لتقييم نوعية حيود الصغرى-بلورات التجريبية الأولية وتجهيز العينات معتمة، على سبيل المثال، في المتوسط نمت ميكروكريستالس من غشاء بروتينات9.

في بداية تجربة ميشاندكوليكت، تتحدد المواقف، في بعدين، كل من الكريستال كثيرة الواردة في عينة واحدة حامل باستخدام فحص بالأشعة سينية جرعة منخفضة. يتم تحليل حيود الصور التي تم جمعها خلال هذا المسح تلقائياً من البرنامج1من الإشراف، الذي يفرز مواقف البلورات على صاحب العينة طبقاً لقوتها حيود كل منهما. مواقع لتجميع مجموعات البيانات الجزئية يتم تعيينها تلقائياً استناداً إلى وقف إنتاج قوة حيود، وفي الخطوة الأخيرة، جمعت الأوتاد الصغيرة حيود البيانات، عادة دقة ± 5 ° التناوب، ومن كل موقف المختار. وقد أظهرت التجربة أن هذا النطاق تناوب يوفر كمية كافية من انعكاسات كل كريستال لمجموعة البيانات الجزئية تحجيم الأغراض، في الوقت نفسه، الحد من القضايا التوسيط كريستال ممكن وفرصة لفضح بلورات متعددة في 1من الدعم لا سيما مزدحمة. شرائح البيانات حيود الفردية (مجموعات البيانات الجزئية) ثم يتم معالجتها أما يدوياً أو باستخدام التجهيز الآلي للبيانات خطوط الأنابيب10،11،،من1213. لتحديد بنية المصب ثم اللازمة لإيجاد أفضل مزيج من مجموعات البيانات الجزئية أن تكون مدمجة14،،من1516 بعد التي يمكن علاجها مجموعة البيانات الناتجة بالكامل بنفس الطريقة كواحدة مصدرها تجربة بلورة الأحادية.

كمثال على ميشاندكوليكت في الممارسة، نقدم هنا الحل لهيكل كريستال أزرق سماوي الفلورسنت البروتين (CFP)، باستخدام مجموعة بيانات حيود شيدت من مجموعة جزئية من مجموعات البيانات التي تم جمعها من مجموعة من ميكروكريستالس شنت على نفس نموذج الدعم. قد تم تصميم أزرق من الأخضر الفلورسنت البروتين التجارة والنقل من قنديل البحر فيكتوريا أيكووريا17، الذين chromophore نيون أوتوكاتاليتيكالي يتكون من سيكليسيشن من ثلاثة متتالية من الأحماض الأمينية المخلفات. أزرق يتم الحصول عليها من التجارة والنقل بتحور البقايا الأولى والثانية في chromophore وسيرين وتيروزين، ثريونين (S65T) والتربتوفان (Y66W) على التوالي، وتكييف البيئة chromophore مع مزيد من الطفرات (Y145A، N146I، H148D، M153T و V163A) لإنتاج مستوى الأسفار هامة، ولكن دون الحد الأمثل لكي = 0.4918،،من1920. الخصائص الفلورية دون المستوى الأمثل من أزرق قد اقترحت أن تكون مرتبطة إلى ديناميات البروتين المعقدة التي تنطوي على استقرار ناقص واحد من أحد عشر بيتا-خيوط بروتين21 وإلى أماكن chromophore مختلفة اثنين ايزومرات تبعاً لظروف الأس الهيدروجيني وتشعيع22. لقد اخترنا العمل مع أزرق بروتين نموذجية التي توضح استخدام بروتوكول ميشاندكوليكت المقرر أن سهولة نسبيا لضبط حجم البلورة تبعاً للبلورة. هيكل أزرق مشابهة جداً لأن في الأصل بروتين بروتينات فلورية خضراء، كما أنها تتألف من β-برميل مكونة من أحد عشر بيتا-خيوط المحيطة اللولب α، يحمل chromophore.

Protocol

1-التعبير وتنقية أزرق

ملاحظة: يستند هذا البروتوكول نشرتها ليليموسين et al. 21

  1. أعرب صاحب معلم أزرق في الإشريكيّة القولونية BL21 الخلايا التي نمت في 37 درجة مئوية في 4 لتر من السيارات المتوسطة إيندوسيبلي23 حتى OD600= 1 ومن ثم تبني بين عشية وضحاها في 27 درجة مئوية.
  2. حصاد الخلايا البكتيرية في س 5,000 ز و عبر الخلايا سونيكيشن (40 ٪، 5 دقائق، نبض ق 10، 10 s وقفه) في 200 مل من المخزن المؤقت وتتألف من 20 مم تريس pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم و 1 × مثبطات البروتياز يدتا خالية.
  3. تحميل المادة طافية على عمود صاحب فخ ني-الإدارة الوطنية للسياحة والوت أزرق مع ايميدازول 100 ملم في نفس الظروف المخزن المؤقت.
  4. تجمع الكسور ملونة صفراء زاهية. البروتين هو اللون جوهريا، ومن ثم الكسور التي تحتوي على أزرق يمكن تمييزها بسهولة.
  5. تنقية البروتين (4 مل) على عمود S75 في 20 مم تريس pH 8.0.
  6. تجمع الكسور صفراء زاهية وتركز الحل البروتين إلى 15 ملغ/مل.

2-تبلور

  1. استخدم قطره معلقة بخار نشر تقنية24 في 20 درجة مئوية في لوحات لينبرو. سد الآبار مع 1 مل حل مرسب تتألف من 100 ملم حبيس في درجة الحموضة 6.75، 12% PEG8000 و 100 ملم مجكل2- لقطرات شنقاً، تتركز ميكس 1 ميليلتر من البروتين إلى 15 مغ/مل مع 1 ميليلتر من مرسب الحل. يجب أن تظهر البلورات في 24 ساعة.
  2. الحصاد الحصول على البلورات ونقل منها إلى 100 ميليلتر من المخزن المؤقت بذر تتألف من 0.1 م حبيس الأس الهيدروجيني 6.75، ربط 22% 8000.
  3. طحن البلورات مع طاحونة أنسجة 0.1 مل وتمييع في بذر المخزن المؤقت (نسبة 1: 100).
  4. هضم قاسمة حل البروتين المخزون (15 ملغ/مل) مع التربسين (0.5 ملغ/مل في المخزن المؤقت لنفسه) ح 1 (01:10 (v/v)).
  5. مزيج الحل هضم البروتين بنسبة 10% من البذور التي تحتوي على المخزن المؤقت (v/v).
  6. تنمو بلورات (10 * 10 * 20 ميكرومتر3) ربط 14% في م 0.1 هيبيس الأس الهيدروجيني 7، 8000، 0.1 مجكل2 في 1-1.5 ميكروليتر شنقاً قطرات استخدام أسلوب نشر بخار.

3. الكريستال المتصاعدة

  1. استخدم حلقة مناسبة، مثلاً، حلقة 700 مش ثقوب مربعة لكل 25 ميكرومتر التي شنت على صاحب عينة قياسية العمود الفقري25. نقل بلورات من إسقاط تبلور (2.6 خطوة) إلى 1 ميليلتر من كريوبروتيكتانت الحل (حل جيد مرسب مختلطة مع الجلسرين (20% v/v النهائي)).
  2. جبل الملاط كريستال البروتين على حلقة مش عن طريق تحريك الحلقة تحت البلورات ورفعها من الانخفاض. ومن الناحية المثالية ينبغي أن تكون البلورات في نطاق حجم 5 ميكرون – 30 ميكرومتر في أقصى البعد مع عدم وجود تداخل بين بلورات شنت في الحلقة.
  3. فتيلة قبالة السائل الزائد بلمس جبل بسرعة مع أوراق الترشيح. الرواسب البلورات حتى أن كانوا يجلسون في طائرة حلقة محاطة بسائل السائبة أقل قدر الإمكان.
  4. يغرق في الجبل في أونيبوك كامل من النتروجين السائل. تخزين عفريت في ك 100 في حاوية تخزين مناسبة حتى يتوفر الوقت شعاع.

4-حاليا إعداد التجربة السنكروتروني

ملاحظة: طلب السنكروتروني شعاع الوقت مبكرا قدر الإمكان واتبع المبادئ التوجيهية على الإنترنت لأنواع الوصول المتاحة وكيفية تقديم طلب السنكروتروني معين. ويمكن الاطلاع على المبادئ التوجيهية أسرف في http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. إذا كان عضو من أسرف كتلة تخصيص المجموعة (حقيبة)، طلبا لكل مشروع معين غير مطلوب. وفي هذه الحالة ينبغي أن نهج المجربون المسؤولين حقيبة بها فيما يتعلق بجدولة الوقت شعاع.

  1. بعد أن يتم قبول هذا الاقتراح، وهو تلقي دعوة للتجربة، بجميع المشاركين إكمال التدريب على السلامة. ملء "A-النموذج" (عن طريق المدخل المستخدم أسرف، http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) مع معلومات الأمان المطلوبة على العينات. اتصل بالشخص المسؤول المحلي لمناقشة التجربة. بمجرد مقدم أ-النموذج الخاص بك والتحقق من صحة سوف تعطيك عدد التجربة وكلمة المرور.
  2. الاتصال الموسعة إيسبيب26 (http://www.esrf.fr/) واختر MX.
  3. تسجيل الدخول باستخدام رقم التجربة وكلمة المرور من A-النموذج.
  4. حدد الشحنة | إضافة جديدة وتعبئة المعلومات المطلوبة.
  5. حدد إضافة قطعة وملء البيانات ذات الصلة. حدد حاوية إضافةواختر أونيبوك وتعبئة المعلومات المطلوبة، بما في ذلك مواقف المكلفين بعينه في عفريت.

5-تحميل من العينة على بيمليني

  1. في القفص التجريبية، تحميل عفريت في المغير عينة (SC) ديوار وملاحظة موقفها.
  2. التعشيق المقصورة التجريبية وأدخل القفص التحكم.
  3. تسجيل الدخول إلى إيسبيب (https://esrf.fr/). حدد إعداد التجربةوالعثور الشحنة وحدد التالي وتشير إلى بيمليني وموقف عفريت في المحكمة العليا.
  4. تسجيل الدخول إلى البرنامج التحكم بيمليني، هنا MXCuBE227،28 مع عدد تجريبي وكلمة المرور المقدمة في أ-استمارة.
    1. اضغط المزامنة لمزامنة برنامج حاسوبي لمراقبة بيامليني مع قاعدة البيانات إيسبيب.
  5. استخدام برمجيات التحكم بيمليني، لتحميل صاحب العينة على جونيوميتير. في MXCuBE2، موقعا في منطقة المغير نموذج انقر فوق الحق وحدد نموذج جبل.
  6. الاستفادة من جونيوميتير كابا المصغر MK329 مثبتة في معظم من بيملينيس MX أسرف، استخدام MXCuBE2 في "إعادة تنظيم المرئي" سير العمل30 لمحاذاة الطائرة لصاحب العينة مع محور دوران جونيوميتير.
    1. حدد الزر المركز ، مركز ثم فوق 3 في منتصف الحافة من غيض الحلقة. إنقاذ الموقف الوسط عن طريق اختيار حفظ.
    2. انقر مرة أخرى على زر المركز ، ثم 3-انقر فوق مركز وسط بداية تنبع الحلقة. إنقاذ الموقف الثاني، وكذلك بالنقر فوق حفظ.
    3. حدد أحد المواقع تركزت المحفوظة عن طريق النقر عليه.
    4. تحت خيارات متقدمة، إضافة البصرية إعادة توجيه سير العمل إلى قائمة انتظار جمع البيانات MxCuBE2.
    5. بدء تشغيل سير العمل عن طريق النقر على جمع قائمة الانتظار.
    6. وبعد سير العمل بمحاذاة الطائرة لصاحب العينة مع محور دوران في جونيوميتير، مركز صاحب العينة مرة أخرى، هذه المرة في مكان ما في وسط الشبكة.
  7. توجيه صاحب العينة حيث أن وجه الشبكة عمودي على اتجاه شعاع الأشعة السينية بتدوير المحور أوميغا باستخدام MXCuBE2.
  8. في MXCuBE2، حدد حجم الحزمة المطلوبة لفحص صاحب العينة (فقط من أجل بيملينيس مع حجم الحزمة متغير).
    1. انقر فوق المنسدلة القائمة في برامج التحكم بيمليني الفتحة وحدد القيمة، مثلاً، 10 ميكرون.
  9. تعريف شبكة لمسح الشبكة.
    1. انقر على أيقونة الأداة الشبكة في MXCuBE2. سوف تظهر نافذة أداة شبكة.
    2. في طريقة العرض نموذج من MXCuBE2، رسم عيون بترك النقر والسحب الماوس فوق المنطقة التي تحتوي على بلورات على صاحب العينة.
    3. لحفظ الشبكة انقر فوق الزر زائد في الإطار أداة شبكة (شبكة يصبح الأخضر).

6-إعداد وتنفيذ سير العمل ميشاندكوليكت

  1. في ميدان القرار MXCuBE2، أدخل القرار (ددقيقة) في أي حيود ينبغي جمع الصور، مثلاً، هنا 1.8 Å.
  2. حدد ميشاندكوليكت في التبويب خيارات متقدمة جمع البيانات وإضافتها إلى قائمة الانتظار وانقر فوق تجميع قائمة الانتظار.
  3. في نافذة معلمة الذي يظهر، استخدم المعلمات الافتراضية تعتمد بيمليني. في التجربة الموصوفة هنا افتراضيات المعلمات وقت التعرض s 0.037 كل نقطة شبكة المسح الضوئي، نقل 100% (يؤدي في هذه الحالة إلى درجة الحموضة 4 × 1011 /s)، التذبذب 1 ° كل خط مسح الشبكة.
  4. انقر فوق جأونتينوي. تشغيل التفحص الشبكة وتحليل الصور حيود جمعها عند كل نقطة من نقاط الشبكة والمرتبة وفقا لقوة حيود مع برنامج الإشراف1. تعمل هذه العملية في الخلفية.
  5. يتم إنشاء مخطط حرارة بعد تحليل الإشراف ويتم تعيين الأمر لمجموعات البيانات الجزئية اللاحقة تلقائياً استناداً إلى قوة الحيود (انظر الشكل 1).
    ملاحظة: يمكن أن تفقد نتائج هذه الخطوة أيضا في إيسبيب. لمجموعة مجموعات البيانات الجزئية علامة تبويب جديدة مع الإعدادات للملوثات العضوية الثابتة في برامج التحكم بيمليني وتحديد القيم المناسبة لتناوب النطاق (أي، 0.1 °)، عدد الصور (أي، 100)، وقت التعرض، والقرار، انتقال، شعاع معكوس إلخ من الناحية المثالية ينبغي أن تكون الجرعة لكل آسفين يتعين جمعها أقل من الحد. ماهر جرمان (30 مجي). الوقت التقريبي تعرض كل صورة هو 0.037 ثانية إلى 0.1 s في وصف الظروف التجريبية.
  6. انقر فوق متابعة لبدء تشغيل مجموعات البيانات الجزئية.

7-معالجة البيانات

ملاحظة: مجموعات بيانات جزئية تتكامل مع برنامج مناسب (XDS10). لهذا سيتم استخدام نصي بايثون أن تسلم كل مجموعة البيانات الفردية، ويدمج ذلك ويتأكد من أن الفهرسة بين مختلف مجموعات البيانات الجزئية يتسق.

  1. افتح المجلد الذي يحتوي على الصور:/data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.
  2. قم بإنشاء نسخة أمان المجلد الفرعي العملية التي يمكن العثور عليها في المجلد حيث يتم تجميع مجموعات البيانات الجزئية.
    1. المحطة الطرفية لينكس، استخدم الأمر cp-r عملية process_backup.
  3. انتقل إلى المجلد العملية والشروع في معالجة البرنامج النصي.
    1. المحطة الطرفية لينكس، اكتب الأمر عملية نزع السلاح وهاهنا.
    2. نوع بروكمولتيكريستالداتا وضرب أدخل.
      ملاحظة: سوف يطلب البرنامج النصي لمجموعة الفضاء ومعلمات الخلية (هذه المعلومات اختيارية)، أدخل تلك وفقا للتعليمات. وبعد تأكيد مستخدم الأخير، سيتم تشغيل البرنامج النصي تلقائياً.

8-دمج مجموعات البيانات

ملاحظة: بعد أن تتكامل جميع مجموعات البيانات الجزئية يتم دمج أفضل مزيج منها لإنتاج مجموعة البيانات النهائية لاستخدامها في تصميم هيكل والصقل. يمكن أن تكون الأهداف المختلفة لعملية الدمج هذه للحصول على كامل كمال (ينصح)، وتعدد عالية أو أفضل البيانات والإحصاءات (عالية < I/σ(I) > R منخفضة-العوامل، إلخ). هذه الأخيرة تكون أحياناً على حساب اكتمال و/أو تعدد حيث يجب اختيار هذا الخيار بعناية.

  1. دمج مجموعات البيانات الجزئية باستخدام برنامج كككلوستير14. ويستخدم تحليل الكتلة الهرمية (HCA) لتحديد مزيج ممكن من مجموعات البيانات الجزئية إيسومورفوس ().
    1. اكتب كككلوستير في المحطة الطرفية ل Unix لفتح واجهة المستخدم الرسومية (GUI).
      ملاحظة: في واجهة المستخدم الرسومية كككلوستير يتم رسمها ديندروجرام. وهذا يعطي اقتراح فيها دمج مجموعات البيانات الجزئية قد تكون أفضل استناداً إلى تماثل بينهما.
    2. انقر فوق عقده الذي يتوافق مع قيمة حول 0.4 على المحور العمودي. عموما، سوف تتضمن قيم أعلى البيانات الجزئية أكثر مجموعات بل يؤدي إلى أسوأ من ذلك دمج الإحصاءات حسب مجموعات جزئية من البيانات سوف تكون أقل إيسومورفوس.
    3. انقر فوق دمج البيانات. ستتم معالجة الكتلة المحددة في الخلفية، ودمج الإحصاءات التقديرية سوف تظهر في علامة تبويب جديدة في واجهة المستخدم الرسومية. يمكن تكرار هذه الخطوة لمجموعات مختلفة من مجموعات البيانات. ينبغي أن يكون الاكتمال لمزيج جيد من مجموعات البيانات الجزئية ما يقرب من 100 ٪، < I/σ(I) > القيم العالية (10 أو أعلى في شل القرار أدنى) وانخفاض قيم31 R-الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (حوالي 5 في المائة في شل القرار منخفض).
  2. لكل مجموعة بتحديد استخدام إدخال البرنامج النصي الذي تم إنشاؤه لدمج مجموعات البيانات الجزئية المختارة في ملف mtz واحدة (أي، لا طائل32).
  3. نهائياً مقياس ودمج البيانات الموجودة كثافة في هذا الملف باستخدام برنامج قياس (أي، بلا هدف32)، وعند مع ملف مصدرها مجموعة بيانات بلورة الأحادية، الاستخدام الإخراج لمراحل لاحقة وهيكل الحل33 .

Representative Results

ميشاندكوليكت، كما نفذت في MXCuBE2 (انظر الشكل 1A)، واستخدمت لجمع مجموعات البيانات حيود جزئية من بلورات صغيرة من أزرق يقع على صاحب العينة نفسها التي كان من الصعب التعرف البصري من بلورات. إلى الشاشة صاحب العينة، نحن وجه شبكة أكثر مركز ميشلوب (انظر الشكل 1B) وعلى الإشراف أساس درجة الحرارة خريطة حيود جزئية 85 (انظر الأرقام 1، 1 د) تم تجميع مجموعات البيانات تلقائياً. هذه أدمجت على حدة ثم دمجها (انظر أعلاه) لإنتاج مجموعة من البيانات مع اكتمال 99.8% في ددقيقة = 1.7Å (انظر الجدول 1). وكان نصف مجموعة الارتباط (ج ج1/2)34 في شل القرار أعلى 60% (= 4.7). كما هو متوقع، يمكن حلها هيكل كريستال أزرق مستقيم باستبدال الجزيئي33 مجموعة البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام. بعد الصقل، حصلنا البحث والتطويرالعمل 22.8 في المائة و Rالحرة 25.4 في المائة. يظهر تراكب مع هيكل سبق تحديدها (PDB دخول 2WSO21) رمسد عالمية على مواقفα C 0.1.

إحصائيات مجموعة البيانات المدمجة
تجميع عتبة 0.35
عدد من مجموعات البيانات الجزئية 25
مجموعة الفضاء P212121
وحدة الخلية (أ، ب، ج) 50.98، 62.76، 69.50
نطاق القرار 46.58-1.70 (1.73-1.70)
رميرجي (كل أنا + وأنا-) 0.133 (0.743)
رميس (جميع أنا + & أنا-) 0.142 (0.813)
ربيم (جميع أنا + & أنا-) 0.047 (0.318)
مجموع الملاحظات الفريدة 220693/25129
Mean((I)/sd(I)) 13.8 (4.7)
ارتباط مجموعة نصف Mn(I) CC(1/2) 0.994 (0.602)
كمال 99.8 (99.5)
تعدد 8.8 (6.5)
النهائي Rكريست 22.8
النهائي Rمجاناً 25.4

الجدول 1: جمع إحصاءات مجموعة البيانات المدمجة التي تشير إلى الجودة العالية للبيانات.

Figure 1
رقم 1: استخدام ميشاندكوليكت لجمع مجموعة من مجموعات البيانات الجزئية من مجموعة من البلورات الصغيرة الواردة في نفس حامل عينة- A) واجهة المستخدم من MXCuBE2. البيضاوي الأخضر أكثر من مجال عارض على محور يشير إلى الأداة الشبكة. ب) مع أنه يسترعى شبكة على الصورة صاحب العينة في الحقل صورة الحياة. خريطة ج) الحرارة درجات الإشراف. د) مثال لصورة الحيود. ﻫ) ديندروجرام بعد تحليل مجموعة هرمية. واستخدمت لدمج مجموعات البيانات باللون الأحمر. و) الهيكل الشامل لازرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

نجاح تجربة MX يتوقف عادة على وجود كبير نسبيا، كذلك ديفراكتينج بلورات. للمشاريع حيث يفشل الأمثل من الاستحمام كريستال صغيرة لبلورات أكبر، ميشاندكوليكت يوفر إمكانية الحصول على مجموعة بيانات حيود كاملة لهيكل الحل عن طريق المزيج من إيسومورفوس مجموعات البيانات الجزئية التي تم جمعها من سلسلة من بلورات صغيرة. الأسلوب متوافق مع بيملينيس السنكروتروني ل MX، مثالي مع تدفق فوتون عالية وقطرها شعاع صغيرة، مجهزة بأحدث جهاز ديفراكتوميتير وجهاز كشف قراءات سريعة. في هذه محطة نهاية، سيستغرق الجزء جمع البيانات من هذه التجربة حوالي 20 دقيقة، اعتماداً على العدد مجموعات البيانات الجزئية التي سيتم جمعها وعدد أصحاب العينة التي تحتوي على كريستال يتم تحليلها.

هو وجود عدد كاف من أهم شرطا أساسيا لنجاح تجربة ميشاندكوليكت (على الأقل 50، 100 مثالي) من ديفراكتينج مناصب على صاحب العينة. من الخبرة، ينبغي أن يكون الحد الأدنى لحجم البلورات إلى تحليل حوالي 5 ميكرومتر في البعد أصغر. الأسلوب متوافق مع أي نوع من البرد والتبريد قياسي متوافق عينة أصحاب مع أفضل النتائج ويجري تحقيقه باستخدام مش يتصاعد جامدة ومستقيمة.

وينفذ في أسرف، ميشاندكوليكت بطريقة سهلة الاستعمال في Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) سير عمل30 متاحة من برامج التحكم بيامليني MXCuBE2. ميزة كبيرة من ميشاندكوليكت مقارنة بالأساليب الأخرى SX هو أن البيانات التي يتم جمعها يمكن معالجتها بواسطة البرامج القياسية والآلي خطوط الأنابيب المستخدمة لبلورة أحادية الإرسال المتعدد.

كما يبين المثال الخاص بنا، فمن السهل جداً لتطبيق ميشاندكوليكت ويؤدي إلى سلسلة من مجموعات البيانات حيود الجزئية، وعادة ما تجمع من البلورات الصغيرة، التي يمكن دمجها لإنتاج مجموعة كاملة من البيانات لاستخدامها في بنية الحل. وعلاوة على ذلك، ميشاندكوليكت لديه القدرة على فتح مساحة أخذ العينات من البروتين البلوري حيث أنه يوفر وسيلة لجمع بيانات قابلة للاستخدام من المحاكمات تبلور فيها آخر خطوة التحسين، إنتاج بلورات كبيرة، غير ناجحة.

في ضوء التطورات الراهنة نحو أكثر إشراقا من مصادر الأشعة السينية (مثلاً، الغاية الرائعة المصدر (EBS) أسرف المشروع/35) فمن المنتظر أن سبب الضرر زيادة الإشعاع، يسرت نوع جمع البيانات متعددة الكريستال قبل ميشاندكوليكت سوف تصبح الطريقة القياسية لجمع البيانات، بدلاً من استثناء – كما الحال-في بياملينيس MX السنكروتروني القائم حاليا.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

ونحن نشكر أسرف لتوفير الوقت شعاع من خلال برنامج البحوث الداخلية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
aimless MRC Laboratory of Molecular Biology Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccCluster ESRF Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). local development
DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
MXCuBE2 ESRF Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). local development
XDS Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71, (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241, (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2, (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1, (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1, (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71, (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409, (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43, (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46, (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50, (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72, (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22, (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Biochemistry. 48, (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Biochemistry. 56, (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. Elsevier/Academic Press. Amsterdam; Boston. (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62, (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27, (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69, (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336, (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022). The orange book. (2015).
بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).More

Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter