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Biochemistry

MeshAndCollect का उपयोग कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेरुलियन की संरचना समाधान

doi: 10.3791/58594 Published: March 19, 2019
* These authors contributed equally

Summary

हम एक पूरा विवर्तन डेटा सेट प्राप्त करने के लिए, अनुवर्ती संरचना निर्धारण में उपयोग के लिए, आंशिक द्विवर्तन डेटा फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेरुलियन के कई छोटे क्रिस्टल से एकत्र सेट से बना meshandcollect प्रोटोकॉल का उपयोग वर्तमान ।

Abstract

एक्स-रे क्रिस्टलीय प्रमुख तकनीक जैविक macromolecules के 3 आयामी संरचनाओं के विषय में उच्च संकल्प जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हाल ही में जब तक, एक प्रमुख आवश्यकता अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल, जो अक्सर प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है की उपलब्धता रहा है । हालांकि, धारावाहिक क्रिस्टलीय के आगमन और बहु में एक पुनर्जागरण-क्रिस्टल डेटा संग्रह विधियों का मतलब है कि बड़े क्रिस्टल की उपलब्धता अब एक सीमित कारक होना चाहिए । यहां, हम स्वचालित MeshAndCollect प्रोटोकॉल है, जो पहले कई छोटे क्रिस्टल की स्थिति की पहचान एक ही नमूना धारक पर घुड़सवार के उपयोग को समझाने और फिर के लिए आंशिक भिंन डेटा सेट की एक श्रृंखला के क्रिस्टल से संग्रह निर्देश अनुवर्ती विलय और संरचना निर्धारण में उपयोग करें । MeshAndCollect माइक्रो क्रिस्टल के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है, भले ही कमजोर डिफफ्रैक्टिंग । एक उदाहरण के रूप में, हम यहां पेश करने के लिए तकनीक का उपयोग करने के लिए Cyan फ्लोरोसेंट प्रोटीन की क्रिस्टल संरचना (CFP) सेरुलियन हल ।

Introduction

Macromolecular एक्स-रे क्रिस्टललेखी (MX), दूर से, जैविक macromolecular के तीन आयामी संरचनाओं में परमाणु संकल्प अंतर्दृष्टि पाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है । हालांकि, एक प्रमुख बोतल गर्दनें अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से डिफफ्रैक्टिंग क्रिस्टल के लिए आवश्यकता है ।

अक्सर, और विशेष रूप से जब झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकरण, सबसे बड़ा आयाम में कुछ माइक्रोन के केवल बहुत छोटे क्रिस्टल प्राप्त किया जा सकता है । विकिरण क्षति प्रभाव एक पूर्ण विवर्तन डेटा सेट है कि एक एकल माइक्रो क्रिस्टल2से एकत्र किया जा सकता है के संकल्प की सीमा, और बहुत बार, यह शोर अनुपात करने के लिए संकेत में सुधार करने के लिए आवश्यक है और इसलिए डेटा सेट संकल्प, कई विलय द्वारा आंशिक अलग से डेटा सेट, लेकिन समरूपी क्रिस्टल । सिंक्रोट्रॉन स्रोतों और कहीं पर एक्स-रे बीम के फ्लक्स घनत्व में वृद्धि ( एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर्स (एक्स-fels)), मतलब है कि उपयोगी आंशिक विवर्तन डेटा सेट जैविक के भी बहुत छोटे क्रिस्टल से एकत्र किया जा सकता है अणुओं. यह, बारी में, संग्रह और आंशिक विवर्तन डेटा के विलय के लिए नई तकनीकों के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है कई अलग क्रिस्टल से एकत्र की संरचना समाधान के लिए एक पूरा डेटा सेट का उत्पादन करने के क्रम में । ऐसी तकनीकों को सामान्यतः धारावाहिक क्रिस्टललेखी (SX)3,4,5,6,7,8के रूप में संदर्भित किया जाता है । एसएक्स का एक प्रोटोटाइप उदाहरण एक्स-रे बीम3,4,5में एक क्रिस्टल घोल की एक संकीर्ण धारा शुरू करने के लिए सुई लगानेवाला उपकरणों का उपयोग है । एक विवर्तन पैटर्न हर बार रिकॉर्ड किया जाता है एक क्रिस्टल एक्स-किरणों को उजागर करने के लिए अग्रणी है संग्रह करने के लिए, व्यक्तिगत क्रिस्टल के कई हजारों से, ' अभी भी ' विवर्तन छवियों, जानकारी है जो फिर एक पूरा डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए विलय कर दिया है । हालांकि, धारावाहिक डेटा संग्रह के इस प्रकार का एक काफी नुकसान है कि अभी भी छवियों के प्रसंस्करण समस्याग्रस्त किया जा सकता है । आंकड़ों की गुणवत्ता में काफी सुधार हुआ है यदि क्रिस्टल घुमाया जा सकता है और/सीरियल क्रिस्टलीय प्रयोगों6के दौरान एक ही क्रिस्टल से कई डिफक्शन छवियों एकत्र कर रहे हैं ।

MeshAndCollect1 ' मानक ' एमएक्स रोटेशन डेटा संग्रह के साथ एसएक्स के संयोजन के उद्देश्य के साथ विकसित किया गया था और अनुमति देता है, एक स्वचालित फैशन में, एक ही macromolecular लक्ष्य के कई क्रिस्टल से आंशिक डिफक्शन डेटा सेट इकट्ठा करने के लिए experimenters एक ही या अलग नमूना धारकों पर घुड़सवार । एक पूर्ण विवर्तन डेटा समुच्चय तब एकत्र किए गए आंशिक डेटा समुच्चयों के अधिकांश समरूपी विलयन द्वारा प्राप्त किया जाता है । meshandcollect एमएक्स के लिए किसी भी राज्य के-the-कला सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे बीमलाइन के साथ संगत है (आदर्श रूप में नमूना स्थिति पर एक अपेक्षाकृत छोटे (20 μm या कम) बीम आकार के साथ एक प्रविष्टि डिवाइस सुविधा). लघु के एक श्रृंखला से पूरा डेटा सेट के संकलन के अलावा, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल, विधि भी बहुत सूक्ष्म क्रिस्टल के difअपवर्तन गुणवत्ता के प्रारंभिक प्रयोगात्मक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है और अपारदर्शी नमूनों के प्रसंस्करण के लिए, उदाहरण के लिए, मेसो में झिल्ली प्रोटीन के microक्रिस्टलों9

एक MeshAndCollect प्रयोग के शुरू में, पदों, दो आयामों में, एक ही नमूना धारक में निहित कई क्रिस्टल में से प्रत्येक के एक कम खुराक एक्स-रे स्कैन का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं । इस स्कैन के दौरान एकत्र द्विवर्तन छवियों को स्वचालित रूप से प्रोग्राम DOZOR1, जो नमूना धारक पर क्रिस्टल की स्थिति उनके संबंधित अलग अलग शक्ति के अनुसार प्रकार द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । आंशिक डेटा सेट के संग्रह के लिए स्थितियां स्वचालित रूप से एक विवर्तन शक्ति कट-ऑफ़ के आधार पर असाइन की जाती हैं और अंतिम चरण में, विवर्तन डेटा के छोटे wedges, सामान्यतया ± 5 का ° रोटेशन, प्रत्येक चुनी गई स्थिति से एकत्रित किए जाते हैं. अनुभव से पता चला है कि इस रोटेशन रेंज आंशिक डेटा के लिए क्रिस्टल प्रति प्रतिबिंब की एक पर्याप्त राशि प्रदान करता है स्केलिंग प्रयोजनों के सेट, जबकि एक ही समय में, संभव को कम करने के क्रिस्टल केंद्रित मुद्दों और एक में कई क्रिस्टल को उजागर करने का मौका विशेष रूप से भीड़ समर्थन1। इसके बाद व्यक्तिगत रूप से या तो मैन्युअल रूप से या स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइन10,11,12,13का उपयोग कर संसाधित कर रहे हैं । डाउनस्ट्रीम संरचना निर्धारण के लिए यह तो14,15,16 विलय किया जा करने के लिए आंशिक डेटा सेट का सबसे अच्छा संयोजन खोजने के लिए आवश्यक है जिसके बाद परिणामस्वरूप पूरा डेटा सेट उसी तरह से इलाज किया जा सकता है एक एकल क्रिस्टल प्रयोग से उद्भव के रूप में ।

व्यवहार में meshandcollect का एक उदाहरण के रूप में, हम यहां cyan फ्लोरोसेंट प्रोटीन (cfp) cerulean के क्रिस्टल संरचना का समाधान वर्तमान, एक की श्रृंखला से एकत्र आंशिक डेटा सेट के संयोजन से निर्मित एक विवर्तन डेटा सेट का उपयोग एक ही नमूना समर्थन पर घुड़सवार माइक्रोक्रिस्टल । सेरुलियन जेलिफ़िश aequorea विक्टोरिया17से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) से इंजीनियर किया गया है, जिसका फ्लोरोसेंट वर्णमूलक autoउत्प्रेरक तीन लगातार अमीनो एसिड अवशेषों के चक्रीकरण से बना है । सेरुलियन, क्रोमोफोर, सेरीन और टाइरोसीन के पहले और दूसरे अवशेषों को क्रमशः थ्रिटोनिन (S65T) और ट्रिप्टोफेन (Y66W) के रूप में रूपांतरित करके जीएफपी से प्राप्त किया जाता है और इसके आगे के उत्परिवर्तनों के साथ क्रोमोफोर वातावरण को अनुकूल (Y145A, N146I, H148D, M153T और V163A) का उत्पादन करने के लिए एक महत्वपूर्ण, अभी तक सबऑप्टिमल प्रतिदीप्ति स्तर qy = ०.४९18,19,20। सेरुलियन के सबऑप्टिमल फ्लोरोसेंट गुणों को जटिल प्रोटीन गतिशीलता से जोड़ने का प्रस्ताव किया गया है, जिसमें प्रोटीन की ग्यारह β-किस्में में से एक के अपूर्ण स्थिरीकरण और दो भिन्न क्रोमोफोर के आवास को शामिल किया गया है । आइसोमर पीएच और विकिरण की स्थिति22पर निर्भर करता है । हम एक मॉडल प्रोटीन के रूप में Cerulean के साथ काम करने के लिए चुना क्रिस्टल आकार ट्यूनिंग क्रिस्टलीकरण के आधार पर अपेक्षाकृत आसानी के कारण MeshAndCollect प्रोटोकॉल का उपयोग illustrating । सेरुलियन की संरचना बहुत ही अपने मूल प्रोटीन जीएफपी के समान है, क्योंकि यह एक β-बैरल का गठन एक α-हेलिक्स, जो क्रोमोफोर भालू के आसपास ग्यारह β-किस्में का गठन किया है ।

Protocol

1. अभिव्यक्ति और सेरुलियन की शुद्धि

नोट: यह Lelimousin एट अल द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित है । 21

  1. एक्सप्रेस अपने-Escherichia कोलाई BL21 कोशिकाओं में Cerulean ऑटो inducible मध्यम23 के 4 एल में ३७ डिग्री सेल्सियस पर हो गया जब तक ओडी६००= 1 और फिर 27 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते ।
  2. फसल ५,००० एक्स जी पर बैक्टीरियल कोशिकाओं और लाइसे sonication के माध्यम से कोशिकाओं (४०%, 5 मिनट, 10 एस पल्स, 10 एस थामने) बफर के २०० मिलीलीटर में 20 मिमी Tris पीएच ८.०, ५०० मिमी nacl और 1x edta-मुक्त protease अवरोधकों के शामिल.
  3. एक अपने जाल नी-NTA कॉलम और एक ही बफर परिस्थितियों में १०० मिमी imidazole के साथ elute सेरुलियन पर supernatant लोड ।
  4. चमकीले पीले रंग के भागों पूल । प्रोटीन आंतरिक रूप से रंग का होता है, इसलिए सीरूलीन-युक्त अंशों को आसानी से पहचाना जा सके ।
  5. एक S75 कॉलम में 20 मिमी Tris पीएच ८.० पर प्रोटीन (4 मिलीलीटर) शुद्ध ।
  6. चमकीले पीले भागों पूल और 15 मिलीग्राम/एमएल के लिए प्रोटीन समाधान ध्यान केंद्रित ।

2. क्रिस्टलीकरण

  1. लिब्रो प्लेट्स में 20 डिग्री सेल्सियस पर हैंगिंग ड्रॉप वाष्प प्रसार तकनीक24 का प्रयोग करें । १०० पीएच ६.७५, 12% PEG8000 और १०० मिमी mgcl 2 में से मिलकर एक अवक्षेपक समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ कुओं भरें फांसी की बूंदों के लिए, प्रोटीन का 1 μL मिश्रण 15 मिलीग्राम/एमएल के साथ 1 μL अवक्षेपवर्ती समाधान । क्रिस्टल 24 ज में दिखाई देना चाहिए ।
  2. फसल क्रिस्टल प्राप्त की और उंहें १०० μL के लिए स्थानांतरण ०.१ मीटर HEPES पीएच ६.७५, 22% खूंटी ८००० के शामिल एक बोने बफर की ।
  3. एक ०.१ मिलीलीटर ऊतक चक्की और बोने की मशीन बफर (अनुपात 1:100) में पतला के साथ क्रिस्टल पीस ।
  4. 1 ज (1:10 (v/v)) के लिए ट्रिप्सिन (०.५ mg/mL) के साथ प्रोटीन स्टॉक सॉल्यूशन (15 एमजी/एमएल) के एक aliquot को पचाना ।
  5. बीज युक्त बफर (वी/वी) के 10% के साथ पचा प्रोटीन समाधान मिलाएं ।
  6. क्रिस्टल बढ़ाएँ (10 * 10 * 20 μm3) में ०.१ मीटर Hepes pH 7, 14% खूंटी ८०००, ०.१ MgCl2 में 1-1.5 μl हैंगिंग बूँदें वाष्प प्रसार विधि का उपयोग कर.

3. क्रिस्टल बढ़ते

  1. एक उपयुक्त पाश, उदाहरण के लिए , एक जाल पाश ७०० 25 μm के वर्ग छेद प्रत्येक एक रीढ़ मानक नमूना धारक25पर घुड़सवार का प्रयोग करें । क्रिस्टलीकरण ड्रॉप से क्रिस्टल स्थानांतरण (चरण २.६) cryoprotectant समाधान के 1 μL में (अच्छी तरह से प्रेसिलटेंट ग्लिसरोल के साथ मिश्रित समाधान (20% v/
  2. क्रिस्टल के नीचे पाश चलती है और उन्हें बाहर निकालने के द्वारा एक जाल पाश पर प्रोटीन क्रिस्टल घोल माउंट. आदर्श रूप में क्रिस्टल के बीच कोई ओवरलैप के साथ अधिकतम आयाम में 5 μm-30 μm के आकार सीमा में होना चाहिए लूप में घुड़सवार ।
  3. फिल्टर कागज के साथ जल्दी से माउंट छू द्वारा अतिरिक्त तरल बाती । तलछट क्रिस्टल इतना है कि वे पाश के विमान में बैठने के रूप में संभव के रूप में छोटे थोक तरल से घिरा हुआ है ।
  4. माउंट को तरल नाइट्रोजन से परिपूर्ण एक एकपक में डुबो कर । एक उपयुक्त भंडारण कंटेनर में १०० K पर पक स्टोर जब तक बीम समय उपलब्ध है ।

4. सिंक्रोट्रॉन प्रयोग की ऑफलाइन तैयारी

नोट: सिंक्रोट्रॉन बीम समय के रूप में संभव के रूप में जल्दी से अनुरोध और उपलब्ध पहुंच प्रकार के लिए ऑनलाइन दिशा निर्देशों का पालन करें और कैसे एक दिया सिंक्रोट्रॉन के लिए एक आवेदन प्रस्तुत करने पर । ESRF दिशानिर्देश http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying पर पाया जा सकता है । यदि एक ESRF ब्लॉक आवंटन समूह (बैग) के एक सदस्य, प्रत्येक विशिष्ट परियोजना के लिए एक आवेदन की आवश्यकता नहीं है । इस मामले में experimenters उनके बैग बीम समय के निर्धारण के विषय में जिंमेदार दृष्टिकोण चाहिए ।

  1. प्रस्ताव को स्वीकार कर लिए जाने और प्रयोग के लिए आमंत्रण प्राप्त होने के बाद, सभी सहभागियों को सुरक्षा प्रशिक्षण पूरा करना होगा । नमूने पर आवश्यक सुरक्षा जानकारी के साथ "A-प्रपत्र" (ESRF उपयोगकर्ता पोर्टल केमाध्यम से, Http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) भरें । प्रयोग पर चर्चा के लिए स्थानीय संपर्क व्यक्ति से संपर्क करें । एक बार अपने एक फार्म प्रस्तुत किया है और सत्यापित यह आप प्रयोग संख्या और पासवर्ड दे देंगे ।
  2. विस्तारित ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) से कनेक्ट करें और MXचुनें.
  3. एक-प्रपत्र से प्रयोग संख्या और पासवर्ड के साथ लॉग इन करें ।
  4. शिपमेंट का चयन करें । नया जोड़ें और अनुरोधित जानकारी भरें ।
  5. पार्सल जोड़ें का चयन करें और प्रासंगिक डेटा भरें । कंटेनर जोड़ेंका चयन करें, एक यूनिपक चुनें और डिस्क में नमूना धारकों की स्थिति सहित आवश्यक जानकारी भरें ।

5. एक Beamline पर नमूना लोड हो रहा है

  1. प्रयोगात्मक हच में, नमूना परिवर्तक (SC) देवर में पक लोड और अपनी स्थिति नोट ।
  2. प्रयोगात्मक केबिन गूंथ और नियंत्रण हच दर्ज करें ।
  3. ISPyB (https://esrf.fr/) में लॉग इन करें । प्रयोग तैयारकरें चुनें, शिपमेंट ढूंढें, अगला चुनें और SC में बीएमलाइन और पक पोजीशन को दर्शाएं ।
  4. बीएमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर में लॉग इन करें, यहां एक-प्रपत्र पर प्रदत्त प्रयोगात्मक संख्या और पासवर्ड के साथ MXCuBE227,28
    1. ispyb डेटाबेस के साथ बीमलाइन नियंत्रण सॉफ़्टवेयर को सिंक्रनाइज़ करने के लिए सिंक्रनाइज़ेशन दबाएँ ।
  5. बीएमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें, गोनियोमीटर पर नमूना धारक माउंट करने के लिए । MXCuBE2 में, सही नमूना परिवर्तक क्षेत्र में एक स्थिति पर क्लिक करें और माउंट नमूनाका चयन.
  6. MK3 मिनी-कप्पा गोनोमीटर29 का लाभ उठाते हुए ESRF MX beamlines में से अधिकांश पर स्थापित, MXCuBE2's "दृश्य पुनर्संरेखण" कार्यप्रवाह30 का उपयोग करने के लिए नमूना धारक के विमान को गोनियोमीटर के रोटेशन अक्ष के साथ संरेखित करें ।
    1. केंद्र बटन का चयन करें, फिर लूप की नोक के किनारे के मध्य पर 3-क्लिक केंद्र । सहेजेंका चयन करके केंद्रित स्थिति सहेजें ।
    2. केंद्र बटन पर फिर से क्लिक करें, फिर 3-क्लिक करें केंद्र लूप के स्टेम के शुरू के मध्य । सहेजेंपर क्लिक करके के रूप में अच्छी तरह से दूसरी स्थिति सहेजें ।
    3. इस पर क्लिक करके बचाया केंद्रित पदों में से एक का चयन करें ।
    4. के अंतर्गतउंनत, MxCuBE2 डेटा संग्रह कतार में वर्कफ़्लो दृश्य पुनर्ओरिएंटेशन जोड़ें ।
    5. एकत्रित कतारपर क्लिक करके वर्कफ़्लो लॉंच करें ।
    6. कार्यप्रवाह के बाद नमूना धारक के विमान को गोनियोमीटर के रोटेशन अक्ष के साथ संरेखित करता है, केंद्र नमूना धारक फिर से, इस बार जाल के बीच में कहीं ।
  7. नमूना धारक ओरिएंट ताकि मेष का चेहरा MXCuBE2 का उपयोग कर ओमेगा अक्ष घूर्णन द्वारा एक्स-रे बीम दिशा के लंबवत है ।
  8. MXCuBE2 में, नमूना धारक की स्कैनिंग के लिए आवश्यक बीम आकार (केवल चर बीम आकार के साथ beamlines के लिए) का चयन करें ।
    1. पर क्लिक करें एपर्चर ड्रॉप डाउन मेनू में बीएमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर और एक मूल्य का चयन करें, उदाहरण के लिए, 10 μm.
  9. मेष स्कैन के लिए एक जाल को परिभाषित करें ।
    1. MXCuBE2 में मेष उपकरण आइकन पर क्लिक करें । मेष उपकरण विंडो दिखाई देगा ।
    2. MXCuBE2 के नमूना दृश्य में, बाईं ओर क्लिक करके मेष ड्रा और नमूना धारक पर क्रिस्टल युक्त क्षेत्र पर माउस खींच ।
    3. मेष उपकरण विंडो में प्लस बटन पर मेष क्लिक को बचाने के लिए (मेष हरा हो जाता है) ।

6. तैयार है और MeshAndCollect कार्यप्रवाह निष्पादित

  1. MXCuBE2 के रिज़ॉल्यूशन फ़ील्ड में, रिज़ॉल्यूशन (dmin) दर्ज करें, जिस पर विवर्तन छवियां एकत्रित की जानी चाहिए, उदा., यहां १.८ Å.
  2. उंनत डेटा संग्रह टैब में Meshandcollect का चयन करें, उसे कतार में जोड़ें और क्यू एकत्रित करें क्लिक करे ।
  3. पैरामीटर विंडो जो प्रकट होता है, में बीमलाइन निर्भर डिफ़ॉल्ट पैरामीटर्स का उपयोग करें । यहां वर्णित प्रयोग में चूक मापदंडों ०.०३७ मेष स्कैन प्वाइंट, १००% संचरण के प्रति जोखिम समय है (4 x 1011 पीएच के लिए इस मामले में प्रमुख), 1 जाल स्कैन लाइन प्रति ° दोलन ।
  4. Cओंतिनुएपर क्लिक करें । मेष स्कैन चलाता है और प्रत्येक ग्रिड बिंदु पर एकत्र द्विवर्तन छवियों का विश्लेषण कर रहे है और सॉफ्टवेयर DOZOR1के साथ द्विवर्तन शक्ति के अनुसार स्थान । यह प्रक्रिया पृष्ठभूमि में चलती है ।
  5. डोजोर विश्लेषण के बाद एक ऊष्मा मानचित्र उत्पन्न होता है और बाद के आंशिक डेटा संग्रहों के लिए क्रम को स्वचालित रूप से द्विवर्तन सामर्थ्य के आधार पर असाइन किया जाता है ( चित्र 1देखें).
    नोट: इस चरण के परिणाम ISPyB में भी निरीक्षण किया जा सकता है । आंशिक डेटा के संग्रह के लिए सेटिंग्स के साथ एक नया टैब सेट बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर में चबूतरे, रोटेशन रेंज के लिए उपयुक्त मूल्यों का चयन (यानी, ०.१ °), छवियों की संख्या (यानी, १००), जोखिम समय, संकल्प, संचरण, व्युत्क्रम बीम आदि आदर्श रूप से प्रत्येक कील के लिए खुराक garman सीमा (30 mgy) से नीचे होना चाहिए एकत्र किया जाना चाहिए । प्रति छवि लगभग एक्सपोज़र समय वर्णित प्रयोगात्मक परिस्थितियों में ०.०३७ s करने के लिए ०.१ s है ।
  6. आंशिक डेटा संग्रह लॉंच करने के लिए जारी रखें क्लिक करें ।

7. डाटा प्रोसेसिंग

नोट: आंशिक डेटा सेट एक उपयुक्त प्रोग्राम (XDS10) के साथ एकीकृत कर रहे हैं । इसके लिए एक Python स्क्रिप्ट का उपयोग किया जाएगा जो प्रत्येक व्यक्तिगत डेटा सेट को पहचानता है, उसे एकीकृत करता है और यह सुनिश्चित बनाता है कि भिंन आंशिक डेटा सेट्स के बीच अनुक्रमण संगत है ।

  1. छवियों वाले फ़ोल्डर को खोलें:/Data/visitor/mxxxxx/beamline_name/date/raw_data/Cerulean.
  2. जहाँ आंशिक डेटा सेट संग्रहीत किए जाते हैं फ़ोल्डर में ढूँढा जा सकता जो प्रक्रिया सबफ़ोल्डर की एक सुरक्षा प्रतिलिपि बनाएँ ।
    1. Linux टर्मिनल पर, कमांड cp-r प्रक्रिया process_backupका उपयोग करें ।
  3. प्रक्रिया फ़ोल्डर में नेविगेट और प्रसंस्करण स्क्रिप्ट शुरू ।
    1. Linux टर्मिनल पर, आदेश cd प्रक्रिया टाइप करें और enter दबाएं ।
    2. Procmulticrystaldata टाइप करें और enter दबाएं ।
      नोट: स्क्रिप्ट एक अंतरिक्ष समूह और सेल पैरामीटर के लिए पूछना होगा (यह जानकारी वैकल्पिक है), उन निर्देशों के अनुसार दर्ज करें । एक अंतिम उपयोगकर्ता पुष्टिकरण के बाद, स्क्रिप्ट स्वचालित रूप से चला जाएगा ।

8. डेटा सेट्स का विलय

नोट: सभी आंशिक डेटा सेट एकीकृत कर रहे हैं के बाद उनमें से सबसे अच्छा संयोजन संरचना दृढ़ संकल्प और शोधन में उपयोग के लिए अंतिम डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए विलय कर रहे हैं. इस विलय की प्रक्रिया के विभिंन उद्देश्य के लिए पूर्ण पूर्णता (उच्च अनुशंसित), उच्च बहुलता या सबसे अच्छा डेटा सांख्यिकी (उच्च < i/σ (i) >, कम R-कारकों, आदि) प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है । उत्तरार्द्ध कभी कभार संपूर्णता और/या बहुलता की कीमत पर हो सकता है तो इस विकल्प को ध्यान के साथ चुना जाना चाहिए.

  1. प्रोग्राम ccCluster14का उपयोग कर आंशिक डेटा सेट मर्ज करें । यह समरूपी आंशिक डेटा सेट () के संभावित संयोजनों का निर्धारण करने के लिए श्रेणीबद्ध क्लस्टर विश्लेषण (HCA) का उपयोग करता है ।
    1. अपने ग्राफिकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) को खोलने के लिए Unix टर्मिनल में Cccluster टाइप करें ।
      नोट: ccCluster GUI में एक डेन्ट्रोग्राम खींचा जाता है । यह एक सुझाव के रूप में जो आंशिक डेटा सेट सबसे अच्छा उनके बीच समाकारिता पर आधारित विलय हो सकता है देता है ।
    2. एक नोड पर क्लिक करें जो अनुलंब अक्ष पर लगभग ०.४ के मान के संगत है । सामांयत:, उच्च मान में अधिक आंशिक डेटा सेट शामिल होंगे, लेकिन आंशिक डेटा सेट के रूप में बदतर मर्ज करने वाले आंकड़ों का नेतृत्व करना कम समरूपी होगा ।
    3. मर्ज डेटापर क्लिक करें । चयनित क्लस्टर पृष्ठभूमि में संसाधित किया जाएगा और अनुमानित मर्ज आँकड़े GUI में एक नए टैब में दिखाई देगा । यह चरण डेटा सेट्स के विभिंन संयोजनों के लिए दोहराया जा सकता है । आंशिक डेटा सेट का एक अच्छा संयोजन के लिए संपूर्णता के करीब होना चाहिए १००%, < i/σ (i) > मान उच्च (10 या उच्चतर में सबसे कम रिज़ॉल्यूशन शेल) और R-meas31 मान कम (लगभग 5% कम रिज़ॉल्यूशन शेल में) ।
  2. चयनित प्रत्येक युग्म के लिए एक एकल mtz फ़ाइल (यानी, व्यर्थ३२) में चुना आंशिक डेटा सेट विलय करने के लिए उत्पंन इनपुट स्क्रिप्ट का उपयोग करें ।
  3. निश्चित पैमाने पर और एक स्केलिंग प्रोग्राम का उपयोग कर इस फ़ाइल में तीव्रता डेटा विलय (यानी, लक्ष्यहीन३२) और, के रूप में एक एकल क्रिस्टल डेटा संग्रह से उत्पन्न एक फ़ाइल के साथ, बाद में चरणबद्ध और संरचना समाधान के लिए उत्पादन का उपयोग करें३३ .

Representative Results

MeshAndCollect, के रूप में MXCuBE2 में कार्यांवित ( चित्रा 1aदेखें), एक ही नमूना धारक जिसमें क्रिस्टल के दृश्य पहचान मुश्किल था पर स्थित सेरुलियन के छोटे क्रिस्टल से आंशिक विवर्तन डेटा सेट के संग्रह के लिए प्रयोग किया जाता था । नमूना धारक को स्क्रीन करने के लिए, हम मेशलूप के केंद्र पर एक ग्रिड आकर्षित किया ( चित्र 1bदेखें) और dozor स्कोर हीट मानचित्र के आधार पर (देखें आंकड़े 1C, 1c) ८५ आंशिक डिफ़म डेटा सेट स्वचालित रूप से एकत्रित किए गए थे । ये व्यक्तिगत रूप से तो विलय (ऊपर देखें) के लिए ९९.८% पूर्णता के साथ एक डेटा सेट का उत्पादन किया गया dmin = 1.7 å ( तालिका 1देखें) । उच्चतम रिज़ॉल्यूशन शेल में आधा-सेट सहसंबंध (CC1/2)३४ ६०% (= ४.७) था । के रूप में की उंमीद है, Cerulean के क्रिस्टल संरचना सीधे आणविक प्रतिस्थापन३३ द्वारा उत्पंन डेटा सेट का उपयोग करके हल किया जा सकता है । शोधन के बाद, हम २२.८% की एक आरकाम और २५.४% की एकनि: शुल्क प्राप्त की । पहले से निर्धारित संरचना (PDB प्रविष्टि 2WSO21) के साथ superposition ०.१ Å के सीα पदों पर एक वैश्विक rmsd से पता चलता है ।

मर्ज किए गए डेटा सेट के आंकड़े
क्लस्टरिंग थ्रेशोल्ड ०.३५
आंशिक डेटासेट की संख्या 25
अंतरिक्ष समूह P212121
यूनिट सेल (ए, बी, सी) ५०.९८, ६२.७६, ६९.५०
रिज़ॉल्यूशन श्रेणी 46.58-1.70 (1.73-1.70)
Rmerge (सभी मैं + और मैं-) ०.१३३ (०.७४३)
Rmeas (सभी मैं + & मैं-) ०.१४२ (०.८१३)
Rpim (सभी मैं + & मैं-) ०.०४७ (०.३१८)
प्रेक्षण कुल/ 220693/25129
माध्य ((i)/sd (i)) १३.८ (४.७)
Mn (I) अर्ध-समुच्चय सहसंबंध CC (1/ ०.९९४ (०.६०२)
पूर्णता ९९.८ (९९.५)
बहुलता ८.८ (६.५)
अंतिम आरcryst २२.८
अंतिमनि: शुल्क २५.४

तालिका 1: मर्ज किए गए डेटा सेट के आंकड़े संग्रहीत डेटा की उच्च गुणवत्ता को दर्शाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: एक ही नमूना धारक में निहित छोटे क्रिस्टल की एक श्रृंखला से आंशिक डेटा सेट की एक श्रृंखला इकट्ठा करने के लिए MeshAndCollect का उपयोग करना. A) उपयोगकर्ता-इंटरफ़ेस MXCuBE2 । ऑन-अक्ष व्यूअर फ़ील्ड पर हरा अंडाकार ग्रिड उपकरण को इंगित करता है । ख) इसके साथ एक ग्रिड जीवन छवि क्षेत्र में नमूना धारक की छवि पर तैयार की है । ग) डोजोर स्कोर का हीट मैप । D) एक द्विवर्तन छवि का उदाहरण । E) श्रेणीबद्ध क्लस्टर विश्लेषण के बाद डेन्ट्रोग्राम । लाल रंग में डेटा सेट मर्ज करने के लिए उपयोग किए गए थे । च) सेरुलियन की समग्र संरचना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एक MX प्रयोग की सफलता आमतौर पर अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल के अस्तित्व पर निर्भर करता है । परियोजनाओं के लिए जहां छोटे क्रिस्टल बौछार से बड़े क्रिस्टल के लिए अनुकूलन विफल रहता है, MeshAndCollect एक संभावना प्रदान करता है एक पूर्ण विवर्तन डेटासेट प्राप्त करने के लिए संरचना समाधान के संयोजन के माध्यम से समरूपी आंशिक डाटा सेट एकत्र छोटे क्रिस्टल की एक श्रृंखला से । विधि एक उच्च फोटॉन प्रवाह और एक छोटे बीम व्यास, कला विवर्तनमापी डिवाइस और एक तेजी से readout डिटेक्टर के एक राज्य के साथ सुसज्जित के साथ, आदर्श MX के लिए सिंक्रोट्रॉन बीएमलाइंस के साथ संगत है । इस तरह के एक अंत स्टेशन पर, इस तरह के एक प्रयोग के डेटा संग्रह भाग के बारे में 20 मिनट लगेंगे, एकत्र किए जाने वाले आंशिक डेटा सेट की संख्या और विश्लेषण किए जाने वाले क्रिस्टल-युक्त नमूना धारकों की संख्या के आधार पर होगा ।

एक MeshAndCollect प्रयोग की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण पूर्वावश्यकता एक पर्याप्त संख्या का अस्तित्व है (कम से ५०, १०० आदर्श रूप में) नमूना धारक पर स्थिति का डिफफ्रैक्टिंग । अनुभव से, क्रिस्टल के ंयूनतम आकार का विश्लेषण किया जा करने के लिए सबसे छोटी आयाम में के बारे में 5 μm होना चाहिए । विधि मानक cryo के किसी भी प्रकार के साथ संगत है-सबसे अच्छा परिणाम मेष mounts कि कठोर और सीधे कर रहे है का उपयोग कर प्राप्त किया जा रहा है के साथ संगत नमूना धारकों ठंडा ।

esrf में, meshandcollect एक passerelle में उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से लागू किया जाता है (http://isencia.be/passerelle-edm-en) कार्यप्रवाह30 MXCuBE2 बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर से उपलब्ध है । अंय एसएक्स विधियों की तुलना में MeshAndCollect का एक प्रमुख लाभ यह है कि एकत्र डेटा मानक कार्यक्रमों और स्वचालित एकल क्रिस्टल एमएक्स के लिए इस्तेमाल पाइपलाइनों द्वारा संसाधित किया जा सकता है ।

जैसा कि हमारे उदाहरण से पता चलता है, MeshAndCollect बहुत लागू करने के लिए आसान है और आंशिक विवर्तन डेटा सेट की एक श्रृंखला की ओर जाता है, आमतौर पर छोटे क्रिस्टल से एकत्र, जो संरचना समाधान में उपयोग के लिए एक पूर्ण डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए विलय किया जा सकता है । इसके अलावा, MeshAndCollect को प्रोटीन क्रिस्टलग्राफी के नमूने अंतरिक्ष खोलने की क्षमता है के रूप में यह एक तरह से क्रिस्टलीकरण परीक्षण जहां पिछले अनुकूलन कदम, बड़े क्रिस्टल का उत्पादन, असफल से प्रयोग करने योग्य डेटा एकत्र प्रदान करता है ।

उज्ज्वल एक्स-रे स्रोतों की दिशा में वर्तमान घटनाक्रम के प्रकाश में (जैसे, अत्यंत शानदार स्रोत (ईबीएस) परियोजना/यह निकट हैकि विकिरण क्षति की वृद्धि के कारण, मल्टी-क्रिस्टल डेटा संग्रह की सुविधा के प्रकार द्वारा MeshAndCollect डेटा संग्रह के मानक विधि बन जाएगा, बजाय एक अपवाद-के रूप में वर्तमान में मामला है-synchrotron पर आधारित एमएक्स beamlines ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

हम अपने घर में अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से बीम समय प्रदान करने के लिए ESRF धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
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ccCluster ESRF Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). local development
DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
MXCuBE2 ESRF Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). local development
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MeshAndCollect का उपयोग कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेरुलियन की संरचना समाधान
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Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).More

Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).

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