Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

doi: 10.3791/58601 Published: January 7, 2019

Summary

Het meten van veranderingen in de stofwisseling staat centraal in het begrijpen van de progressie van verschillende ziektes en veroudering. Hier presenteren we een nieuwe techniek voor het meten van de hele hoofd zuurstofverbruik dat nauwer lijkt op de fysiologische toestand en kan steun bij het openbaren van nieuwe medicijnen die mitochondriale activiteit wijzigen.

Abstract

Gereglementeerde metabole activiteit is essentieel voor de normale werking van levende cellen. Inderdaad, is de gewijzigde metabole activiteit causaal verbonden met de progressie van kanker, diabetes, neurodegeneratie en veroudering om enkelen te noemen. Bijvoorbeeld, wijzigingen in mitochondriale activiteit, metabole powerhouse van de cel, gekenmerkt in veel van dergelijke ziekten. In het algemeen, de zuurstof verbruik van mitochondriën werden beschouwd als een betrouwbare uitlezing van mitochondriale activiteit en metingen in een aantal van deze studies zijn gebaseerd op geïsoleerde mitochondriën of cellen. Dergelijke voorwaarden kunnen echter niet de complexiteit van een hele weefsel vertegenwoordigen. Onlangs hebben wij een nieuwe methode waarmee de dynamische meting van zuurstof verbruik van geheel geïsoleerde vliegen koppen ontwikkeld. Door gebruik te maken van deze methode, hebben we lagere tarieven van de consumptie van de zuurstof van het hele hoofd segment vastgelegd in jonge versus leeftijd vliegen. Ten tweede hebben we ontdekt dat lysine deacetylase remmers snel veranderen als u het zuurstofverbruik in het hele hoofd. Onze nieuwe techniek kan daarom steun bij het blootleggen van de nieuwe eigenschappen van verschillende drugs, die mogelijk van invloed op stofwisseling. Bovendien kan onze methode geven een beter begrip van metabolische gedrag in een experimentele opzet dat nauwer lijkt op fysiologische staten.

Introduction

Gereglementeerde metabole activiteit is essentieel voor het overleven van de cellen en gezonde functie van een weefsel. Gedereguleerde metabole activiteit is uitvoerig aangetoond moet worden gekoppeld aan het ontstaan en de progressie van verschillende maladies1. Bijvoorbeeld lagere metabole activiteit was eerder beschreven in neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en leeftijd-geassocieerde geheugen bijzondere waardevermindering2,3. Bovendien, mitochondriale dysfunctie wordt verondersteld te zijn causaal betrokken in het veroudering proces4,5. Aan de andere kant, werden hogere tarieven van mitochondrial en metabole beschreven in kanker cellen6, waar het gebruik van mitochondriale remmers tumorvorming7verminderd.

Één uitlezing van metabole activiteit is het zuurstof verbruik (OCR) mitochondria. Interessant is dat dit soort uitlezing wordt hoofdzakelijk verkregen uit geïsoleerde mitochondriën of cellen, dus de meerderheid van wat wordt beschreven in de literatuur is hoofdzakelijk gebaseerd op een uitlezing die niet lijken op de fysiologische staat. Er zijn echter ook verschillende nadelen aan deze techniek. Ten eerste, het protocol van mitochondriale isolatie kan beschadigen zijn integriteit8, die een relevante artefact wellicht bij het vergelijken van de mitochondriën geïsoleerd van jonge versus oudere weefsels9. Bovendien, het proces van isolement is lang en kan leiden tot verlies van relevante eiwit posttranslationele modificaties tot regeling van de mitochondriale functie9,10,11. Bovendien is gebleken dat geïsoleerde mitochondria niet consequent hele weefsel stofwisseling12,13vertegenwoordigen. Dergelijke cellulaire biologische complexiteit kan worden gezien als 'het geheel is groter dan de som der delen', dat wil zeggen, de mitochondriën verschillende stofwisseling in een complexe cel in vergelijking met hun stofwisseling als geïsoleerd kunnen worden weergegeven.

Terwijl de cellen kunnen een beter OCR-uitlezing dan geïsoleerde mitochondriën aanbieden, kunnen de cel naar cel communicatie in het kader van een hele weefsel verloren gaan. Bijvoorbeeld, is de metabole activiteit van neuronen in de hersenen, sterk afhankelijk zijn van de metabole activiteit van naburige gliacellen14. Als zodanig kan tot de oprichting van nieuwe technieken te onderzoeken OCR in hele weefsel of hele organismen blijken meer inzicht voor het ontstaan en de progressie van verschillende aandoeningen.

Onlangs, nieuwe technieken opgedoken deze kwesties en het inschakelen van de meting van OCR uit hele weefsel, segment of levende organismen. Bijvoorbeeld, meldde een recente werk de zuurstof meting van een kever vlucht spier met behulp van een permeabel vezel aanpak met een respirometer15. Nieuwe machines voor micro-respirometrie toestaan de meting voor OCR van alvleesklier eilandjes16,17. Dus, het is gemeld dat deze technologie het meten van OCR van hele wormen18 en19van de zebravis maakt. De aanwezigheid van de spijsvertering barrière vormen echter een uitdaging voor het testen van verschillende drugs in de context van OCR wijzigingen. Interessant, hebben de recente verslagen van Neville en collega's een nieuwe techniek voor het meten van één drosophila larve hersenen met de goed plaat20,21aangetoond.

In deze studie hebben we een soortgelijke setup gebruikt om de meting van hele OCR van hele levens- en niet-mobiele Drosophila22. Deze techniek biedt ook een secundaire voordeel in het meten van de impact van verschillende drugs op de metabole activiteit in een hele segment, zonder het passeren van het spijsverteringsstelsel barrière13,22. Bijvoorbeeld, werd eerder aangetoond dat directe inspuiting van lysine deacetylase remmer (KDACi), een drug geloofde te wijzigen epigenetische mechanisme in de hersenen, resulteerde in een verbeterde herinneringen vorming23. Echter, met behulp van onze nieuwe techniek, ontdekten we dat KDAC inhibitie in een snelle stijging van OCR resulteerden, die kunnen zijn een bijdragende factor door zelf in de neuronale activiteit. Ons protocol biedt een eenvoudige en nieuwe methode voor de beoordeling van de gevolgen van verschillende drugs, genetische manipulatie of fysiologische staten (ziekte, veroudering) op OCR in het kader van een hele hoofd.

Protocol

1. instrument voorbereiding

Opmerking: Voor dit experiment, hebben we een Seahorse XF24-apparaat met "islet platen" gebruikt. De werking van de techniek maakt gebruik van verschillende cycli van mengen, wachten en metingen, alsmede de mogelijkheid tot het toevoegen van stoffen aan het compartiment van de meting.

  1. Zet de machine goed vóór de aanvang van het experiment zodat er voldoende tijd om te bereiken van de gewenste temperatuur en stabiel blijven.
  2. In de software-instellingen (modus Beheer), kiest u de lengte van de kalibratie van de cartridge (hier, 20 min werd gekozen) en de gewenste temperatuur.
    Opmerking: Terwijl mitochondriën of zoogdieren weefsel metingen meestal worden uit bij 37 ° C, is vliegen hoofd omgevingstemperatuur 25 ° C, maar resultaten van metingen bij 31 ° C worden gepubliceerd. We gebruikten 31 ° C, want dit de laagste temperatuur instelling voor het apparaat bij kamertemperatuur is. Om te bereiken temperaturen van 25 ° C of lager, plaatst u de machine in een koudere kamer of bij 11 ° C als onlangs gepubliceerde21.
  3. In de software, gebruik het volgende protocol: 3 min mixen-2 min wachten – 2 min meten. Afhankelijk van de proefopzet, stappen toevoegt, injectie uit havens A-D na een gekozen meting stap.
    1. Voor kwaliteitscontrole en bepaling van basale OCR, wachten voor ten minste drie cycli van de meting vóór het injecteren van de eerste drug via poort A. Voor een gedetailleerde tijdlijn van het protocol, zie referentie Becker et al. 13 .

2. cartridge voorbereiding

  1. Vooraf het kalibreren van de cartridge een dag (of ten minste 4 h) voorafgaand aan het testen. 1,0 mL kalibrant (pH 7.4) toevoegen aan elk putje en plaats van de sensor-patroon op de top van de plaat en de winkel bij 37 ° C, zonder CO2 voor overnachting of omhoog aan 72 h. voorkomen de verdamping van de cartridge met parafilm als het is gedurende meer dan 24 uur wordt gehydrateerd.
  2. Zorg ervoor dat de experimentele drugs goed worden opgelost in het medium (verse medium + 2,5% glucose) voor de start van het experiment.
  3. Meten en breng de pH van de oplossing van de drug voor de pH van het voertuig op de gewenste temperatuur om te voorkomen dat elke pH verschil tijdens drug injectie.
  4. Pipetteer de oplossing van de drug op de injectie van de toegewezen poort. Gebruik bijvoorbeeld 77 μL voor poort A om een 1:10 verdunning in een oplossing van 770 μL en vervolgens 85 μL voor poort B.
  5. De cartridge in de machine geladen en kalibratie beginnen.

3. plaat voorbereiding

Opmerking: Het is sterk aanbevolen dat twee mensen tegelijkertijd de plaat bereiden. De duur van één plaat preparaat per twee personen mogelijk ~ 45-60 minuten.

  1. Aanpassen van de vers bereide media + 2,5% glucose aan de gewenste pH met 1 N HCl. ervoor te zorgen dat de pH wordt niet beïnvloed door veranderingen in temperatuur.
  2. Bereiden van een koelbox en plaatsen van een metalen plaat op het ijs.
  3. Open het eilandje plaat (de 24-well-plate) pak en dompel de netten in een petrischaal (92 x 16 mm) met de media.
  4. Verzamelen van een net met de inserter (een klein instrument dat het net stevig in de put plaatst) en hebben de inserter houd me staande naast de Microscoop. Een kleine daling van media toevoegen aan het net gekoppeld aan de inserter.
  5. Anesthetize de vliegen (een week of 4 weken oude Zwitserse mannen werden hier gebruikt) door het plaatsen van het vliegen op de ijskoude metalen plaat.
  6. Met behulp van Tang, grijpen de buik van een vlieg en dompel het in de media in een petrischaal onder de Microscoop.
  7. Met behulp van een tweede paar pincet, zachtjes verwijderen het hoofd van de vlieg. Plaats het in het midden van het net gekoppeld aan de inserter en controleren dat het hoofd is ondergedompeld in de media.
  8. Hiermee centreert u de hoofden als er 16 van hen op het net. Verwijder overbodige vloeistof voordat het centreren van de regeringsleiders om verlies te voorkomen van hoofden terwijl het plaatsen van hen in de put.
    Opmerking: 16 vliegen hoofden werden gebruikt als dit nummer gaf voldoende en stabiele gegevens binnen een redelijke termijn plaat voorbereiding tijdens methode vestiging.
  9. Plaats de inserter met het net in de put. Zorg ervoor dat de hoofden onder het net zitten. Voeg langzaam 700 μL van media + 2,5% glucose (Figuur 1). Herhaal dit proces voor elk van de putten.
    Opmerking: 20 putjes van vliegen hoofd monsters en 4 lege putten voor achtergrond kalibratie per plaat wordt aanbevolen. Zorg ervoor dat de lege putten ook een net met 700 μL van de buffer + 2,5% glucose bevatten.
  10. Controleer de putten voor luchtbellen onder de netten via de Microscoop. Pipet zachtjes op en neer met behulp van een pipet 1 mL alle bubbels verwijderen. Houd de hoofden gecentreerd voor een betrouwbare OCR lezen.
  11. Voeg de plaat aan de machine en start de meting.

4. analyse van de OCR-metingen

  1. Aan het eind van het protocol, verwijder de cassette.
  2. Observeren als een kwaliteitscontrole, zichtbare restjes in de poort-vullingen. Negeren van de cartridge en plaat (optie 1) als de hoofden zijn niet te worden gebruikt voor eiwit extractie, bijvoorbeeld (Zie optie 2).
  3. De spreadsheet-bestanden uitpakken en kwaliteitscontrole, elk goed voor zuurstof- en pH-niveaus. Zorg ervoor dat de achtergrond wells Toon geen OCR en dat zuurstofniveaus stabiel zijn.
    1. Een algoritme voor data-analyse, waarvan sommige kunnen worden gekozen in de respectieve software gebruiken. Gebruik de AKOS algoritme voor OCR waarden2 als het bereik van zuurstof niveaus tijdens de gehele meting, tussen de eerste en laatste teek (= sub meting) zijn vergelijkbaar tussen twee biologische monsters en het zuurstofniveau van het laatste teken niet lager zijn dan 95) mmHg) (de heads' OCR is aanzienlijk lager op dit zuurstofniveau), (Figuur 2).
    2. Sommige voorwaarden zal leiden tot het monster voor het genereren van een snelle OCR en lagere zuurstofniveaus kunnen worden weergegeven tijdens de 1st teek en/of in de laatste teek (Anoxie) (figuur 3A). In zulk een scenario, een alternatieve meting-methode zoals de vaste algoritme te gebruiken. In Anoxie, is de OCR sterk verminderd als gevolg van lage niveau van zuurstof in de oplossing. Het algoritme van AKOS levert als zodanig misleidend lezingen.
      Nota: De nieuwere machine ontbreekt het vaste algoritme. Daarom bij voorkeur wordt to extract van de totale zuurstofgehalte en uitzetten van het tarief per tijd voor de eerste 3-5 teken (Figuur 3).

5. (optie 2) biochemische analyse van het hoofd Segment

  1. Voor het meten van de biochemische (metabolieten, Proteoom, enz.) de eigenschappen van een hoofd segment, passen de bewerkingstijd op de eis; het is echter mogelijk om het protocol op elk gewenst moment afbreken en verwijderen van de plaat.
  2. Zodra de plaat is verwijderd, gebruik pincet niet geslepen Maak een gat in het net te verwijderen waardoor het vrijgeven van de hoofden te zweven.
  3. Met behulp van een pipet 1 mL met een snee tip en de hoofden overbrengen in een flesje.
  4. Snel negeren de buffer en de module-freeze de hoofden in vloeibare stikstof. De hoofden bij-80 ° C voor toekomstige analyses opslaan.

Representative Results

De mogelijkheid om opnemen van hoge kwaliteit OCR meting is afhankelijk van de centrering van het hoofd in het midden van het net (Figuur 1). Dit is belangrijk voor de XF24 machine, die heeft een vrij klein zuurstofsensor plek ten opzichte van de nieuwere XFe24 machine waarin de sensor groter is. Zoals eerder aangegeven, centreren de hoofden weergeven een gestage OCR voor ten minste 20 opeenvolgende metingen in jonge vliegen13

Een kritisch aspect van het gebruik van de machines is het toepassen van de juiste analyse. Het is aanbevolen om de sterkte van het zuurstof te controleren tijdens de experimenten. Elke 2 min meting is onderverdeeld in 10 sub metingen (teken). Een goed met 16 gezonde hoofden geeft meestal een zuurstof gedeeltelijke druk (pO2) van 140-170 (mmHg) voor de eerste teek. In het eerste voorbeeld vergeleken we jonge vs. midlife vliegen hoofden (figuur 2A en 2B). Terwijl de zuurstofniveaus sneller in de middelbare leeftijd hoofden dalen, het geobserveerde verschil is klein (figuur 2A). Bovendien is het bereik van de zuurstofniveaus is vergelijkbaar tussen de voorwaarden, met 165 tijdens de eerste teek tot 120 tijdens de laatste teek. In dat geval is het beter de AKOS algoritme gebruikt voor het automatisch genereren van de OCR (pmol/min)2, die op een betrouwbare manier de daling van de zuurstof-niveau tussen jonge versus midlife hoofden (figuur 2B weerspiegelt). Van de nota kiest het analyseprogramma door de machine automatisch de AKOS algoritme.

Echter, gebaseerd op onze observaties, automatisch met behulp van het algoritme van AKOS kan geven misleidende, zoniet tegenovergestelde resultaten voor de juiste OCR. Deze artefacten kunnen worden gegenereerd in de voorwaarden van een zeer tijdrovend monster die Anoxie13,22 bereikt. Bijvoorbeeld, verandert de toevoeging van natrium butyraat (SB), een KDAC-inhibitor, Transient de dynamiek van de zuurstofniveaus (figuur 3A). Overwegende dat de controles van het voertuig gestage niveaus van zuurstof tijdens de eerste en laatste teken weergeven, SB toevoeging zorgt ervoor dat een aanzienlijke en voorbijgaande daling van de zuurstofniveaus in deze teken (figuur 3A). SB vanzelf verandert niets aan het zuurstofniveau in de achtergrond putten, waar geen hoofden (gegevens niet worden weergegeven) worden toegevoegd. De gegevens ondersteunt de notie dat SB zuurstofverbruik verhoogt. De collectie van eerste teek is uitgesteld (12 seconden totdat de eerste teek is genoteerd in de meet fase) is het eerste gegevenspunt in de SB behandeld putten al lager. Het is daarom moeilijk te vangen de vroege veranderingen in zuurstofverbruik na de toevoeging van deze HDAC-inhibitor. Anderzijds worden het zuurstofniveau in de SB behandeld monsters herleid tot de reeds lage niveaus (Anoxie) zoals aangegeven door de collectie van de laatste teken. Bij Anoxie vertragen de hoofden hun zuurstofverbruik in de laatste teken (figuur 3A). Omdat de AKOS berekening houdt rekening met alle teken en gaat voorbij aan een zuurstofvrije staat, het genereert een misleidende OCR. Inderdaad, de niet-genormaliseerd AKOS gebaseerd OCR niveaus Toon weinig verandering op de injectie (gestippelde lijn) van de poort een (Veh/SB) (figuur 3B).

Normaliseren van de OCR-niveaus voor de meting van de pre injectie op basis van de AKOS blijkt zeer vergelijkbare niveaus voor OCR voor en na de injectie van poort A, die biedt geen ondersteuning voor het zuurstof verandert (figuur 3A). Onder deze omstandigheden verdient het vaste algoritme, dat meer modellen / de OCR en zuurstof niveau veranderingen lijkt (Figuur 3 c). Bijgevolg is de vaste algoritme gebaseerd genormaliseerd meting onthult een verhoogde OCR op SB behandeling (Figuur 3 c).

Een nadeel van de nieuwe machine is de afwezigheid van de vaste algoritme. Daarom, in experimenten waar zeer consumeren monster/behandeling wordt gebruikt, wordt aanbevolen om de metingen van de OCR handmatig berekenen en berekenen van de afname van het zuurstof niveau per keer voor de eerste 3-5 teken in elke meting.

Figure 1
Figuur 1 . Een voorbeeld van een put met 16 een - week oud hoofden van mannelijke vliegen. De hoofden zijn gecentreerd onder een net en zwevend in de media. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Een representatief voorbeeld van OCR meting vergelijking tussen één - weken oude vliegen hoofden (jong) en vier - oude week vliegen koppen (middelbare leeftijd). (A) de zuurstofniveaus worden weergegeven voor de drie afzonderlijke metingen; elke 2 min meting is onderverdeeld in tien sub metingen (teken). (B) een kwantificering van (A). De niveaus van de eerste en laatste teken zijn vergelijkbaar, maar de niveaus van het monster van middelbare leeftijd iets lager zijn. Een kwantificering van de helling van de afname van de zuurstofniveaus wordt gebruikt voor het genereren van de OCR-niveaus. Als eerder beschreven22is de OCR van middelste leeftijd vliegen 10% - 15% hoger dan jonge vliegen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Een voorbeeld van de wijziging voor OCR door natrium butyraat (SB) in jonge vliegen hoofden. (A) de zuurstofniveaus opgenomen van zeven metingen na de toevoeging van 15 mM SB. De gestreepte lijn markeert de injectie van de drug (of voertuig) van poort A. Van de nota, terwijl de zuurstofniveaus van teken 1 en 10 blijven stabiel in de controlegroep (blauw), de hoeveelheid zuurstof tijdens deze teken zijn Transient (zes metingen na de injectie) verminderd in de SB behandeld monsters (oranje). Daarnaast is de afname van de zuurstofniveaus sterk verminderd tijdens het laatste teken van SB behandeld monsters. N = 3 per (B) [links] niet-genormaliseerd OCR groepeerniveaus berekend op basis van het algoritme van AKOS. De berekening onjuist toont vergelijkbare niveaus voor OCR voor en na de injectie van SB door poort A. [rechts] normalisering van de OCR op de meting vóór de injectie van poort A. (C) [Left] 'Vaste' algoritme berekening van (A) de niet-genormaliseerd OCR weergegeven: . Hier, vertegenwoordigt de OCR nauw de tijdelijke toename van de zuurstof gebruik voor de hoofden op SB behandeling; [Rechts] Normalisering van de OCR op de meting vóór de injectie van haven A. Foutbalken geven de S.E.M. in alle van de grafieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Onze nieuwe techniek biedt een nieuwe benadering om te bestuderen van metabole veranderingen in veroudering en ziekte in het kader van geheel vliegen hoofd segmenten22. De methode kan ook geschikt zijn om te bestuderen van de impact van KDAC natrium butyraat op zuurstofverbruik. Zoals we hebben aangetoond, resulteren lysine deacetlyase remmers (HDACs/KDACs) in wijzigingen van de OCR. In wezen, zoals de doelstellingen van deze remmers zijn normaal gesproken niet gelokaliseerd in de mitochondriën (deze remmers hebben geen invloed op de klasse III deacetylases, de Sirtuins)24, dergelijke drugs kunnen alleen worden getest op een minstens weefsel niveau. Inderdaad, zijn verschillende drugs geïnjecteerd rechtstreeks naar de hersenen, dus het omzeilen van mogelijke verwerking/wijziging/inactivering van het spijsverteringsstelsel. Als zodanig, biedt onze techniek nieuwe inzicht in hoe dergelijke drugs rechtstreeks gevolgen het hoofd segment.

Er zijn verschillende kritische stappen. Ten eerste, zoals in het protocol, raden we voorbereiding een plaat van minder dan een uur, met twee paar handen voorbereiding van de plaat. Uit onze ervaring zijn de kwaliteit en de stabiliteit van de OCR-metingen beter bij de voorbereiding op een tijdige manier. Bij het nemen van te lang, toeneemt het voorkomen van lage OCR consumeren wells, is naast de kortere duur van stabiele OCR. Ten tweede is het belangrijk om te voeren een kwaliteitscontrole en ervoor zorgen dat de experimentele omstandigheden tussen de verschillende monsters zijn vergelijkbaar (pH, zuurstofniveaus). Tot slot, een cruciale stap is het kiezen van het juiste algoritme voor het analyseren van de monsters. Zoals we hebben aangetoond, leverde het standaard AKOS algorithme een misleidende en soms tegengestelde berekening in monsters die zuurstof op hoge13 verbruikt. Daarom benadrukken wij het belang van de ruwe gegevens voor zuurstofniveaus controleren en vergelijken van de resulterende OCR.

Momenteel zijn er enkele beperkingen met deze techniek. Bij kamertemperatuur, de machine verwarmt tot 31 ° C (dit is de minimale meettemperatuur terwijl de machine bij kamertemperatuur), die een staat van stress voor de vliegen hoofden25kan vertegenwoordigen. Dit nochtans kan worden verholpen door het plaatsen van de machine in een koude kamer, waardoor metingen bij 25 ° C en dus zonder de stress van een mogelijke warmte om de vliegen hoofden. Recent rapport heeft aangetoond dat de machine bij 11 ° C, waardoor de opname van de OCR van vliegen bij 25 ° C21plaatsen. Niettemin, de vliegen hoofd scheiding moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Anderzijds temperatuurschommelingen maken het uitdagend om controle pH wijzigingen en daarom is het sterk aanbevolen om het effect van fysiologische omstandigheden/drugs op OCR testen met behulp van soortgelijke experimentele opstellingen. Bovendien is de bijdrage van zuurstofverbruik door niet-mitochondriale-zelfstandige mechanismen nog geen gevestigde26. Met behulp van verschillende respiratoire remmers die efficiënt in vliegen hoofden, zou het mogelijk zijn om vast te stellen van dergelijke niet-mitochondriale zuurstof verbruik.

Het is opmerkelijk dat verschillende zoogdieren maladies worden gekenmerkt door veranderingen in het energiemetabolisme. Onder hen zijn ziekten die worden gekenmerkt door ofwel metabole korting zoals de ziekte van Alzheimer of metabole herbedradingsproces zoals kanker. Interessant, worden KDAC-remmers gebruikt voor zowel de ziekte van Alzheimer en kanker behandeling27. Hoewel de precieze mechanismen door welke KDAC remmers zijn het bereiken van het therapeutische aspect onduidelijk blijven, ondersteunt de gegevens van onze techniek het nieuwe begrip dat dergelijke remmers metabolisme kunnen moduleren.

Kortom is deze methode waardevol voor het meten van totale zuurstofverbruik tarieven in vivo en meer toont nauwkeurig drug effecten op het algemene metabolisme, die in geïsoleerde mitochondriën protocollen12kan worden genegeerd. Bijvoorbeeld, hebben de resultaten van deze methode, in plaats van eerdere technieken, nieuwe inzichten voor leeftijd-geassocieerde metabole inflexibiliteit op een KDAC behandeling betrokken. Meerwerk is noodzakelijk voor het optimaliseren van de experimentele omstandigheden voor vliegen hoofden, de combinatie van onze techniek en geschikt analyse kan leiden tot verdere opheldering van de mitochondriale activiteit in het kader van de hele levende weefsels.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij danken Andreas Ladurner, Carla Margulis en hun teams voor uitgebreide experimental support. Wij danken Caitlin Ondracek voor haar opmerkingen over het manuscript. We zouden graag bedanken Sofia Vikstrom voor ons te helpen bij het vaststellen van de vroege fasen van deze techniek. Wij danken ook kan Sanderhoff voor haar technische hulp. LB wordt gefinancierd door het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (Infrafrontier grant 01KX1012). SP werd gefinancierd door een AXA onderzoeksfonds postdoctoral fellowship en het NSFC (Grant nummer 81870900). AVV is gefinancierd door de QBM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8644 D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium Agilent 103575-100 Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate Merck 817500 Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit Agilent 100850-001 Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates Agilent 101122-100 Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool Agilent 101135-10 Insertor
Petri dish Sarstedt 821,472 Petri dish 92 x 16 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. 283, (5407), Science. New York, N.Y. 1482-1488 (1999).
  2. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical chemistry. 81, (16), 6868-6878 (2009).
  3. Cunnane, S., et al. Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease. Nutrition. 27, (1), Burbank, Los Angeles County, Calif. 3-20 (2011).
  4. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350, (6265), Science. New York, N.Y. 1204-1207 (2015).
  5. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).
  6. Zhang, X., et al. Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments. Nature communications. 5, 3295 (2014).
  7. Wheaton, W. W., et al. Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis. eLife. 3, e02242 (2014).
  8. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS one. 6, (3), e18317 (2011).
  9. Baker, D. J., Peleg, S. Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging. Trends in biochemical sciences. 42, (9), 702-711 (2017).
  10. Zhao, S., et al. Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. 327, (5968), Science. New York, N.Y. 1000-1004 (2010).
  11. Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. M. Mechanisms and Dynamics of Protein Acetylation in Mitochondria. Trends in biochemical sciences. 41, (3), 231-244 (2016).
  12. Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging cell. 9, (6), 1032-1046 (2010).
  13. Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., de Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific reports. 8, (1), 4199 (2018).
  14. Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell metabolism. 22, (3), 437-447 (2015).
  15. Newell, C. Physiological Entomology. 41, 96-102 (2016).
  16. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, (7), e21746 (2011).
  17. Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PloS one. 7, (5), e33023 (2012).
  18. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature. 11, (10), 1798-1816 (2016).
  19. Kumar, M. G., et al. Altered Glycolysis and Mitochondrial Respiration in a Zebrafish Model of Dravet Syndrome. eNeuro. 3, (2), (2016).
  20. Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of neuroscience. 296, 32-43 (2018).
  21. Neville, K. E., et al. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).
  22. Peleg, S., et al. Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila. EMBO reports. 17, (3), 455-469 (2016).
  23. Peleg, S., et al. Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328, (5979), Science. New York, N.Y. 753-756 (2010).
  24. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochimica et biophysica acta. 1864, (10), 1372-1401 (2016).
  25. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of ageing and development. 5, (5), 347-370 (1976).
  26. Banh, R. S., et al. PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia. Nature cell biology. 18, (7), 803-813 (2016).
  27. Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders. Nature reviews. Drug discovery. 13, (9), 673-691 (2014).
Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).More

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter