Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

doi: 10.3791/58601 Published: January 7, 2019

Summary

מדידת שינויים בשערי מטבולית הוא מרכזי להבנת ההתקדמות של הזדקנות ומחלות שונות. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשנית כדי למדוד את צריכת החמצן כל הראש באופן הדוק יותר דומה המדינה פיזיולוגיים, עשויים לסייע בגילוי תרופות חדישות לשנות פעילות מיטוכונדריאלי.

Abstract

פעילות מטבולית מוסדר חיוני לתפקוד תקין של תאים חיים. אכן, פעילות חילוף החומרים שונה סיבתי מקושר עם התקדמות סרטן, סוכרת, הקשורים ניוון מוחיים, הזדקנות שם כמה. למשל, שינויים בפעילות מיטוכונדריאלי, תחנת כוח חילוף החומרים של התא, יש כבר מאופיין במחלות רבות כגון. באופן כללי, שיעור צריכת החמצן של המיטוכונדריה נחשבו readout אמין פעילות מיטוכונדריאלי, מדידות בכמה מחקרים אלו התבססו על המיטוכונדריה מבודד או תאים. עם זאת, בתנאים לא מייצג את המורכבות של כל רקמה. לאחרונה פיתחנו שיטה המאפשרת המדד הדינמי של חמצן קצב הצריכה של מנהלי לטוס מבודד לגמרי. באמצעות שיטה זו, הקלטנו שיעורי צריכת חמצן נמוכה של המקטע כל ראש צעיר לעומת בגילאי בזבובים. שנית, גילינו כי מעכבי deacetylase ליזין לשנות במהירות את צריכת החמצן בראש כל. הטכניקה הרומן שלנו עשויים לסייע לכן חשיפת מאפיינים חדשים של תרופות שונות, אשר עשויים להשפיע על קצב חילוף החומרים שיש. יתר על כן, שיטת שלנו עשוי לתת הבנה טובה יותר של התנהגות מטבולית התקנה ניסיונית הדומה יותר מצבים פיזיולוגיים.

Introduction

פעילות מטבולית מוסדר חיוני עבור ההישרדות של תאים ותפקוד בריא של רקמה. ושוחררו פעילות מטבולית הוכח באופן נרחב כדי להיות מקושר את תחילת ואת ההתקדמות של מחלות שונות1. לדוגמה, פעילות חילוף החומרים התחתון היה שתואר קודם לכן מחלות ניווניות כגון אלצהיימר ו-2,ליקוי זיכרון הקשורות לגיל3. יתר על כן, תפקוד מיטוכונדריאלי הוא האמין להיות מעורב סיבתי4,תהליך ההזדקנות5. מצד שני, המחירים גבוהים יותר מיטוכונדריאלי וחילוף מתוארים סרטן תאים6, שבו השימוש של מעכבי מיטוכונדריאלי מופחת tumorigenesis7.

אחד readout פעילות חילוף החומרים הוא שיעור צריכת החמצן (OCR) של המיטוכונדריה. מעניין, סוג זה של הבדיקה מתקבל בעיקר המיטוכונדריה מבודד או תאים, ובכך את רוב מה מתואר בספרות מתבסס בעיקר על הבדיקה שאינו דומה המדינה פיזיולוגיים. עם זאת, ישנם מספר חסרונות כדי בטכניקה זו. ראשית, הפרוטוקול של בידוד מיטוכונדריאלי יכול שעלולים לגרום נזק שלה תקינות8, אשר עשוי להיות הפריט הרלוונטי בהשוואת המיטוכונדריה מבודד צעירים לעומת מבוגרים רקמות9. יתר על כן, תהליך בידוד ארוכה, עלול לגרום לאובדן של שינויים posttranslational חלבון רלוונטיים אשר לווסת את הפונקציה מיטוכונדריאלי9,10,11. יתר על כן, הוכח כי המיטוכונדריה מבודדים אינם מייצגים באופן עקבי כל רקמות קצב חילוף החומרים שיש12,13. המורכבות הביולוגית הסלולר כזה יכול להיחשב, "השלם הוא יותר מסכום חלקיו", קרי, המיטוכונדריה עשוי להציג שיעורי מטבוליים שונים בתוך תא מורכב לעומת קצב חילוף החומרים שלהם כאשר מבודדים.

בעוד תאים עשוי להציע readout OCR טובה יותר מאשר המיטוכונדריה מבודד, תקשורת לתא בהקשר של כל רקמה יאבדו. לדוגמה, במוח, הפעילות המטבולית של נוירונים הוא תלויים במידה רבה הפעילות המטבולית של תאי גליה שכנות14. ככזה, הקמת טכניקות חדשות לחקור OCR ברקמה שלם או אורגניזם שלם עשוי להוכיח יותר נבונה כדי להפוך את תחילת התפתחות הפרעות שונות.

לאחרונה, טכניקות חדשות הופיעו בבעיות אלה ולאפשר את המדידה של OCR כל רקמות, קטע או אורגניזמים חיים. לדוגמה, עבודה אחרונים דיווח המדידה החמצן של שריר טיסה חיפושית באמצעות גישה סיבים permeabilized עם respirometer15. מכונות חדשות עבור מיקרו-respirometry לאפשר את המדידה של OCR לנגרהנס16,17. כתוצאה מכך, בעבר דווח כי טכנולוגיה זו מאפשרת מדידת OCR של תולעים כל18 ודג זברה19. עם זאת, הנוכחות של המכשול העיכול עלולה להוות אתגר עבור בדיקות סמים שונים בהקשר של שינויים OCR. מעניין, דיווחים אחרונים מאת נוויל ועמיתיו הראו בטכניקה חדשה למדידת דרוזופילה יחיד המוח זחל עם צלחת טוב20,21.

במחקר זה, השתמשנו מלכודת דומה כדי לאפשר את המדידה של OCR כל החיים, בפירוקי דרוזופילה22. טכניקה זו מציעה גם יתרון משניים למדידת ההשפעה של תרופות שונות על פעילות חילוף החומרים של מקטע שלם, מבלי לעבור דרך מערכת העיכול מכשול13,22. לדוגמה, בעבר הוכח כי ישיר הזרקה של ליזין deacetylase מעכב (KDACi), תרופה האמין לשנות מנגנון epigenetic במוח, כתוצאה של היווצרות זיכרונות משופרת23. עם זאת, באמצעות הטכניקה הרומן שלנו, גילינו כי עיכוב KDAC הביא לעלייה מהירה OCR, אשר עשוי להוות גורם מסייע בפני עצמו בפעילות העצבית. פרוטוקול שלנו מספק שיטה פשוטה הרומן לאמוד את ההשפעה של תרופות שונות, מניפולציה גנטית או מצבים פיזיולוגיים (מחלות, הזדקנות) על OCR בהקשר של ראש.

Protocol

1. כלי הכנה

הערה: עבור ניסוי זה, השתמשנו התקן סוסון ים XF24 עם "איון הצלחות". הפעולה של הטכניקה משתמשת מחזורים שונים של ערבוב, מחכה מדידות וכן האפשרות להוספת חומרים בתא המדידה.

  1. הפעל את המכונה לפני תחילת הניסוי כך שאין מספיק זמן כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה, נשארים בעינם.
  2. בכיוונון תוכנה (מצב ניהול), לבחור את משך הכיול מחסנית (כאן, 20 דקות נבחר) ואת הטמפרטורה הרצויה.
    הערה: בזמן המיטוכונדריה או רקמות בתרבית של מדידות מתבצעות בדרך כלל החוצה ב ° 37 C, לעוף טמפרטורת ראש היא 25 ° C, אך תוצאות מדידות ב 31 ° C מתפרסמים. השתמשנו 31 ° C כיוון הטמפרטורה הנמוכה ביותר עבור ההתקן בטמפרטורת החדר. כדי להגיע בטמפרטורה של 25 º C או נמוך יותר, במקום המכונה בחדר קר או ב 11 ° C כפי שפורסם לאחרונה21.
  3. בתוכנה, להשתמש בפרוטוקול הבאים: 3 דקות ערבוב 2 דקות – 2 דקות המתנה – מדידה. בהתאם לעיצוב הניסיונית, להוסיף שלבים הזרקת יציאות A-D לאחר צעד המדידה שבחרת.
    1. עבור בדיקת האיכות, קביעת OCR הבזליים, לחכות לפחות שלושה מחזורים מדידה לפני הזרקת התרופה הראשונה באמצעות יציאת א עבור ציר מפורט של הפרוטוקול, ראו מפנות בקר. et al. 13 .

2. מחסנית הכנה

  1. מראש כיילו את המחסנית יום (או לפחות 4 h) לפני בדיקה. להוסיף 1.0 מ"ל של Calibrant (pH 7.4) כל טוב ומניחים את מחסנית חיישן על גבי צלחת של החנות ב 37 ° C ללא CO2 למשך הלילה או עד כדי ה 72 למנוע האידוי של מחסנית עם מצלמות-מיקרוסקופים אם זה הוא להיות להתייבש במשך יותר מ 24 שעות.
  2. ודא כי תרופות ניסיוניות ובכן מומס המדיום (בינוני טריים + 2.5% גלוקוז) לפני תחילת הניסוי.
  3. למדוד ולהתאים את רמת החומציות של סמים לפתרון ה-pH של הרכב בטמפרטורה הרצויה כדי להימנע כל הבדל pH בעת הזרקת סמים.
  4. Pipet הפתרון סמים הנמל הזרקת שהוקצה שלה. לדוגמה, השתמש μL 77 עבור יציאה A כדי להשיג 1:10 דילול פתרון 770 μL, לאחר מכן 85 μL עבור יציאה B.
  5. לטעון את המחסנית לתוך המכונה ולהתחיל כיול.

3. הצלחת הכנה

הערה: מומלץ מאוד כי שני אנשים להכין את הצלחת בו זמנית. משך הכנת לוח אחד לכל שני אנשים עשויים לדרוש ~ 45-60 דקות.

  1. התאם את הטרי מדיה + 2.5% גלוקוז כדי רמת ה-pH הרצוי עם 1 N HCl. ודא כי ה-pH לא מושפע על ידי שינויים בטמפרטורה.
  2. הכנת קופסת הקרח ומניחים צלחת מתכת על הקרח.
  3. תפתח את החבילה איון של צלחת (צלחת 24-טוב), לטבול את הרשתות בצלחת פטרי (92 מ"מ x 16 מ"מ) עם המדיה.
  4. לאסוף אחת נטו עם מכניס תוספות (מכשיר קטן מקומות ברשת בחוזקה בתוך הבאר) ויש את מכניס תוספות לעמוד ליד המיקרוסקופ. להוסיף טיפה קטנה של מדיה ברשת המצורפת את מכניס תוספות.
  5. עזים ומתנגד הזבובים (שבוע אחד או 4 שבועות זכרים קנטון העתיקה שימשו כאן) על-ידי הצבת הזבובים בצלחת מתכת קרה כקרח.
  6. באמצעות מלקחיים, לתפוס את הבטן של זבוב, לטבול אותו בתקשורת בצלחת פטרי מתחת למיקרוסקופ.
  7. באמצעות זוג מלקחיים השני, הסר בעדינות את הראש של הזבוב. מקם אותה באמצע הרשת מחוברת מכניס תוספות וודא כי הראש הוא שקוע מדיה.
  8. מרכז ראשי כאשר יש 16 מהם ב- net. הסרת נוזל מיותר לפני מרכוז ראשי כדי למנוע אובדן של ראשי תוך הצבת אותם בבאר.
    הערה: 16 ראשי לטוס שימשו כמו מספר זה נתן נתונים מספיקים ולא יציב בתוך זמן סביר של צלחת הכנה במהלך הקמת השיטה.
  9. באמצעות מכניס את תוספות, מניחים את הרשת בבאר. ודא כי ראשי לכוד מתחת לרשת. לאט לאט להוסיף 700 μL של מדיה + 2.5% גלוקוז (איור 1). חזור על התהליך עבור כל הבארות.
    הערה: 20 בארות לטוס דגימות ראש, 4 בארות ריק לצורך כיול רקע לכל צלחת מומלץ. ודא כי בארות ריק מכילים גם רשת עם 700 μL מאגר + 2.5% גלוקוז.
  10. בדוק את בארות בועות אוויר מתחת רשתות באמצעות המיקרוסקופ. Pipet בעדינות באמצעות למעלה ולמטה pipet 1 מ"ל כדי להסיר את כל הבועות. שמור ראשי ממורכז עבור OCR אמין קריאה.
  11. הוסף את הצלחת אל המכונה ולהתחיל את המדידה.

4. ניתוח של המדידות OCR

  1. בסוף הפרוטוקול, הסר את מיכל הדיו.
  2. כמו בדיקת איכות, להתבונן שאריות גלויות ב הסתימות יציאה. למחוק את המחסנית ואת צלחת (אפשרות 1) אם ראשי לא אמור לשמש להפקת חלבון, למשל, (ראה אפשרות 2).
  3. לחלץ את הקבצים גיליון אלקטרוני ולבדוק איכות אחד טוב עבור רמות חמצן ו- pH. ודא כי הבארות רקע להראות OCR אין רמות החמצן יציבים.
    1. השתמש אלגוריתם לניתוח נתונים, אשר חלקם ניתן לבחור בתוכנה בהתאמה. שימוש האלגוריתם מאור כהנא עבור OCR ערכים2 אם הטווח של חמצן רמות במהלך המדידה כולו, בין השניה הראשונה והאחרונה (= המדידה משנה) דומים בין שתי דגימות ביולוגיות, רמות החמצן של הקרציות האחרון אינן נמוך יותר 95 ( מ מ כספית) (OCR של ראשי הוא נמוך במידה ניכרת ברמה זו חמצן), (איור 2).
    2. כמה תנאים יגרום הדגימה ליצור OCR מהירה, עשויים להציג רמות חמצן נמוכות יותר במהלך השניהst 1 ו/או את תקתוק האחרון (אנוקסיה) (איור 3 א). בתרחיש כזה, להשתמש בשיטת המדידה חלופי כגון האלגוריתם קבוע. ב. אנוקסיה, OCR מוקטן מאוד בשל רמות נמוכות של חמצן בפתרון. ככזה, האלגוריתם מאור כהנא מניבה קריאות מטעה.
      הערה: המכונה החדשים חסרה את אלגוריתם קבוע. לכן, זה הוא העדיף כדי לחלץ את רמות החמצן הכולל מגרש שיעור הזמן הראשון 3-5 קרציות (איור 3).

5. (אפשרות 2) ניתוח הביוכימי של המקטע הראש

  1. כדי למדוד הביוכימי (מטבוליטים, פרוטאום, וכו ') מאפיינים של קטע ראש, להתאים את זמן ריצה על הדרישה; עם זאת, ניתן לבטל את הפרוטוקול בכל עת ולהסיר את הצלחת.
  2. לאחר הצלחת מוסר, להשתמש מלקחיים הלא מחודד כדי לעשות חור ברשת ולהסירו ובכך לשחרר את ראשי כדי לצוף.
  3. באמצעות pipet של 1 מ"ל עם חתך עצה ולהעביר את ראשי ל בקבוקון.
  4. לבטל את המאגר ובמהירות snap-להקפיא הראשים של חנקן נוזלי. אחסן את ראשי ב-80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח עתידי.

Representative Results

היכולת להקליט באיכות גבוהה OCR המדידה מסתמכת על מרכוז הראש באמצע הרשת (איור 1). זה חשוב עבור המכונה XF24, אשר יש חיישן חמצן קטן למדי ספוט בהשוואה המכונה XFe24 החדשים שבהם החיישן הוא גדול יותר. כאמור שמוצג, מרכוז ראשי להציג OCR קבועה עבור מדידות רצופות לפחות 20 זבובים צעירים13.

היבט קריטי אחד של שימוש המכונות היא להחיל ניתוח נכון. מומלץ לבדוק את רמות החמצן במהלך הניסויים. כל אחת מהמידות 2 דקות מחולק ל 10 מדידות תת (מתקתק). טוב עם הראשים בריאים 16 מציגה בדרך כלל של לחץ חלקי חמצן (pO2) של 140-170 (מ מ כספית) על השניה הראשונה. בדוגמה הראשונה, השווינו הצעיר לעומת אמצע החיים ראשי לעוף (איור 2A ו- 2B). ואילו רמות החמצן ירידה מהר בראשיהם בגיל העמידה, ההבדל שנצפה הוא קטן (איור 2 א). יתר על כן, הטווח של רמות החמצן דומה בין התנאים, עם 165 במהלך השניה הראשונה ל-120 במהלך השניה האחרונה. במקרה כזה, עדיף להשתמש האלגוריתם מאור כהנא כדי להפיק באופן אוטומטי OCR (pmol/דקה)2, אשר משקף בצורה אמינה את הירידה ברמת החמצן בין צעירים נגד ראשי אמצע החיים (איור 2B). ראוי לציין, התוכנית ניתוח ליד מכונת בוחרת באופן אוטומטי את האלגוריתם מאור כהנא.

עם זאת, על סמך התצפיות שלנו, באופן אוטומטי באמצעות האלגוריתם מאור כהנא ייתן מטעה, אם לא ההפך תוצאות עבור OCR הנכון. שמירת חפצים יכול להיווצר בתנאים של דגימה רב מאוד אשר מגיעה אנוקסיה13,22. לדוגמה, התוספת של נתרן butyrate (SB), מעכב KDAC, transiently משנה את הדינמיקה של רמות החמצן (איור 3 א). ואילו הפקדים הרכב להציג רמות יציבות של חמצן במהלך הקרציות הראשונה והאחרונה, תוספת SB גורמת ירידה ניכרת וחולף של רמות החמצן אלה קרציות (איור 3 א). SB בפני עצמו אינו משנה את רמות החמצן הבארות רקע, שם שום. ראשים נוספים (נתונים לא מוצג). הנתונים תומך את הרעיון כי SB מגביר את צריכת החמצן. האוסף של שנתות הראשון הוא מתעכב (12 שניות עד השניה הראשון נרשם בשלב מדידה) כמו נקודת הנתונים הראשונה כבר נמצא נמוך יותר הבארות SB מטופלים. לכן, קשה ללכוד את השינויים מוקדם בצריכת החמצן בעקבות התוספת של מעכבי HDAC הזה. יתר על כן, רמות החמצן הדגימות SB מטופלים מופחתים על רמות נמוכות כבר (אנוקסיה) כמצוין על-ידי האוסף של הקרציות האחרון. ב אנוקסיה, להאט הראשים שלהם צריכת החמצן של הקרציות האחרון (איור 3 א). כי בחישוב מאור כהנא לוקח בחשבון כל קרציות ומתעלם מצב אנאוקסיים, שהיא מייצרת OCR מטעה. ואכן, מאור כהנא הלא מנורמל בהתאם OCR רמות הצג שינוי קטן ההזרקה (קו מקווקו) של הנמל (Veh/SB) (איור 3B).

נרמול רמת OCR למדידה הזרקת מראש המבוסס על מאור כהנא מגלה רמות דומות מאוד של OCR לפני ואחרי ההזרקה של יציאה A, אשר אינו תומך השינויים ברמת החמצן (איור 3 א). בנסיבות אלה, מומלץ אלגוריתם קבוע, הדומה יותר מקרוב מודלים/OCR ושינויים ברמת החמצן (איור 3C). כתוצאה מכך, אלגוריתם קבוע מבוסס מנורמל מדידה מגלה OCR מוגברת על טיפול SB (איור 3C).

חיסרון עם המכונה החדשה היא העדר של אלגוריתם קבוע. לכן, בניסויים שם מאוד לצרוך מדגם/טיפול משמש, מומלץ לחשב את המידות OCR באופן ידני, חישוב הירידה חמצן ברמה בכל פעם הראשונה 3-5 קרציות במדידה בכל.

Figure 1
איור 1 . דוגמה לבאר המכיל 16 ראשי אחד - בן שבועיים של זבובים זכרים. הראשים הם ממורכזת מתחת רשת צף בכלי התקשורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . דוגמה מייצגת של OCR מדידה השוואה בין ראשי אחד - בן שבועיים טוס (יאנג) וראשי ארבע - בן שבועיים טוס (בגיל העמידה). (א) רמות החמצן מוצגים עבור שלוש מדידות נפרדות; כל אחת מהמידות 2 דקות מחולק ל 10 מדידות תת (מתקתק). (ב) לא כימות של (א). הרמות של הקרציות הראשון והאחרון דומים, למרות הרמות של המדגם הביניים הם מעט נמוך יותר. כימות של המדרון של הירידה ברמות החמצן משמש כדי ליצור את רמות OCR. כמו שתואר לעיל22, OCR של הזבובים בגילאי הביניים הוא 10% - 15% גבוה יותר זבובים צעירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . דוגמה משינוי של OCR מאת נתרן butyrate (SB) בראש צעיר לעוף. (א) רמות החמצן נרשמה מתוך שבע המידות בעקבות התוספת של 15 מ מ SB. הקו המקווקו מסמן את הזריקה של סמים (או רכב) מן נמל א ראוי לציין, בעוד רמות החמצן של קרציות 1 ל-10 להישאר יציב בקבוצת הביקורת (כחול), רמות החמצן במהלך קרציות אלו הם transiently (מידות 6 בעקבות הזריקה) מופחת הדגימות SB מטופלים (כתום). בנוסף, הפחתת רמות החמצן הקטינה באופן משמעותי במהלך הקרציות האחרון של דגימות SB מטופלים. N = 3 לכל קבוצה (B) [משמאל] OCR מנורמל ללא רמות שמחושבים האלגוריתם מאור כהנא. החישוב מראה באופן שגוי רמות דומות של OCR לפני ואחרי ההזרקה של SB באמצעות יציאת [Right] א, נרמול OCR למדידה לפני ההזרקה של יציאת א (ג) [משמאל] 'קבוע' אלגוריתם חישוב (א) מציג OCR הלא מנורמל . כאן, OCR מקרוב מייצג עליית ארעי חמצן השימוש של ראשי על טיפול SB; [Right] נרמול OCR למדידה לפני ההזרקה של יציאת א שגיאה ברים מציינים את S.E.M. כל בגרפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הטכניקה החדשה שלנו מציע גישה מוזרה ללמוד שינויים מטבוליים הזדקנות ומחלות בהקשר של מקטעי ראש כל זבוב22. השיטה יכול להיות מתאים גם לחקור את ההשפעה של KDAC butyrate נתרן על צריכת החמצן. כפי שאנחנו הדגימו, מעכבי deacetlyase ליזין (HDACs/KDACs) גורמות לשינויים OCR. בעיקרו של דבר, כפי המטרות של מעכבי כזה בדרך כלל לא מותאמים המיטוכונדריה (מעכבי אלה לא משפיעים על deacetylases Class III, Sirtuins)24, תרופות מסוג זה יכול לבדוק רק על לפחות ברמת רקמות. אכן, תרופות שונות מוזרקים ישירות למוח, ובכך לעקוף אפשרי עיבוד/שינוי/איון על ידי מערכת העיכול. ככזה, הטכניקה שלנו מציע תובנה הרומן איך כגון סמים ישירות השפעה על קטע ראש.

ישנם מספר שלבים קריטיים. ראשית, כאמור בפרוטוקול, אנו ממליצים הכנת צלחת מתחת שעה אחת, עם שני זוגות ידיים מכין את הצלחת. מהניסיון שלנו, איכות ויציבות של המדידות OCR טובים יותר כאשר שהוכנו מבעוד. כאשר לוקחים יותר מדי זמן, המופע של בארות רב OCR נמוכה היא הגדלת, כמו גם משך קצר יותר של OCR יציב. שנית, חשוב לבצע בדיקת איכות ולהבטיח כי התנאים ניסיוני בין מדגמים שונים הם דומים (pH, רמות חמצן). לבסוף, שלב קריטי הוא בחירת אלגוריתם הנכון כדי לנתח את הדגימות. כמו, הראו אלגוריתם מאור כהנא כברירת מחדל הניב חישוב מטעה ואף לעיתים מנוגדות הדגימות אשר לצרוך חמצן-שיעור גבוה13. לכן יש להדגיש את החשיבות של בדיקת הנתונים הגולמיים עבור רמות החמצן והשוואה בין OCR התוצאה.

כיום, ישנן מספר מגבלות בטכניקה זו. בטמפרטורת החדר, מחממת המכונה עד 31 ° C (זוהי מדידת הטמפרטורה מינימלית אמנם המכונה בטמפרטורת החדר), אשר עשוי לייצג מדינה מתח עבור ראשי לטוס25. זה אולם ניתן להתגבר על ידי הצבת המכונה בחדר קר, אשר יאפשר מידות 25 ° c, ומכאן ללא עומס החום אפשרי ראשי לעוף. לאחרונה דווח הוכיחה הצבת המכונה ב 11 ° C, ובכך מאפשר את ההקלטה OCR של הזבובים-25 ° C21. עם זאת, ההפרדה הראש לטוס צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר. יתר על כן, תנודות הטמפרטורה דבר מאתגר את פקד ה-pH משתנה, ולכן מומלץ מאוד לבחון את ההשפעה של מצבים פיזיולוגיים/סמים על OCR באמצעות setups ניסיוני דומה. בנוסף, התרומה של צריכת החמצן על ידי מנגנונים שאינם מיטוכונדריאלי-שאינו תלוי לא התקבלה עדיין הוקמה26. בעזרת מעכבי נשימה שונים כי הם יעילים בראש לעוף, אפשר היה להקים כזה המחירים צריכת חמצן מיטוכונדריאלי.

ראוי לציין כי מחלות יונקים שונים מאופיינים על ידי שינויים בחילוף החומרים אנרגיה. ביניהם הם מחלות המאופיינת על ידי או הפחתת מטבולי כמו מחלת אלצהיימר או מטבוליות הטיפולי כגון סרטן. מעניין, מעכבי KDAC משמשים עבור טיפול של מחלת אלצהיימר וסרטן -27. בעוד המנגנון המדויק על ידי איזה KDAC מעכבי משיגים את ההיבט הטיפולי אינן ברורות, הנתונים מכל הטכניקה שלנו תומך הרעיון חדשניים כגון מעכבי יכול לווסת את חילוף החומרים.

לסיכום, שיטה זו היא בעל ערך עבור מדידת צריכת החמצן הכוללת שיעורי ויוו , יותר מציג במדויק השפעות סמים על חילוף החומרים, אשר עשויים להתעלם המיטוכונדריה מבודד פרוטוקולים12. לדוגמה, התוצאות המתקבלות מן זו שיטה, ולא טכניקות הקודם, לסבך תובנות חדשניים עבור גיל-הקשורים ביחס לתביעותיה המטבולית על טיפול KDAC. בעוד עבודה נוספת יש צורך לייעל התנאים ניסיוני עבור לעוף ראשים, השילוב של הטכניקה שלנו וניתוח מתאים עלול להוביל הבהרה נוספת של הפעילות מיטוכונדריאלי בהקשר של רקמות החיים.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים אנדריאס Ladurner, קרלה מרגוליס והצוותים שלהם לתמיכה נרחבת ניסיוני. אנו מודים Ondracek קייטלין על הערות על כתב היד. ברצוננו להודות סופיה Vikstrom לסייע לנו בהקמת השלבים המוקדמים של טכניקה זו. אנו מודים גם ייתכן Sanderhoff עזרה טכנית. LB ממומן על ידי הגרמני הפדרלי במשרד החינוך והמחקר (Infrafrontier גרנט 01KX1012). SP מומן על ידי הבתר של קרן מחקרים AXA ולא את NSFC (מענק מס ' 81870900). AVV ממומן על ידי QBM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8644 D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium Agilent 103575-100 Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate Merck 817500 Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit Agilent 100850-001 Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates Agilent 101122-100 Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool Agilent 101135-10 Insertor
Petri dish Sarstedt 821,472 Petri dish 92 x 16 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. 283, (5407), Science. New York, N.Y. 1482-1488 (1999).
  2. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical chemistry. 81, (16), 6868-6878 (2009).
  3. Cunnane, S., et al. Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease. Nutrition. 27, (1), Burbank, Los Angeles County, Calif. 3-20 (2011).
  4. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350, (6265), Science. New York, N.Y. 1204-1207 (2015).
  5. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).
  6. Zhang, X., et al. Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments. Nature communications. 5, 3295 (2014).
  7. Wheaton, W. W., et al. Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis. eLife. 3, e02242 (2014).
  8. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS one. 6, (3), e18317 (2011).
  9. Baker, D. J., Peleg, S. Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging. Trends in biochemical sciences. 42, (9), 702-711 (2017).
  10. Zhao, S., et al. Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. 327, (5968), Science. New York, N.Y. 1000-1004 (2010).
  11. Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. M. Mechanisms and Dynamics of Protein Acetylation in Mitochondria. Trends in biochemical sciences. 41, (3), 231-244 (2016).
  12. Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging cell. 9, (6), 1032-1046 (2010).
  13. Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., de Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific reports. 8, (1), 4199 (2018).
  14. Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell metabolism. 22, (3), 437-447 (2015).
  15. Newell, C. Physiological Entomology. 41, 96-102 (2016).
  16. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, (7), e21746 (2011).
  17. Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PloS one. 7, (5), e33023 (2012).
  18. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature. 11, (10), 1798-1816 (2016).
  19. Kumar, M. G., et al. Altered Glycolysis and Mitochondrial Respiration in a Zebrafish Model of Dravet Syndrome. eNeuro. 3, (2), (2016).
  20. Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of neuroscience. 296, 32-43 (2018).
  21. Neville, K. E., et al. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).
  22. Peleg, S., et al. Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila. EMBO reports. 17, (3), 455-469 (2016).
  23. Peleg, S., et al. Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328, (5979), Science. New York, N.Y. 753-756 (2010).
  24. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochimica et biophysica acta. 1864, (10), 1372-1401 (2016).
  25. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of ageing and development. 5, (5), 347-370 (1976).
  26. Banh, R. S., et al. PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia. Nature cell biology. 18, (7), 803-813 (2016).
  27. Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders. Nature reviews. Drug discovery. 13, (9), 673-691 (2014).
מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).More

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter