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Biochemistry

मापने और पूरे मक्खी प्रमुख क्षेत्रों में ऑक्सीजन की खपत दर की व्याख्या

doi: 10.3791/58601 Published: January 7, 2019

Summary

चयापचय दरों में परिवर्तन को मापने विभिंन रोगों और उंर बढ़ने की प्रगति को समझने के लिए केंद्रीय है । यहां, हम पूरे सिर ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए एक उपंयास तकनीक मौजूद है कि अधिक निकटता शारीरिक राज्य जैसा दिखता है और उपंयास दवाओं है कि mitochondrial गतिविधि को संशोधित खुलासा में सहायता कर सकते हैं ।

Abstract

विनियमित चयापचय गतिविधि जीवित कोशिकाओं के सामान्य कामकाज के लिए आवश्यक है. वास्तव में, बदल चयापचय गतिविधि कारण कैंसर, मधुमेह, neurodegeneration की प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है, और कुछ नाम उंर बढ़ने । उदाहरण के लिए, mitochondrial गतिविधि में परिवर्तन, कोशिका की चयापचय बिजलीघर, कई ऐसे रोगों में विशेषता है । आम तौर पर, mitochondria की ऑक्सीजन खपत की दरों में mitochondrial गतिविधि और माप का एक विश्वसनीय readout माना जाता था इनमें से कुछ अध्ययनों में पृथक mitochondria या कोशिकाओं पर आधारित थे. हालांकि, इस तरह की स्थितियों एक पूरे ऊतक की जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं । हाल ही में, हम एक उपंयास तरीका है कि पूरी अलग मक्खी सिर से ऑक्सीजन की खपत दर के गतिशील माप में सक्षम बनाता है विकसित की है । इस विधि का उपयोग करके, हम वृद्ध मक्खियों बनाम युवा में पूरे सिर खंड के कम ऑक्सीजन खपत दर दर्ज की गई है । दूसरे, हमें पता चला है कि lysine deacetylase अवरोधकों तेजी से पूरे सिर में ऑक्सीजन की खपत में परिवर्तन । हमारे उपंयास तकनीक इसलिए विभिंन दवाओं, जो चयापचय दर प्रभाव मई के नए गुणों को उजागर करने में सहायता कर सकते हैं । इसके अलावा, हमारी विधि एक प्रयोगात्मक सेटअप में चयापचय व्यवहार की एक बेहतर समझ है कि और अधिक निकटता शारीरिक राज्यों जैसा दिखता दे सकता है ।

Introduction

विनियमित चयापचय गतिविधि कोशिकाओं और एक ऊतक के स्वस्थ समारोह के अस्तित्व के लिए आवश्यक है । विनियमित चयापचय गतिविधि को बड़े पैमाने पर शुरू किया गया है और विभिंन विकृतियों1की प्रगति से जुड़ा हुआ दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, कम चयापचय गतिविधि पहले neurodegenerative रोगों जैसे अल्जाइमर और उम्र से जुड़े स्मृति हानि2,3में वर्णित किया गया था. इसके अलावा, mitochondrial शिथिलता के कारण उंर बढ़ने की प्रक्रिया4,5में शामिल माना जा रहा है । दूसरी ओर, उच्च mitochondrial और चयापचय दर कैंसर कोशिकाओं6, जहां mitochondrial अवरोधकों के उपयोग tumorigenesis7कम में वर्णित किया गया ।

चयापचय गतिविधि का एक readout mitochondria की ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) है । दिलचस्प है, readout के इस प्रकार के मुख्य रूप से पृथक mitochondria या कोशिकाओं से प्राप्त की है, इस प्रकार क्या साहित्य में वर्णित के बहुमत मुख्यतः एक readout है कि शारीरिक राज्य के समान नहीं है पर आधारित है । हालांकि इस तकनीक को लेकर कई कमियां हैं । सबसे पहले, mitochondrial अलगाव के प्रोटोकॉल संभवतः अपनी अखंडता8है, जो एक प्रासंगिक मूर्ति जब युवा बनाम पुराने ऊतकों9से अलग mitochondria तुलना हो सकती है नुकसान कर सकते हैं । इसके अलावा, अलगाव की प्रक्रिया लंबी है और प्रासंगिक प्रोटीन posttranslational संशोधनों जो mitochondrial समारोह9,10,11को विनियमित के नुकसान में परिणाम हो सकता है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि अलग mitochondria लगातार पूरे चयापचय12,13दरों का प्रतिनिधित्व नहीं करते । इस तरह के सेलुलर जैविक जटिलता के रूप में देखा जा सकता है, ' पूरे अपने ' भागों, यानी की राशि से अधिक है , mitochondria एक जटिल कोशिका के अंदर अलग चयापचय दर प्रदर्शित कर सकते हैं जब अलग उनकी चयापचय दर के साथ तुलना में.

जबकि कोशिकाओं अलग mitochondria, एक पूरे ऊतक के संदर्भ में सेल संचार के लिए सेल से readout एक बेहतर ओसीआर की पेशकश कर सकते है खो सकता है । उदाहरण के लिए, मस्तिष्क में, न्यूरॉन्स की चयापचय गतिविधि पड़ोसी glial कोशिकाओं14के चयापचय गतिविधि पर अत्यधिक निर्भर है. जैसे, पूरे ऊतक या पूरे जीवों में ओसीआर की जांच करने के लिए नई तकनीक की स्थापना और विभिन्न विकारों की शुरुआत और प्रगति के लिए और अधिक व्यावहारिक साबित हो सकता है ।

हाल ही में, नई तकनीक इन मुद्दों के समाधान और पूरे ऊतक, खंड, या रहने वाले जीवों से ओसीआर की माप को सक्षम करने के लिए उभरा है । उदाहरण के लिए, हाल ही में एक काम एक आत्मशोधन15के साथ एक permeabilized फाइबर दृष्टिकोण का उपयोग करके एक बीटल उड़ान मांसपेशी से ऑक्सीजन माप की सूचना दी । माइक्रो-respirometry के लिए नई मशीनों अग्नाशय टाप16,17के ओसीआर की माप की अनुमति दें । नतीजतन, यह सूचित किया गया है कि इस प्रौद्योगिकी पूरे कीड़े18 और ज़ेबरा मछली19से ओसीआर की माप में सक्षम बनाता है । हालांकि, पाचन बाधा की उपस्थिति ओसीआर परिवर्तन के संदर्भ में विभिन्न दवाओं के परीक्षण के लिए एक चुनौती पैदा कर सकता है । दिलचस्प है, नेविल और सहयोगियों द्वारा हाल ही में रिपोर्ट अच्छी थाली20,21के साथ एकल drosophila लार्वा मस्तिष्क को मापने के लिए एक नई तकनीक को दिखाया गया है ।

इस अध्ययन में, हम एक समान सेटअप पूरे के रहने वाले और गैर मोबाइल Drosophila22से पूरे ओसीआर के माप को सक्षम करने के लिए इस्तेमाल किया है । यह तकनीक भी एक पूरे क्षेत्र में चयापचय गतिविधि पर विभिन्न दवाओं के प्रभाव को मापने में एक द्वितीयक लाभ प्रदान करता है, पाचन तंत्र बाधा के माध्यम से पारित करने के लिए बिना13,22. उदाहरण के लिए, यह पहले lysine deacetylase अवरोध करनेवाला (KDACi), एक दवा मस्तिष्क में epigenetic तंत्र को बदलने के लिए माना जाता है कि प्रत्यक्ष इंजेक्शन का प्रदर्शन किया गया था, एक बेहतर यादों के गठन के परिणामस्वरूप23. हालांकि, हमारे उपंयास तकनीक का उपयोग करके, हमें पता चला कि KDAC अवरोध के परिणामस्वरूप ओसीआर की एक तेजी से वृद्धि हुई है, जो स्वयं के द्वारा एक योगदान कारक हो सकता है ंयूरॉन गतिविधि में । हमारे प्रोटोकॉल एक पूरे सिर के संदर्भ में ओसीआर पर विभिन्न दवाओं, आनुवंशिक हेरफेर, या शारीरिक राज्यों (रोग, उम्र बढ़ने) के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक सरल और उपंयास विधि प्रदान करता है ।

Protocol

1. साधन तैयारी

नोट: इस प्रयोग के लिए हमने "टाप प्लेट्स" वाले Seahorse XF24 डिवाइस का इस्तेमाल किया है । तकनीक का संचालन माप डिब्बे में पदार्थों को जोड़ने की संभावना के साथ-साथ मिश्रण, प्रतीक्षा और माप के विभिन्न चक्रों का उपयोग करता है ।

  1. प्रयोग की शुरुआत से पहले मशीन को अच्छी तरह से चालू कर दें ताकि वांछित तापमान पर पहुंचने के लिए पर्याप्त समय हो और स्थिर बने रहें ।
  2. सॉफ्टवेयर सेटअप (प्रशासन मोड) में, कारतूस अंशांकन की लंबाई का चयन (यहाँ, 20 मिनट चुना गया था) और वांछित तापमान.
    नोट: जबकि mitochondria या स्तनधारी ऊतक माप आम तौर पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाता है, मक्खी सिर परिवेश तापमान है 25 ° c लेकिन माप के परिणाम पर 31 ° c प्रकाशित कर रहे हैं । हम 31 डिग्री सेल्सियस इस्तेमाल के बाद से यह कमरे के तापमान पर डिवाइस के लिए सबसे कम तापमान सेटिंग है । 25 ° c या कम के तापमान तक पहुंचने के लिए, मशीन को एक ठंडा कमरे में या 11 डिग्री सेल्सियस पर हाल ही में प्रकाशित21के रूप में रखें ।
  3. सॉफ्टवेयर में, निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करें: 3 मिनट मिश्रण-2 ंयूनतम प्रतीक्षा-2 ंयूनतम मापने । प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, एक चुना माप कदम के बाद बंदरगाहों से एक-डी इंजेक्शन कदम जोड़ें ।
    1. गुणवत्ता की जांच के लिए, और बेसल ओसीआर के निर्धारण, पोर्ट ए के माध्यम से पहली दवा इंजेक्शन से पहले कम से कम तीन माप चक्र के लिए प्रतीक्षा करें । प्रोटोकॉल की एक विस्तृत समयरेखा के लिए, संदर्भ बेकर एट अल देखने के लिए कृपया । 13 .

2. कारतूस की तैयारी

  1. पूर्व जांच कारतूस एक दिन (या कम 4 घंटे) से पहले जांचना । जोड़ें Calibrant के १.० मिलीलीटर (पीएच ७.४) के लिए एक अच्छी तरह से और प्लेट और दुकान के शीर्ष पर संवेदक कारतूस प्लेस2 के बिना ३७ ° c पर रात भर के लिए या ७२ ज । parafilm के साथ कारतूस के वाष्पीकरण को रोकने के लिए अगर यह 24 से अधिक एच के लिए हाइड्रेटेड किया जा रहा है ।
  2. प्रयोग की शुरुआत से पहले यह सुनिश्चित करें कि प्रयोगात्मक औषधियों को मध्यम (ताजा मध्यम + २.५% ग्लूकोज) में अच्छी तरह भंग किया गया है ।
  3. उपाय और दवा इंजेक्शन के दौरान किसी भी पीएच अंतर से बचने के लिए वांछित तापमान पर वाहन के पीएच करने के लिए दवा समाधान का पीएच समायोजित करें ।
  4. प्लास्टिक अपने आबंटित इंजेक्शन बंदरगाह के लिए दवा समाधान । उदाहरण के लिए, एक ७७० μL समाधान में 1:10 कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए पोर्ट a के लिए ७७ μL का उपयोग करें और बाद में पोर्ट B के लिए ८५ μL
  5. मशीन में कारतूस लोड और अंशांकन शुरू करते हैं ।

3. थाली तैयारी

नोट: यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि दो लोगों को एक साथ थाली तैयार करते हैं । दो लोगों के प्रति एक थाली तैयारी की अवधि ~ 45-60 मिनट की आवश्यकता हो सकती है ।

  1. 1 एन एचसीएल के साथ वांछित पीएच के लिए ताजा तैयार मीडिया + २.५% ग्लूकोज समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि पीएच तापमान में परिवर्तन से प्रभावित नहीं है ।
  2. एक आइस बॉक्स तैयार है और बर्फ पर एक धातु की थाली जगह है ।
  3. टाप प्लेट (24 वेल प्लेट) पैकेज को खोलें और एक पेट्री डिश (९२ mm x 16 mm) में जाल को मीडिया के साथ विसर्जित करें ।
  4. inserter के साथ एक शुद्ध ले लीजिए (एक छोटा सा उपकरण है कि अच्छी तरह से शुद्ध स्थानों में) और डालने वाला है माइक्रोस्कोप के बगल में खड़े हो जाओ । मीडिया की एक छोटी सी बूंद डालने वाले से जुड़ी नेट में जोड़ें ।
  5. Anesthetize मक्खियों (एक सप्ताह या 4 सप्ताह पुराने गुआंगज़ौ पुरुषों यहां इस्तेमाल किया गया) बर्फ ठंडा धातु की थाली पर मक्खियों रखकर ।
  6. संदंश का प्रयोग, एक मक्खी के पेट हड़पने के लिए और यह माइक्रोस्कोप के तहत एक पेट्री डिश में मीडिया में विसर्जित कर दिया ।
  7. संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करना, धीरे मक्खी के सिर को हटा दें । इसे inserter से जुड़ी नेट के बीच में रखें और यह सत्यापित करें कि सिर मीडिया में डूबे हुए हैं.
  8. केंद्र सिर जब वहां नेट पर उनमें से 16 रहे हैं । सिर को सिर के नुकसान को रोकने के लिए, जबकि उंहें अच्छी तरह से रखने से पहले अनावश्यक तरल पदार्थ निकालें ।
    नोट: 16 फ्लाई प्रमुखों का इस्तेमाल किया गया के रूप में इस संख्या में विधि स्थापना के दौरान थाली तैयारी के एक उचित समय के भीतर पर्याप्त और स्थिर डेटा दिया ।
  9. inserter का प्रयोग, अच्छी तरह से जाल में जगह है । सुनिश्चित करें कि सिर नेट के नीचे फंस रहे हैं । धीरे मीडिया के ७०० μL + २.५% ग्लूकोज (चित्रा 1) जोड़ें । प्रत्येक कुएँ के लिए प्रक्रिया दोहराएँ.
    नोट: फ्लाई सिर के नमूनों के 20 कुओं और प्लेट प्रति पृष्ठभूमि अंशांकन के लिए 4 खाली कुओं की सिफारिश की है । सुनिश्चित करें कि खाली कुओं भी बफर के ७०० μL + २.५% ग्लूकोज के साथ एक शुद्ध होते हैं ।
  10. माइक्रोस्कोप के माध्यम से जाल के तहत हवा के बुलबुले के लिए कुओं की जाँच करें । प्लास्टिक धीरे ऊपर और नीचे एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए । एक विश्वसनीय ओसीआर पढ़ने के लिए केंद्रित प्रमुखों रखो ।
  11. मशीन में थाली जोड़ें और माप शुरू करते हैं ।

4. ओसीआर माप का विश्लेषण

  1. प्रोटोकॉल के अंत में, कारतूस हटा दें ।
  2. एक गुणवत्ता की जांच के रूप में, बंदरगाह fillings में किसी भी दिखाई अवशेष निरीक्षण । त्यागें कारतूस और प्लेट (1 विकल्प) यदि सिर प्रोटीन निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए नहीं कर रहे हैं, उदा, (2 विकल्प देखें) ।
  3. स्प्रेडशीट फ़ाइलों को निकालें और गुणवत्ता ऑक्सीजन और पीएच स्तर के लिए एक अच्छी तरह से जांच करें । सुनिश्चित करें कि पृष्ठभूमि कुओं कोई ओसीआर दिखाने के लिए और है कि ऑक्सीजन का स्तर स्थिर हैं ।
    1. डेटा विश्लेषण के लिए एक एल्गोरिथ्म का उपयोग करें, जिनमें से कुछ संबंधित सॉफ़्टवेयर में चुना जा सकता है । अकोस एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए ओसीआर2 मान यदि पूरे माप के दौरान ऑक्सीजन स्तर की सीमा, के बीच पहली और अंतिम टिक (= उप-माप) दो जैविक नमूनों के बीच समान हैं और पिछले ticks के ऑक्सीजन का स्तर ९५ से कम नहीं हैं ( mmHg) (' सिर ओसीआर इस ऑक्सीजन के स्तर पर स्पष्ट रूप से कम है), (चित्रा 2) ।
    2. कुछ शर्तों के नमूने के कारण एक तेजी से ओसीआर उत्पंन और कम ऑक्सीजन का स्तर 1st टिक और/या पिछले टिक (anoxia) (चित्रा 3ए) में के दौरान प्रदर्शित कर सकते है होगा । ऐसी स्थिति में, कोई वैकल्पिक माप विधि जैसे कि निश्चित एल्गोरिथ्म का उपयोग करें । anoxia में, ओसीआर के समाधान में ऑक्सीजन के निम्न स्तर के कारण बहुत कम है. जैसे, अकोस एल्गोरिथ्म भ्रामक रीडिंग पैदावार ।
      नोट: नई मशीन निश्चित एल्गोरिथ्म का अभाव है । इसलिए, यह कुल ऑक्सीजन के स्तर को निकालने और पहली 3-5 ticks (चित्रा 3) के लिए समय प्रति प्लाट की दर को प्राथमिकता दी है ।

5. (विकल्प 2) सिर खंड के जैव रासायनिक विश्लेषण

  1. एक सिर खंड के जैव रासायनिक (चयापचयों, proteome, आदि) गुणों को मापने के लिए, आवश्यकता के लिए रन समय समायोजित; हालांकि, किसी भी समय प्रोटोकॉल को निरस्त करना और प्लेट हटाना संभव है ।
  2. एक बार प्लेट हटा दिया जाता है, गैर पैनापन संदंश का उपयोग करने के लिए शुद्ध में एक छेद बनाने के लिए और इसे हटाने जिससे सिर जारी फ्लोट ।
  3. एक कट टिप के साथ एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग और एक शीशी के लिए सिर हस्तांतरण ।
  4. जल्दी से बफर और स्नैप-फ्रीज सिर तरल नाइट्रोजन में छोड़ दें । भविष्य के विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर सिर की दुकान ।

Representative Results

उच्च गुणवत्ता ओसीआर माप रिकॉर्ड करने की क्षमता (1 चित्रा) नेट के बीच में सिर केंद्र पर निर्भर करता है । यह XF24 मशीन है, जो नए XFe24 मशीन है जिसमें सेंसर बड़ा है की तुलना में एक जगह छोटे ऑक्सीजन संवेदक स्थान है के लिए महत्वपूर्ण है । के रूप में पहले दिखाया गया है, सिर एक स्थिर ओसीआर प्रदर्शित युवा में कम से 20 लगातार माप के लिए13

मशीनों का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण पहलू सही विश्लेषण लागू करने के लिए है । यह प्रयोगों के दौरान ऑक्सीजन के स्तर की जांच करने के लिए सिफारिश की है । प्रत्येक 2 न्यूनतम माप 10 उप-माप (ticks) में विभाजित है. एक अच्छी तरह से 16 स्वस्थ सिर के साथ आमतौर पर पहली टिक के लिए एक ऑक्सीजन आंशिक दबाव (पीओ2) 140-170 (mmHg) प्रदर्शित करता है । पहले उदाहरण में, हम युवा बनाम midlife मक्खी प्रमुखों (चित्रा 2a और बी) की तुलना में । जबकि ऑक्सीजन का स्तर मध्यम आयु वर्ग के सिर में जल्दी छोड़, मनाया अंतर छोटा है (चित्रा 2a) । इसके अलावा, ऑक्सीजन के स्तर की सीमा के बीच शर्तों के समान है, १६५ के साथ पहली टिक के दौरान १२० अंतिम टिक के दौरान । ऐसे एक मामले में, यह अकोस एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए स्वचालित रूप से ओसीआर (pmol/मिनट)2है, जो मज़बूती से midlife सिर (चित्रा2 बी ) के बीच ऑक्सीजन स्तर ड्रॉप दर्पण पैदा करने के लिए बेहतर है । नोट की, मशीन द्वारा विश्लेषण प्रोग्राम स्वचालित रूप से अकोस एल्गोरिथ्म चुनता है ।

हालांकि, हमारी टिप्पणियों के आधार पर, स्वचालित रूप से अकोस एल्गोरिथ्म का उपयोग भ्रामक दे सकता है, सही ओसीआर के लिए विपरीत परिणाम नहीं तो. ऐसी कलाकृतियों एक अत्यधिक खपत नमूना है जो13anoxia,22तक पहुंच की स्थिति में उत्पंन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, सोडियम butyrate के अलावा (SB), एक KDAC अवरोध करनेवाला, क्षणिक ऑक्सीजन स्तर (चित्रा 3ए) की गतिशीलता बदलता है. जबकि वाहन नियंत्रण पहली और आखिरी ticks के दौरान ऑक्सीजन की स्थिर स्तर प्रदर्शित, एसबी इसके अलावा इन ticks में ऑक्सीजन के स्तर का एक काफी और क्षणिक बूंद (3 ए आंकड़ा) का कारण बनता है । SB द्वारा ही पृष्ठभूमि कुओं, जहां कोई सिर नहीं जोड़ रहे है में ऑक्सीजन के स्तर को बदल नहीं करता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । डेटा धारणा है कि SB ऑक्सीजन की खपत बढ़ जाती है का समर्थन करता है । पहले टिक के संग्रह के रूप में देरी हो रही है (12 सेकंड जब तक पहली टिक मापने चरण में दर्ज किया गया है) पहले डेटा बिंदु पहले से ही कम है एसबी इलाज कुओं में । इसलिए, यह इस HDAC अवरोध करनेवाला के अलावा निंनलिखित ऑक्सीजन की खपत में जल्दी परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, SB इलाज नमूनों में ऑक्सीजन के स्तर को पहले से ही कम स्तर (anoxia) के रूप में पिछले ticks के संग्रह से संकेत के लिए कम कर रहे हैं । anoxia में, सिर पिछले ticks (3ए) में अपनी ऑक्सीजन की खपत को धीमा । क्योंकि अकोस गणना खाते में सभी ticks लेता है और एक anoxic राज्य की अनदेखी, यह एक भ्रामक ओसीआर उत्पंन करता है । दरअसल, गैर सामान्यीकृत अकोस आधारित ओसीआर के स्तर इंजेक्शन पर थोड़ा परिवर्तन दिखाने के (डैश्ड लाइन) बंदरगाह ए (वेः/SB) (चित्र बी) के ।

अकोस के आधार पर पूर्व इंजेक्शन माप के लिए ओसीआर के स्तर को सामान्य करने से पहले और बंदरगाह के इंजेक्शन के बाद एक है, जो ऑक्सीजन स्तर में परिवर्तन (चित्रा 3ए) का समर्थन नहीं करता है ओसीआर के बहुत समान स्तर से पता चलता है. इन परिस्थितियों के तहत, निश्चित एल्गोरिथ्म, जो और अधिक बारीकी से मॉडल/ओसीआर और ऑक्सीजन स्तर में परिवर्तन की सिफारिश की है (आंकड़ा 3सी) । नतीजतन, फिक्स्ड एल्गोरिथ्म सामान्यीकृत माप आधारित एसबी उपचार (चित्रा 3सी) पर एक वृद्धि हुई ओसीआर से पता चलता है.

नई मशीन के साथ एक खामी निश्चित एल्गोरिथ्म का अभाव है । इसलिए, प्रयोगों में जहां अत्यधिक खपत नमूना/उपचार उपयोग किया जाता है, यह करने के लिए अनुशंसित है ओसीआर माप मैन्युअल रूप से, और प्रत्येक माप में पहली 3-5 ticks के लिए प्रति समय ऑक्सीजन के स्तर में कमी की गणना.

Figure 1
चित्रा 1 . एक अच्छी तरह से युक्त १६ १-पुरुष मक्खियों के सप्ताह पुराने सिर का एक उदाहरण है । सिर एक नेट के नीचे केंद्रित है और मीडिया में तैर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . एक सप्ताह पुराने मक्खी प्रमुखों (युवा) और चार सप्ताह पुरानी मक्खी प्रमुखों (मध्यम आयु) के बीच ओसीआर माप तुलना का एक प्रतिनिधि उदाहरण । (क) ऑक्सीजन का स्तर तीन अलग माप के लिए दिखाया गया है; प्रत्येक 2 न्यूनतम माप दस उप-माप (ticks) में विभाजित है. (ख) (क) का एक ठहराव. प्रथम और अंतिम ticks के स्तर समान हैं, हालांकि मध्य आयु के नमूने के स्तर थोड़ा कम कर रहे हैं । ऑक्सीजन के स्तर में कमी की ढलान की एक ठहराव के लिए ओसीआर के स्तर को उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है । के रूप में पहले22वर्णित है, मध्य आयु वर्ग मक्खियों के ओसीआर 10%-15% युवा मक्खियों से अधिक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . सोडियम butyrate द्वारा ओसीआर के परिवर्तन का एक उदाहरण (SB) युवा मक्खी सिर में । (क) ऑक्सीजन का स्तर सात माप से दर्ज 15 मिमी SB के अलावा के बाद । डैश्ड रेखा पोर्ट A से दवा (या वाहन) के इंजेक्शन को चिह्नित करती है । नोट की, जबकि 1 और 10 ticks के ऑक्सीजन का स्तर नियंत्रण समूह (नीला) में स्थिर रहते हैं, इन ticks के दौरान ऑक्सीजन का स्तर क्षणिक है (इंजेक्शन के बाद छह माप) एसबी उपचारित नमूनों (नारंगी) में कमी. इसके अलावा, ऑक्सीजन के स्तर में कमी बहुत SB इलाज नमूनों की अंतिम ticks के दौरान कम है । N = प्रति समूह 3 (ख) [वाम] गैर सामान्यीकृत ओसीआर स्तर अकोस एल्गोरिथ्म से गणना की । गणना गलत ओसीआर के समान स्तर से पहले और बाद में पोर्ट द्वारा SB के इंजेक्शन से पता चलता है a. [सही] ओसीआर की माप करने के लिए पहले पोर्ट ए के इंजेक्शन करने के लिए सामान्यीकरण (C) [बाएँ] ' फिक्स्ड ' एल्गोरिथ्म गणना (A) गैर-सामान्यीकृत ओसीआर दिखा . यहां, ओसीआर बारीकी से SB उपचार पर सिर के ऑक्सीजन के उपयोग में क्षणिक वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है; सही ओसीआर की माप करने से पहले बंदरगाह के इंजेक्शन के लिए एक. Error सलाखों सभी रेखांकन में S.E.M. संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हमारी नई तकनीक एक उपंयास के लिए उंर बढ़ने और रोग में चयापचय परिवर्तन के अध्ययन के लिए पूरी मक्खी प्रमुख क्षेत्रों22के संदर्भ में दृष्टिकोण प्रदान करता है । विधि ऑक्सीजन की खपत पर KDAC सोडियम butyrate के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूल हो सकता है । जैसा कि हम प्रदर्शन किया है, lysine deacetlyase अवरोधकों (HDACs/KDACs) ओसीआर परिवर्तन में परिणाम । मूलतः, इस तरह के अवरोधकों के लक्ष्य के रूप में आम तौर पर mitochondria में स्थानीयकृत नहीं कर रहे है (इन अवरोधकों वर्ग III deacetylases प्रभाव नहीं है, Sirtuins)24, ऐसी दवाओं केवल एक पर परीक्षण किया जा सकता है कम ऊतक स्तर. वास्तव में, विभिन्न दवाओं सीधे मस्तिष्क को इंजेक्ट कर रहे हैं, इस प्रकार पाचन तंत्र द्वारा संभव प्रसंस्करण/संशोधन/निष्क्रियता को दरकिनार । जैसे, हमारी तकनीक में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कैसे इस तरह की दवाओं सीधे सिर खंड प्रभाव ।

इसमें कई अहम कदम उठाए गए हैं । पहले, के रूप में प्रोटोकॉल में कहा गया है, हम बहुत से एक घंटे के तहत एक थाली की तैयारी की सिफारिश हाथ के दो जोड़े के साथ थाली तैयार । हमारे अनुभव से, गुणवत्ता और ओसीआर माप की स्थिरता बेहतर है जब एक समय पर ढंग से तैयार कर रहे हैं । जब भी लंबे समय लेने, कम ओसीआर खपत कुओं की घटना बढ़ रही है, साथ ही स्थिर ओसीआर की कम अवधि. दूसरा, यह एक गुणवत्ता की जांच का संचालन और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि विभिंन नमूनों के बीच प्रयोगात्मक शर्तों (पीएच, ऑक्सीजन का स्तर) समान हैं । अंत में, एक महत्वपूर्ण कदम सही एल्गोरिथ्म का चयन करने के लिए नमूने का विश्लेषण है । जैसा कि हम का प्रदर्शन किया है, डिफ़ॉल्ट अकोस एल्गोरिथ्म एक भ्रामक और कभी नहीं नमूनों में गणना का विरोध है कि उच्च दर13पर ऑक्सीजन की खपत उपज । इसलिए हम ऑक्सीजन के स्तर के लिए कच्चे डेटा की जांच के महत्व और परिणामस्वरूप ओसीआर तुलना तनाव ।

वर्तमान में, इस तकनीक के साथ कई सीमाएं हैं । कमरे के तापमान पर, मशीन 31 डिग्री सेल्सियस तक तपता है (यह न्यूनतम मापने तापमान है, जबकि मशीन कमरे के तापमान पर है), जो मक्खी25सिर के लिए एक तनाव राज्य का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । हालांकि यह एक ठंडे कमरे में मशीन रखकर दूर किया जा सकता है, जो 25 डिग्री सेल्सियस पर माप सक्षम हो जाएगा और इसलिए मक्खी सिर करने के लिए एक संभव गर्मी तनाव के बिना । हाल की रिपोर्ट 11 डिग्री सेल्सियस पर मशीन रखने का प्रदर्शन किया है, इस प्रकार 25 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों के ओसीआर रिकॉर्डिंग सक्षम करने से21। फिर भी, मक्खी सिर जुदाई कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए । इसके अलावा, तापमान उतार चढ़ाव यह पीएच परिवर्तन को नियंत्रित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है और इसलिए यह अत्यधिक इसी प्रायोगिक setups का उपयोग करके ओसीआर पर शारीरिक स्थितियों/दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा गैर mitochondrial-स्वतंत्र तंत्र द्वारा ऑक्सीजन खपत के योगदान को अभी तक२६नहीं स्थापित किया गया है. विभिन्न श्वसन अवरोधकों कि मक्खी प्रमुखों में कुशल हैं का उपयोग करके, यह इस तरह के गैर mitochondrial ऑक्सीजन खपत दर स्थापित करने के लिए संभव होगा.

यह उल्लेखनीय है कि विभिंन स्तनधारी विकृतियों ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन की विशेषता है । उनमें रोग है कि या तो चयापचय कमी जैसे अल्जाइमर रोग या कैंसर के रूप में चयापचय तारों की विशेषता है । दिलचस्प है, KDAC अवरोधकों दोनों अल्जाइमर रोग और कैंसर के उपचार के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं27. जबकि सटीक तंत्र है जिसके द्वारा KDAC अवरोधकों चिकित्सकीय पहलू को प्राप्त कर रहे है स्पष्ट नहीं रह, हमारी तकनीक से डेटा उपंयास धारणा है कि ऐसे अवरोधकों चयापचय मिलाना का समर्थन करता है ।

संक्षेप में, इस विधि में vivo में समग्र ऑक्सीजन खपत दर को मापने के लिए मूल्यवान है और अधिक सही सामान्य चयापचय पर दवा प्रभाव प्रदर्शित करता है, जो अलग mitochondria प्रोटोकॉल12में अनदेखी की जा सकती है. उदाहरण के लिए, इस विधि से प्राप्त परिणाम, बजाय पिछले तकनीक, KDAC उपचार पर उंर के लिए उपंयास अंतर्दृष्टि जुड़े चयापचय में लचीलापन फंसाया है । जबकि अतिरिक्त काम के लिए उड़ान सिर के लिए प्रयोगात्मक शर्तों का अनुकूलन आवश्यक है, हमारी तकनीक और उपयुक्त विश्लेषण के संयोजन के पूरे रहने वाले ऊतकों के संदर्भ में mitochondrial गतिविधि के आगे elucidation के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम व्यापक प्रयोगात्मक समर्थन के लिए एंड्रियास Ladurner, कार्ला Margulis और उनकी टीमों को धन्यवाद । हम पांडुलिपि पर उसकी टिप्पणी के लिए केटलीन Ondracek धंयवाद । हम इस तकनीक के प्रारंभिक चरणों की स्थापना में हमें सहायता के लिए सोफिया Vikstrom शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी उसके तकनीकी मदद के लिए Sanderhoff मई धंयवाद । पौंड जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (Infrafrontier अनुदान 01KX1012) द्वारा वित्त पोषित है । एसपी ने एक AXA रिसर्च फंड postdoctoral फेलोशिप और NSFC (ग्रांट नंबर ८१८७०९००) से पैसा जुटाया था । AVV QBM द्वारा वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8644 D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium Agilent 103575-100 Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate Merck 817500 Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit Agilent 100850-001 Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates Agilent 101122-100 Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool Agilent 101135-10 Insertor
Petri dish Sarstedt 821,472 Petri dish 92 x 16 mm

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References

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मापने और पूरे मक्खी प्रमुख क्षेत्रों में ऑक्सीजन की खपत दर की व्याख्या
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Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).More

Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).

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