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Biology

Bovine Brustdrüse Biopsie-Techniken

Published: December 23, 2018 doi: 10.3791/58602
Automatic Translation
1,4, 2, 3, 4, 3, 5, 5, 4, 2, 6, 4
1National Animal Nutrition Program, a National Research Support Project (NRSP-9), Department of Animal and Food Sciences, University of Kentucky, 2School of Performing Arts, Virginia Tech, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, The Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 4Department of Dairy Science, Virginia Tech, 5Department of Animal Biosciences, University of Guelph, 6School of Visual Arts, Virginia Tech

Summary

Dieser Artikel stellt eine bovine Brustdrüse Biopsie mit Kern und Nadel-Biopsie-Tools. Geernteten Gewebe einsetzbar für die Zellkultur oder Mamma Physiologie und Stoffwechsel einschließlich Genexpression, Proteinexpression Protein Änderungen, Immunohistochemistry und Metabolit Konzentrationen zu bewerten.

Abstract

Bovine Brustdrüse Biopsien erlauben Forschern, Gewebeproben zur Zellbiologie Genexpression, histologische Analyse, Signalisierung, Wege und Protein Übersetzung einschließlich Untersuchung zu sammeln. Dieser Artikel beschreibt zwei Techniken für die Biopsie der bovinen Brustdrüse (MG). Drei gesunde Holstein Milchkühe waren die Themen. Vor Biopsien wurden Kühe gemolken und anschließend in ein Rinder-Rutsche zurückgehalten. Analgetikum (Flunixin Meglumine, 1,1 bis 2,2 mg/kg Körpergewicht) war über Vena intravenöse [IV] Injektion 15-20 min vor Biopsie verabreicht. Für stehende Sedierung, Xylazin-Hydrochlorid (0,01-0,05 mg/kg Körpergewicht) über dem Steißbein Gefäße injiziert wurde ca. 5-10 min. vor dem Eingriff. Sobald ausreichend sediert, war die Biopsie Website aseptisch vorbereitet und lokal mit 6 mL 2 % Lidocain Hydrochlorid durch subkutane Injektion betäubt. Mit aseptischen Technik machte ein vertikalen Schnitt 2 bis 3 cm, mit einem Skalpell Nummer 10. Kern und Nadel-Biopsie-Werkzeuge wurden verwendet. Das Core-Biopsie-Tool war ein Akku-Bohrschrauber zugeordnet und in der MG-Gewebe durch den Schnitt mit einer clockwise Bohrer Aktion eingefügt. Das Nadel-Biopsie-Tool wurde manuell in der Schnitt-Website eingefügt. Unmittelbar nach dem Eingriff Assistent Druck ausgeübt auf die Schnitt-Website für 20 bis 25 min mit einem sterilen Handtuch Blutstillung zu erreichen. Chirurgischen Klammern aus rostfreiem Stahl wurden verwendet, um die Hautinzision zu widersetzen. Die Klammern wurden entfernt 10 Tage postoperativ. Die wichtigsten Vorteile von Kern und Nadel Biopsien ist, dass beide Ansätze sind minimal-invasive Verfahren, die bei gesunden Kühen sicher durchgeführt werden können. Milchleistung nach der Biopsie war davon nicht betroffen. Diese Verfahren erfordern eine kurze Erholungszeit und weniger Risiken von Komplikationen führen. Bestimmte Einschränkungen zählen Blutungen nach der Biopsie und die Infektion auf die Biopsie-Website. Anwendungen dieser Techniken gehören Gewebe Sammlung für klinische Diagnostik und Forschungszwecke, z. B. Primärzelle Kultur.

Introduction

Eine Biopsie ist ein Verfahren, um einen Kernabschnitt des Gewebes von Themen für medizinische oder wissenschaftliche Zwecke zu ernten. Es ist eine minimal-invasive und am weitesten verbreiteten Technik, Gewebe als Alternative zur Euthanasie1 zu sammeln, um Analyse der Gewebe Antworten auf Behandlung oder andere Faktoren von Interesse zu ermöglichen. Proben von Rindern Brustdrüse (MG) Gewebe sind unerlässlich für die Molkerei Forschung gen und Protein-Expression, Histologie, die Organisation der zellulären Organellen, Signalwege und metabolischen Prozesse als Reaktion auf Änderungen im Management zu studieren oder die Umgebung. Darüber hinaus braucht man zu diagnostizieren und Forschung bestimmte Infektionskrankheiten wie bovinen Mastitis verursacht durch bakterielle Infektionen2MG Gewebe.

Das Euter von Rindern enthält vier separate Drüsen und jede Drüse enthält eine unabhängige sekretorischen Milchsystem zusammenfassend bezeichnet Parenchym. Der Alveolen, Kanäle und Bindegewebe sind in der Brust Parenchym vorhanden. Die Alveolen sind mikroskopisch kleine kugelförmige hohlen Strukturen, die von Epithelzellen in der Innenfläche (luminalen) bestehen und spezialisierten myoepithelialen Zellen auf der äußeren Oberfläche (basal). Die Alveolen sind verantwortlich für die Synthese und Sekretion von Milch. Das faserige Bindegewebe in das Parenchym vorhanden kann eine Gruppe von Alveolen von anderen Gruppen der Alveolen zu trennen, und jede Gruppe nennt man ein Lobule3. Mehrere Faktoren beeinflussen die Entwicklung und Funktion des einschließlich Tierphysiologie, Ernährung, Management, Genetik und die Umwelt4MG. Mastitis ist auch ein entscheidender Faktor, der MG-Funktion und Milch Qualität5beeinträchtigt. Die Toxine veröffentlicht durch mastitic Erreger können Schäden an den Lungenbläschen und induzieren Nekrose biochemischen und histologischen Veränderungen in der MG-Gewebe-6. Die Histologie und Stoffwechselprozesse der einzelnen Alveolen oder Lobule in der MG können somit deutlich von anderen unterscheidet. Als solche sind Biopsien, die repräsentative Proben der gesamten Brustdrüse sind wünschenswert. Kleine Biopsien können nur eine einzelne Lobule oder einzelne Alveole, Begrenzung der daraus resultierende wissenschaftlichen oder diagnostische Informationen erfassen. Für wissenschaftliche Zwecke, ist es notwendig zu wissen, dass eine Brust Biopsie eine "Momentaufnahme" der Gewebemerkmale bietet aber eine Biopsie nicht ausreichend total Mamma Funktion bei fehlender Schätzungen der gesamten Brustdrüse charakterisieren kann Masse.

Verschiedene Biopsie-Tools wurden in den letzten 30 Jahren für den menschlichen Gebrauch entwickelt. Anpassungen dieser Instrumente stehen derzeit für den Einsatz mit Tieren. Für Milchvieh wurden mit verschiedenen Techniken wie die chirurgische Exzision (stumpfe Dissektion)7, Biopsie Nadeln1,8und Kern Biopsie Instrumente9,10MG Gewebeproben gewonnen. So haben MG Biopsie-Techniken bei laktierenden Milchkühen aus Verfahren mit Liegerad Sedierung mit chirurgischen Präparation mit Elektrokauterisation Blutstillung in 19927 Sammlung von Kern Biopsien unter ständigen Sedierung9umgestellt, 10,11,12. Chirurgischen Biopsie ist eine invasive Methode, die kann teuer sein und haben eine höhere Inzidenz von Komplikationen wie Hämatom, Wunde Probleme und Tumor ausgebreitet13. Derzeit wurden Core Biopsie und Nadelbiopsie (auch bekannt als ein Tru-Cut Biopsie) weithin als Alternative zum chirurgischen Biopsie verabschiedet. Zu den Vorteilen von Kern und Nadel Biopsien im Vergleich zu chirurgischen Biopsie gehören: das Verfahren ist minimal-invasive; größere Komplikationen sind selten; Vollnarkose ist nicht erforderlich; Das Verfahren ist schnell Verwandte; die Erholungszeit ist kurz; Es gibt minimale negative Auswirkungen auf die Eutergesundheit und nur kurzfristige Auswirkungen auf Milch Ertrag und Komposition8,9,10; und kostet weniger als chirurgische Biopsie13.

Ein Kern Biopsie beschriebene 1996 verwendet eine sterile, Edelstahl-Kanüle mit einer abnehmbaren einziehbare Klinge an eine repräsentative Anzahl von Gewebe aus der bovinen MG ohne Vollnarkose9,10,11 entfernen ,12. Während des Verfahrens wurde das Instrument auf einen Akku-Bohrschrauber, erstellen Sie eine niedrige Geschwindigkeit, Drehbewegung, die einen Kern Gewebe sauber geschnitten, wie das Werkzeug in das Gewebe fortgeschritten war gelegt. Der Vorteil war eine größere Gewebe Probe (70 mm x 4 mm im Durchmesser, ca. 0,75 bis 1 g) 9. Eine aktuelle Studie10 zeigte, dass die Biopsie-Verfahren von V. C. FarrEt Al. beschrieben 9 kann zur wiederholten MG Gewebe Sammlungen ohne negative Auswirkungen auf die Gesundheit von laktierenden Milchkühen Leistung und Euter durchführen. Vor kurzem wurde eine Studie14 bei Milchkühen auszuwertende wiederholte Biopsien des MG-mit einem größeren Trokar (31 cm lang, äußeren Durchmesser von 9,5 mm, Innendurchmesser von 8 mm) mit Vakuum an einem internen Edelstahl-Kanüle, um die Biopsie zu sammeln durchgeführt . Diese Methode verwendet (Xylazin) Sedierung und örtlicher Betäubung (2 % Lidocain Hydrochlorid).

Die Nadelbiopsie ist eine andere Technik, Milch-Gewebe zu sammeln. Mehrere Studien haben diese Technik übernommen. Eine Studie1 verwendet (Detomidine) Sedierung und örtlicher Betäubung (1 % Lidocain) in dem Verfahren. Nach der Biopsie erhalten die Kühe eine prophylaktische Behandlung mit Antibiotika. Die Brustdrüse wurde manuell vor und nach dem Melken massiert. Blut in der Milch wurde nach der Biopsie für bis zu 84 h beobachtet. Die Menge und Zusammensetzung der Milch waren für einen kurzen Zeitraum hinweg betroffen. Vor kurzem zum eine Studie eine Biopsie-Nadel wiederholten MG Biopsien Milchkühe8ausführen. Sedierung (1 % Acepromazine, intramuskuläre) und örtlicher Betäubung (2 % Lidocain Hydrochlorid, subkutane) wurden den Tieren verabreicht. Die Tiere erhielten keine durch Medikamente oder Antibiotika, vor oder nach dem Eingriff, und es gab keine Anzeichen einer Infektion bei der Biopsie-Website während der postoperativen Periode. In dieser Studie hatte wiederholte bovine MG Biopsien mit einer Nadel eine geringe negative Auswirkungen auf die Gesundheit der Milchkühe Milch Produktion und Euter. Im Allgemeinen scheint die Nadelbiopsie eine weniger invasive Methode als die Core-Biopsie-Instrument. Jedoch wie bereits erwähnt, ist es unerlässlich für die Biopsie-Technik, eine repräsentative Stichprobe von MG Gewebe zu ernten. Die Beschränkung der eine Nadelbiopsie ist, daß eine kleine Menge des bovinen MG Gewebe (ca. 20 bis 25 mg) ergibt8,15.

Fast alle Studien verwendet eine Kombination aus α-2-Agonist Sedierung und örtlicher Betäubung8,9,10, ob die Biopsie über eine Nadel oder einen größeren Kern war. In der bovinen MG sind die meisten Nervenenden der Haut zugeordnet. Innervation der parenchymal Gewebe erfolgt weitgehend über Dehnungsrezeptoren mit spärlichen Typ Nervenfasern, scharfe Schmerzen Operation zu erkennen. Infolgedessen, physiologische Mechanismen des Schmerzes durch chirurgische Manipulation des MG erfolgt über Haut und subkutanes Gewebe3 und nicht tief Geweben wie parenchymal Gewebe. Deshalb für die Biopsie-Verfahren, nur notwendig, um die Haut und subkutanes Gewebe lokal betäuben wie Infiltration von Lokalanästhetika in das tiefer gelegene Gewebe Schmerzen Operation nicht wesentlich verringert. Nach einer entsprechenden Vorbereitung des Bereichs Biopsie ist Tier Beschwerden in erster Linie, verbunden mit Zurückhaltung.

Sammlung von größeren Bohrkernen kann Hämatombildung zu erhöhen und erhöhen das Risiko einer Infektion innerhalb der MG-Parenchym. Daher enthalten Peri-operativen Protokolle oft Verabreichung von parenteralen Antibiotika7, aber das ist nicht Universalien8. Blutstillung zu erreichen ist auch ein wichtiger Faktor zur Verringerung der Morbidität der Kuh. In der genannten Studie mit einem großen Kern Biopsie Instrument14, manuellen Druck auf die Biopsie Website angewendet wurde und ein Kuh-BH wurde verwendet, um Eis für die Wunden für mindestens 2 h nach dem Eingriff gelten. Trotz der großen Menge des Gewebes geerntet nur leichten Rückgang der feed-Aufnahme und Milch Ertrag wurden beobachtet, und die Prozedur wiederholte sich alle drei Wochen ohne negative Auswirkungen auf die Gesundheit der Kuh.

Forscher, die Durchführung von MG-Biopsie bei Milchkühen müssen berücksichtigen die diagnostischen oder analytischen Qualität der daraus resultierenden Biopsie, einfache Technik und Kuh Morbidität. Präzise und vorgeplante Operationstechniken sind zwingend notwendig, um diese Ziele zu erreichen. Bisher MG Biopsie Studien konzentrierten sich auf die Beschreibung der Ergebnisse der Biopsie, im Gegensatz zu beschreiben, die Biopsie Technik an sich, und Beschreibungen für die laktierenden Milchkühe fehlen ausreichend detailliert um Replikation zu ermöglichen. So war das Ziel dieser Arbeit, Nadelbiopsie und größeren Kern-Biopsie-Techniken ermöglichen sichere und humane Replikation der MG-Biopsie von Rindern ausreichend detailliert zu beschreiben.

Protocol

Alle beschriebene Methoden wurden von der Virginia Tech institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) zugelassen.

(1) Personal

  1. Haben Sie mindestens zwei Helfer mit chirurgischen und Kuh-Handling Erfahrung.
  2. Trainieren Sie alle Assistenten mindestens dreimal, wenn möglich mit cadaveric Material vor der Durchführung von Verfahren in Zusammenhang mit diesem Protokoll an lebenden Tieren.
    Hinweis: Ausbildung durchgeführt werden von einem Instruktor, der wurde vorher trainiert und die Technik durchgeführt.
  3. Eine große Tier Tierarzt auf-Hand für Medikamentengabe und im Falle, dass Notfallbehandlung während des Eingriffs notwendig wird. Notfälle, die während dieses Vorgangs auftreten, umfassen sind aber nicht beschränkt auf: Blutung, α-2-Agonist Überdosierung und Lungenödem, Regurgitation und Aspiration von Nahrung Material, Schmerz und geduldig Widerstand erfordert weitere Sedierung.

2. Vorbereitung der chirurgischen Instrumenten, Zubehör und Einrichtung

  1. Inventar und kaufen alle Ausrüstungen und Zubehör (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Sauber und Autoklaven OP-Abdeckungen, Biopsie Instrumente Skalpell Halter, chirurgische Handtücher und Zange.
  3. Haben Sie ein korrekt dimensionierter Squeeze Rutsche und Leiter Tor zu die Kühen zu bändigen.
  4. Etablieren Sie einen Arbeitsbereich mit einem Tisch in der Nähe der Squeeze-Rutsche.
  5. Stellen Sie sicher, dass der Arbeitsbereich sauber und eine Kuh Durchgangsverkehr begrenzte hat.
  6. Ausrüstungen und Zubehör im Arbeitsraum für einen einfachen Zugang zu organisieren.
  7. Haben Sie richtigen Beleuchtung in den Arbeitsraum.

3. Vorbereitung der Tiere

  1. Waschen Sie einen Tag vor der geplanten Biopsie, und Schrubben Sie das Tier, besonders das Euter, Gülle und verschmutzte Material zu entfernen.
  2. Verfahren Sie für sichere und humane Zurückhaltung von Rindern.
  3. Im Vorfeld der Biopsie und zum Zeitpunkt der Biopsie erneut bewerten Sie die Gesundheit, Kondition und das Verhalten des Tieres.
    Hinweis: Eine minimale Prüfung umfasst Temperatur, Puls und Atemfrequenz sowie Prüfung für Dermatitis über die vorgeschlagenen Operationsstelle oder in anderen Bereichen der bakteriellen Infektion. Milchproben aus jedem Quartal sammeln und prüfen für Mastitis.
  4. Verwenden Sie nur gesunde Kühe.
  5. Komplett Milch der Kuh.
  6. Verschieben Sie das Tier in die Squeeze-Rutsche, im Idealfall innerhalb von 2 h zur Minimierung von Milch Präsenz in den Drüsen zu melken.
  7. Zurückhalten Sie, das Tier mit einem Kopf-Tor.

(4) Analgesie und Sedierung

  1. Legen Sie ein Seil Halfter am Kopf der Kuh zu verhindern rückwärts und vorwärts Bewegung.
  2. Ziehen Sie den Kopf des Tieres auf der einen Seite, und binden Sie das Seil um die Squeeze-Rutsche mit einem Schnellspanner Knoten um den Kopf zu fixieren.
  3. Reinigen Sie den Bereich der Injektion mit einem 70 % Isopropyl-Alkohol-Tupfer und verabreichen Sie Flunixin Meglumine (1,1 bis 2,2 mg/kg Körpergewicht) über die Halsschlagader 15-20 min vor an Biopsie intravenös.
    Hinweis: In einigen Protokollen sind nach der Biopsie nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente verabreicht, wenn Antirheumatika Forschungsergebnisse nicht beeinträchtigt werden.
    1. Suchen Sie die Halsschlagader.
    2. Erhöhen Sie die Halsschlagader durch Anwendung von Druck an der Basis der Vena Nut.
    3. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Spritze gibt.
    4. Stechen Sie die Nadel in der angehobenen Halsschlagader und ziehen Sie 0,5 mL Blut in die Spritze zweimal und mischen Sie mit dem Inhalt. Wenn kein Blut in die Spritze zeigt, verlagern Sie die Nadel. Wenn die Nadel in die Vene ansässig ist, den Inhalt zu injizieren.
    5. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig.
    6. Gelten Sie Gaze mit sanftem Druck auf die Injektionsstelle, um Blutungen zu verhindern.
  4. Xylazin-Hydrochlorid intravenös verabreichen (0,01 bis 0,05 mg/kg Körpergewicht) in das Steißbein Schiff ca. 5-10min vor Biopsie damit genügend Zeit für die Einrichtung der Sedierung.
    Achtung: Prüfen Sie das Tier auf Anzeichen von Lungenödem. Klinische Anzeichen von Lungenödem sind Atemnot, schwere Dyspnoe, Schwierigkeiten beim Atmen, Husten, schaumigen Sputum und blaue Zunge. Wenn Anzeichen von Lungenödem beobachtet werden, empfiehlt es sich, Tolazine (2 bis 4 mg/kg Körpergewicht) verwenden, um den Xylazin Folgen entgegenzuwirken.
    1. Heben Sie das Heck an und reinigen Sie den Bereich der Injektion mit einem 70 % Isopropyl-Alkohol-Tupfer.
    2. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Spritze gibt.
    3. Stechen Sie die Nadel in das Gefäß Schweif, ziehen Sie 0,2 mL Blut in die Spritze und mischen Sie mit dem Inhalt um sicherzustellen, dass die Nadel in das Gefäß ansässig ist. Wenn die Nadel in das Gefäß ansässig ist, injizieren Sie den Inhalt der Spritze.
    4. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig.
    5. Gaze mit sanftem Druck auf die Injektionsstelle anwenden.

5. Vorbereitung des Standortes Biopsie

  1. Haben Sie einen Assistenten das Protokollfragment für das Verfahren zu binden.
  2. Wählen Sie in der Biopsie auf das Euter (in der Regel in einen oberen Bereich, Sammlung von Bindegewebe zu minimieren und vermeiden das Eindringen in die Drüse Zisterne, Abbildung 1), und entfernen Sie verschmutzte Material oder Gülle von der ausgewählten Biopsie-Website.

Figure 1
Abbildung 1 . Bild des bovinen Euters zur Veranschaulichung der Biopsie Website. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

  1. Beobachten und Ertasten der Haut mit besonderem Augenmerk auf alle großen subkutanen Blutgefäße zu identifizieren, um diese Schiffe während der Biopsie zu vermeiden.
  2. Schneiden Sie das Haar von einem 15 x 15 cm-Bereich rund um die Biopsie-Website.
  3. Bereiten Sie den Biopsie-Bereich mit Povidon-Jod (0,75 % verfügbar Jod) oder Chlorhexidin Gluconat Scheuern vor. Wechseln Sie sich mit 70 % Isopropylalkohol mindestens drei Mal, um alle sichtbaren und unsichtbaren Ablagerungen zu entfernen. Gelten Sie die aseptische Peeling-Lösung und Isopropyl-Alkohol in einer kreisförmigen Bewegung mit Inside-out-Ansatz. Sicherstellen Sie, dass die antiseptische Peeling-Lösung in Kontakt mit der Haut mindestens 5 min lang bleibt.
  4. Verwenden Sie einen Schmetterling Infusionsset mit einer Nadel 18 G 6 mL 2 % Lidocain Hydrochlorid subkutan an der Schnitt Stelle erstelle ich einen Zeilenblock einzahlen. Nicht in das tiefere Gewebe eindringen.
    Hinweis: Dosierung von Lidocain variiert zwischen 3 und 8 mL.
  5. Lassen Sie das Lokalanästhetikum, für 3 bis 5 min. führen Sie eine weitere Wiederholung der Peeling-Lösung und Alkohol vor dem Schnitt zu verbreiten. Während des Wartens, bereiten Sie die Biopsie Instrumente.

(6) Biopsie-Verfahren

  1. Verwenden Sie aseptische Techniken beim Handhaben der Biopsie und für den Schnitt.
  2. Waschen Sie Hände entfernen alle sichtbaren Verunreinigungen und sterile OP-Handschuhe gelten.
  3. Die chirurgischen Instrumente in einen sterilen Bereich in der Reihenfolge ihrer Verwendung zu vereinbaren. Haben Sie Nummer 10 Skalpell, sterile Gaze, montierte Biopsie Instrument und einem sterilen Handtuch für die Blutstillung.
    Hinweis: Führen Sie Schritt 1 eine Core-Biopsie durchführen oder Schritt 2 eine Nadelbiopsie durchführen.

Figure 2
Abbildung 2 . Schematische Darstellung der Montage und Einstellung des Werkzeugs Kern Biopsie von V. C. Farr, Et Al. beschrieben 9 Maßstab ist 1 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Core-Biopsie-Instrument (Farr Et Al.9)
    1. Montieren Sie das Kern-Biopsie-Instrument mit sterilen Handschuhen (Abbildung 2).
      1. Legen Sie die 7 sterile Stücke auf ein steriles Tuch (Abbildung 2A).
      2. Legen Sie die Klinge (1 Stück) in das Andocksystem in Teil 2 (Abb. 2 b ).
        Achtung: Legen Sie Finger nicht direkt in der Klinge.
      3. Legen Sie 3 oben auf Teil 2 (Abbildung 2) sicherzustellen, dass die docking-Station ausgerichtet wird.
        Eine docking-System in der Innenwand des Stückes 4 (Abb. 2D) beachten.
      4. Engagieren Sie sich die letzte Kante des Blatts (Teil 1) in das Andocksystem Stück 4 (Abb. 2D).
      5. Vorantreiben Sie 4 Stück und beobachten Sie, ob 4 Stück neben Stück 3 (Abb. 2E).
      6. Legen Sie 5 auf dem Gerät (Klinge + Teil 2) (Abb. 2F).
      7. Stellen Sie sicher, dass die docking-Station ausgerichtet ist (Abbildung 2).
      8. Oberen Rand Stück 2 Stück 6 einfügen (gegenüberliegende Seite der Klinge) (Abb. 2 H)
      9. Stellen Sie sicher, dass die docking-Station ausgerichtet ist (Abb. 2 H).
      10. Legen Sie die Klemmschraube (7 Stück) in der Docking-Station (Abbildung 2I).
      11. Schieben Sie Teil 3 (schwarz) zur Deckung der Klemmschraube nach vorne.
        Achtung: Legen Sie Finger nicht auf die Klinge-Ausfahrt.
      12. Aktivieren Sie das Werkzeug 4 Stück vorantreiben und beobachten Sie die Klinge außerhalb des Werkzeugs.
      13. Ziehen Sie Stück 4 zurück, um die Klinge in das Werkzeug (gebrauchsfertig) einfahren.
        Hinweis: Die Klinge sollte aktiviert werden, nur dann, wenn das Tool den gewünschten Abstand innerhalb des Gewebes biopsiert werden eingedrungen ist.
    2. Sicherstellen Sie, dass die Kuh ausreichend sediert ist und die Biopsie Website ausreichend betäubt. Drücken Sie die Haut um keine Reaktion zu gewährleisten.
    3. Machen Sie einen 2 bis 3 cm vertikalen Schnitt durch die Haut und subkutanes Gewebe von proximal nach distal mit einem Skalpell Nummer 10.
    4. Legen Sie das Biopsie-Instrument auf einen Akku-Bohrschrauber mit steriler Technik.
    5. Setzen Sie den Bohrer gegen die Biopsie-Tool und überprüfen Sie, ob das Werkzeug der Bohrer fest zugeordnet ist.
    6. Angemessene Zurückhaltung zu gewährleisten, indem er eine Person, die das Heck bei allen Verfahren zu erheben.
    7. Schalten Sie den Bohrer mit Drehung im Uhrzeigersinn und eine niedrige Geschwindigkeit.
      Hinweis: Der Bohrer ist nicht steril, und der Betreiber bleibt nicht steril, wenn Sie den Bohrer zu verwenden.
    8. Vorantreiben Sie das gesamte Biopsie-Tool (ca. 7,5 cm) in das Euter durch die Inzision, während die Bohrmaschine die Maut dreht.
    9. Schalten Sie den Bohrer und erweitern Sie 4 Stück des Werkzeugs manuell.
    10. Schalten Sie den Bohrer mit Drehung im Uhrzeigersinn und niedriger Drehzahl.
    11. Entfernen Sie das Gerät mit der Gewebe-Kern aus dem Euter.
    12. Wenden Sie starken Druck auf die Wunde mit einem sterilen Tuch für mindestens 20 Minuten sofort an.
      Hinweis: Haben Sie einen Assistenten führen Sie dies mit ihrer Faust um sicherzustellen, dass ausreichend Druck ausgeübt wird.
    13. Entfernen Sie das Gewebe aus Biopsie-Tool mit einer Pinzette.
    14. Halten Sie die Probe in 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und bewerten Sie die Menge des Gewebes zu.
    15. Nehmen Sie die Kuh Vitalfunktionen alle 10 min nach der Biopsie für mindestens 30 Minuten.
    16. Suchen Sie nach Blutungen nach 20 min Druck auf die Biopsie-Website. Wenn gibt es tropft Blut Druck für eine zusätzliche 5-10 min gelten weiterhin.
    17. Schließen Sie die Einschnitte mit Edelstahl-Klammern in 5 mm Abständen immerhin Blutung aufgehört hat. Zwischen 5 und 8 Klammern verwenden.
    18. Gelten Sie eine Aerosol-Bandage für die Biopsie-Bereich.
    19. Beobachten Sie das Tier für 50 min. nach dem Eingriff.
  2. Nadel-Biopsie-Instrument
    1. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für das Gerät.
    2. Entfernen Sie die Biopsie-Nadel aus dem Paket verwenden sterile Techniken.
    3. Entsorgen Sie die Nadel, wenn Schäden festgestellt wird.
    4. Befestigen Sie die Nadel am Gerät.
    5. Schließen Sie den Deckel und Hahn das Gerät.
    6. Sicherstellen Sie, dass die Kuh ausreichend sediert ist und die Biopsie Website ausreichend betäubt. Drücken Sie die Haut um keine Reaktion zu gewährleisten.
    7. Machen Sie einen 1 bis 2 cm vertikalen Schnitt durch die Haut und subkutanes Gewebe von proximal nach distal mit einem Skalpell Nummer 10.
      Bemerkung: Der Schnitt für die Biopsie-Nadel-Instrument kann kleiner (1-2 cm) als die für das Core-Biopsie-Instrument.
    8. Legen Sie die Biopsie-Nadel in der Schnitt-Website (etwa 10 bis 13 cm von der Haut).
    9. Aktivieren Sie das Biopsie-Nadel-Gerät um das Gewebe zu sammeln.
    10. Entfernen Sie die Nadel aus dem Euter.
    11. Sofortige, starken Druck auf die Wunde mit einem sterilen Tuch für mindestens 20 Minuten.
    12. Entfernen Sie das Gewebe aus der Biopsie-Nadel mit einer Pinzette.
    13. Halten Sie die Probe in 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und bewerten Sie die Menge des Gewebes zu.
    14. Dauern Sie Vitalfunktionen alle 10 min nach der Biopsie für mindestens 30 Minuten.
    15. Suchen Sie nach Blutungen nach 20 min Druck auf die Biopsie-Website.
    16. Schließen Sie die Einschnitte mit Edelstahl Klammern schließlich Blutung aufgehört hat.
    17. Gelten Sie eine Aerosol-Bandage für die Biopsie-Bereich.
    18. Beobachten Sie das Tier für 50 min. nach dem Eingriff.

7. nach Biopsie Tierbetreuung

  1. Dokumentieren Sie alle Medikamente, die an Tiere verabreicht.
    Hinweis: Milch wurde während eines Zeitraums von 36 h nach dem Eingriff verworfen; Fleisch-Rückzug war 4 d. Wartezeiten für Milch und Fleisch variieren je nach Land oder Gerichtsbarkeit und die eingesetzten Medikamente. Bitte überprüfen Sie lokale Regeln und Vorschriften.
  2. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Blut in die Milch für 7 bis 10 d nach der Biopsie.
  3. Streifen Blutgerinnsel aus biopsiert Quartier bei nachfolgenden Melkungen Hand und stellen Sie sicher, dass komplette Milch Entfernung auftritt.
    Hinweis: Vorhandensein von Blutgerinnseln aus biopsiert Quartier für 1-3 Melkungen nach dem Eingriff wird erwartet. Blut in der Milch kann für 1 bis 6 d nach der Biopsie beobachtet werden.
  4. Milch nachgeben zu beobachten, und wenn möglich, die individuelle tägliche Futteraufnahme bis chirurgische Heftklammern entfernt worden sind.
  5. Überwachen Sie das Tier zweimal täglich für die Körpertemperatur, Atmung und Herzfrequenz und Verhalten bis chirurgischen Klammern entfernt wurden.
  6. Überprüfen Sie die Biopsie Website zweimal täglich für Schwellungen, Zärtlichkeit und Anzeichen von Entwässerung, bis die chirurgischen Klammern entfernt wurden. Wenn diese eingehalten werden, konsultieren Sie einen Tierarzt.
    Hinweis: Die Biopsie Seiten sauber zu halten und erneut den Aerosol Verband alle ein bis drei Tage, je nach Bedarf.
  7. Entfernen Sie die Klammern aus Schnitt Seite 10 bis 14 d nach der Biopsie, abhängig von der Heilungsrate.
  8. Konsultieren Sie einen Tierarzt, wenn Anzeichen für lokale oder systemische Infektion beobachtet werden.

Representative Results

In diesem Protokoll produziert die Core Biopsie Technik Gewebeprobe von 200 bis 600 mg während die Nadelbiopsie Proben von 10 bis 30 mg pro Biopsie produziert. Die Tiere wurden zweimal täglich für 10 d nach dem Eingriff beobachtet. Keine Komplikationen aufgetreten, während des Verfahrens oder in der postoperativen Phase mit Vitalparameter der Kühe bleiben innerhalb der normalen Grenzen (durchschnittliche Atemfrequenz = 31,4 ± 7.04 (SD) Atemzüge pro Minute, durchschnittliche Herzfrequenz = 75,9 ± 8,9 Schlägen pro min, und Durchschnitt rektale Temperatur = 38,2 ± 0,68 ° C, Abbildung 3).

Nach manueller Druck auf den Bereich der Biopsie zur Blutstillung (ca. 25 min) zu erreichen zeigte die offene Wunde, minimale Blutungen (Abbildung 4). Die Kühe wurden die gleiche Diät ad libitum gefüttert, und die Tiere wurden in der gleichen Wohnanlage gehalten, während der postoperativen Phase. Die Tiere zeigte keine Anzeichen einer Infektion am Standort Biopsie; Es gab keine Schmerzen, Blutungen, Schwellungen, Entwässerung oder erhöhter Temperatur (Abbildung 5). Die Wunde verheilt innerhalb 8 bis 10 d der Biopsie (Abbildung 5).

Ein Tier entwickelt kleinere Hautirritationen durch Wunde reiben am 8. Tag nach dem Eingriff. Diese Kuh wurde von der Biopsie-Website mit Povidon-Jod-Lösung und 70 % Isopropylalkohol Reinigung behandelt. Die Edelstahl-Klammern wurden entfernt, um Entwässerung zu erlauben und Povidon-Jod-Salbe (1 %) wurde zweimal am Tag vor der Biopsie Ort für 2 bis 3 d angewendet. Die Hautreizung verschwand 2 d nach der Anwendung von Povidon-Jod-Salbe und die Wunde verheilt ohne weitere Komplikationen.

Blutgerinnseln wurden von Hand Abisolieren von Milch aus dem biopsiert Viertel vor Maschine Melken entfernt. Dieses Protokoll wurde das Vorhandensein von Blutgerinnseln in der Milch nach der Biopsie für bis zu drei Melkungen (ca. 36 h) beobachtet. Blut-Kontamination der Milch wurde für bis zu 48 h nach der Biopsie beobachtet. Es gab keine visuelle Unterschiede zwischen Kern und Nadel Biopsien bezogen auf die Menge an Blut in der Milch. Die Tiere zeigten eine signifikante Abnahme der Milchleistung nach dem Eingriff (Abbildung 6). Durchschnittliche Milch Zusammensetzung war 4,37 % Fett, 3,34 % Protein und 4,64 % Laktose. Die Anzahl der somatischen Zellen der durchschnittliche Milch (SCC) wurde weniger als 200.000 Zellen pro mL.

Das MG Gewebe erhalten kann für verschiedene Zwecke wie primären Zellkulturen (Abbildung 7) verwendet werden.

Figure 3
Abbildung 3 . Bewertung der Tiergesundheit Indikatoren nach der Biopsie bovine Brustdrüse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 4
Abbildung 4 . Biopsie Website aussehen nach . manuellen Druck auf die Blutstillung zu erreichen Biopsie angewendet wurde Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Biopsie-Grundstücksaufnahmen. (A) Biopsie Seite 3-d nach dem Eingriff. (B) Biopsie site 6D nach dem Eingriff. (C) Biopsie Website 10d nach der Prozedur veranschaulicht, dass die Wunde ausreichend geheilt war. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 . Tägliche Milchproduktion vor und nach der Biopsie bovine Brustdrüse (n = 3 Kühe). Ein lineares Modell schätzt, dass 10 Tage vor der Biopsie die Tiere 23,35 kg Milch pro Tag produziert. Die Milchleistung änderte sich nicht signifikant (P > 0.05) ab 10 Tagen vor bis 10 Tage nach der Biopsie, obwohl eine leichte Erhöhung der Milchleistung wurde beobachtet (Erhöhung des 0,0005 kg/d Milch für jeden Tag ab 10 Tage vor der Biopsie). Drei Tiere wurden in diesem Protokoll verwendet; ein Tier wurde zweimal biopsiert (Tier 1: core-Biopsie auf der linken Seite des Euters und Nadel-Biopsie auf der rechten Seite des Euters) und zwei Tiere waren einst biopsiert (Tier 2 und 3: nur auf der rechten Seite des Euters mit dem Kern oder Nadel-Verfahren). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 . Repräsentative Bilder der primären bovine Mamma Epithelzellen Kultur. Maßstabsleiste ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Kern und Nadel-Biopsie-Methoden wurden in diesem Protokoll9,16beschrieben. Eine detaillierte Auswertung der Tiergesundheit und Inzidenz von Mastitis14 vor der Biopsie ist für beide Verfahren erforderlich. Für Forschungszwecke werden Durchführung der Technik bei Tieren mit offensichtliche Anzeichen von Entzündungen oder Infektionskrankheiten vermieden. Dies reduziert das Risiko von Komplikationen während und nach einer Biopsie. Alle Biopsie Instrumente und Geräte sollten sauber, desinfiziert und sterilisiert zur Vermeidung von Kontaminationen des Standortes Biopsie sein. Vor dem Eingriff ist es notwendig Operationsstelle Infektionen (SSI) zu minimieren. Im Allgemeinen ist SSI mit tierischen Morbidität, verlorene Performance und höhere Produktionskosten bei Milchkühen. Studien berichtet bereits Methoden zur Verhinderung von SSI durch Biopsie einschließlich schneiden die Haare rund um die Schnitt-Website, die Biopsie Waschplatz entfernen Verunreinigungen9,14, und mit antiseptischen Mittel (70 % Alkohol, Jod chirurgische Schrubben Sie 2 % Chlorhexidin Acetat Lösung14,9, 10 % Povidon-Jod8) für die Vorbereitung der Haut. In einigen Studien wurde die Verabreichung von Antibiotika während7 oder unmittelbar nach der Biopsie9angenommen; jedoch antibiotische Prophylaxe war nicht in der vorliegenden Arbeit verwendet, und keine Infektionen des Standortes Biopsie wurden beobachtet. Um Kontamination der Wunde Biopsie zu verhindern, sollte die Rute gesichert werden, um Kontakt mit der Biopsie-Website zu verhindern, bis die Aerosol-Bandage angewendet wurde. In diesem Protokoll werden Klammern ca. 10 bis 14 d nach der Biopsie entfernt.

Vor einer Core-Biopsie ist es wichtig, richtig das Tool einrichten und verbinden es mit dem Bohrer; Wählen Sie eine langsame Rotationsgeschwindigkeit, wählen Sie die Vorwärtsdrehung, und verwenden Sie nicht den reverse-Modus des Bohrers. Während des Eingriffs ist es wichtig, digitaler Druck auf beiden Seiten des Schnittes zu verwenden, um die Haut Kanten auseinander zu halten und haben einen lange genug Schnitt um Tool-Eintrag zu ermöglichen, ohne Kontakt mit der Haut oder Bindegewebe. Wenn dieses Verfahren nicht getan ist, kann ein Bremsklotz für die Schnitt-Kanten beim Drehen des Core-Biopsie-Instrument auftreten und verursachen zusätzliche Haut Gewebetrauma, erhöht sich das Risiko einer Infektion und kann die Wundheilung verzögern. Die derzeitigen Biopsie-Verfahren beschrieben, die in diesem Protokoll wurden von einem Facharzt für große Tiere Chirurgen durchgeführt. Die Verfahren wurden erfolgreich durchgeführt (Abbildung 5). Beide Techniken sind relativ einfach und schnell im Vergleich zu der chirurgische Exzision Verfahren durchführen.

Blutungen aus der Biopsie-Website sind häufig nach MG Biopsie Milchkühe8,9,10,14. In diesem Protokoll Blutungen beobachtet wurde minimal (Abbildung 4), die möglicherweise durch Anwendung des entsprechenden (stark) Druck auf die Wunde sofort nach dem Eingriff. Starker Druck mindestens 20 min lang ist erforderlich, und es kann für mehr als 30 Minuten in einigen Fällen erforderlich sein. Wenn nach Anwendung von Druck auf die Biopsie Website mäßige bis schwere Blutungen beobachtet wird, empfiehlt es sich, weiter Druck, und kontaktieren sofort einen Tierarzt.

Blutstillung ist ein wichtiger Faktor zur Verringerung der Morbidität der Kuh, verpackt eine Studie blutstillende Pads in der Biopsie-Website zu kontrollieren, die Blutungen9. Einsatz von hämostatischen Pads in einer solchen Weise hat jedoch eine hohe potenzielle Gefahr für mikrobiologische Kontamination in der Molkerei-Umgebung. Eine andere Studie14 manuellen Druck auf die Biopsie Standort zwischen wiederholte Biopsien und nach der Biopsie und Haut Stilllegung angewendet und Eis auf den Standort für mindestens 2 h nach der Biopsie angewendet. In diesem Protokoll war starker Druck auf die Biopsie-Website für 20 bis 25 min ausreichend, um Blutungen zu kontrollieren.

Eine erfolgreiche Biopsie Technik sollte im minimum Blut in die Milch führen, die für einen kurzen Zeitraum nach der Operation anhält. Um eine Unterbrechung der Milch-Sekretion bei Milch Enttäuschung und Mastitis Infektionen zu vermeiden, sollte mit der Hand Abstreifen von biopsiert Quartal10,14durch Blutgerinnsel entfernt werden. Dieses Protokoll wurde Blut in die Milch bis zu 48 Stunden nach der Biopsie beobachtet. Allerdings wurde in einer Studie, die eine größere Anzahl von Tieren verwendet, Blut in der Milch in der Mehrzahl der Kühe für weniger als 6 Tagen beobachtet. Einige Tiere zeigten Blut in die Milch nach 6 Tagen8. Aus diesem Grund ist tägliche Beobachtung der Milch Erscheinung nach dem Eingriff notwendig für 6D. Tiere keine Anzeichen von Mastitis-Infektion aufweisen, wenn eine große Gewebeprobe14gewonnen wurde. Frühere Untersuchungen, die auf dem gleichen Tier mit Hilfe einer Nadel wiederholte Biopsien durchgeführt fand jedoch dass Mastitis Infektion das Auftreten ca. 12 % nach der Prozedur8war. In diesem Protokoll musste weder Tier Sichtzeichen klinischer Mastitis Infektion nach dem Eingriff. Es gibt auch eine leichte chance, dass die Schnitt-Website nach der Biopsie infiziert werden kann.

Tolazoline Hydrochlorid, ein Medikament, das die Auswirkungen der Sedierung, kehrt sollten im Falle einer Überdosierung von Xylazin vorliegen. Eine übermäßige Dosis von Xylazin kann Lungenödem führen. Klinische Anzeichen von Lungenödem sind Atemnot, schwere Atemnot, Schwierigkeiten beim Atmen, Husten und schaumig Sputum. Wenn Anzeichen von Lungenödem beobachtet werden, empfiehlt es sich, Tolazine (2 bis 4 mg/kg Körpergewicht) verwenden, um den Xylazin Folgen entgegenzuwirken.

Dieses Protokoll beschreibt die Technik um eine Nadelbiopsie und Core-Biopsie durchführen. Im Allgemeinen ist der Vorteil einer Core-Biopsie im Vergleich zu Nadelbiopsie der größeren Gewebe Probe (0,75 bis 1 g)9 mit minimalen negativ auf die Eutergesundheit. Die Nadelbiopsie ist eine weniger invasive Methode als die Core-Biopsie-Instrument. Allerdings versucht mehrere Biopsie, erhalten eine größere Menge an Gewebe mit einer Nadel-Biopsie-Verfahren das Risiko von größeren Blutungen nach der Prozedur sowie Blutgerinnsel in der Milch erhöhen kann. Beide Techniken verursacht minimale Kuh Morbidität und waren leicht zu erreichen mit minimalem Schulungsaufwand für OP-Personal. Eine kurzfristige Änderung im täglichen Milchleistung (Rückgang um 8 bis 10 %) und seine Zusammensetzung9 und Futteraufnahme Reduktion14 dürfte nach den Kern und Nadel Biopsien. Einschränkungen von der Nadel-Biopsie-Verfahren sind das geringe Volumen des Gewebes mit der Nadel entfernt. Das Instrument muss aktiviert werden, nur, wenn die Nadel in das Gewebe biopsiert werden und mehrere Versuche oft erforderlich sind, ausreichende Mengen des Gewebes, das Risiko von Blut in die Milch und Mastitis nach dem Eingriff erhöht zu erwirken. Einschränkungen der Kern Biopsie beinhalten ein erhöhtes Risiko für Blutungen nach dem Eingriff, wenn eine große Menge an Gewebe (> 200 mg) ergibt. Darüber hinaus ist das Biopsie-Tool mehr schwer zu montieren, erfordert angemessene Ausbildung vor Gebrauch.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von der National Animal Nutrition Program und Virginia Tech unterstützt. Die technische Unterstützung von Frau Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage und Dr. Izabelle Teixeira werden dankbar anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Isopropyl alcohol  Walmart  565106257 1 L
Aerosol spray to kill and repel flies MWI 14339 1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm C. R. Bard MN1216 2
Butterfly infusion set (18 G needle) Fisher 22-258087 1
Cell culture dishes Fisher 08-772E 4
Cordless drill (low speed) Hitachi   DS10DFL  1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows cattle healthy
Flunixin meglumine MWI/VetOne 501018 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table   Amazon 1
Forceps Fisher 09-753-50 1
Gloves non-sterile  Fisher 17-200-845 9, size dependent
Hard brush  Sullivan Supply 18270 1, to wash the cows
Head gate  1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable  MWI/VetOne 510212 6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash eZall Technologies 39384 1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“) Fisher 14-821-15A 6
Needle 20 G (1 to 1/5“) Fisher 14-815-526 6
Phosphate buffered saline (0.9%) Fisher 20-012-043 1 L
Povidone Iodine ointment Jeffers #VED1A 500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) MWI/VetOne 510094 1 L
Reusable biopsy instrument  C. R. Bard MG1522 1
Rope halter Nasco farm and ranch C10852 2, cow size
Scalpel blades (#10) MWI 033870 2
Scalpel holders (#3) MWI 602008 1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. Fisher 19-130-0038 1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges Fisher 22-037-986 4
Sterile gauze pads Fisher 19-090-735 4
Sterile surgical gloves  Surgical gloves 19-166-679 3,  size dependent
Sterile surgical towels Fisher 50-118-0339 6
Stethoscope Littmann Master Classic II 1392 1
Surgical clipper Oster A5 078005-010-003 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 ) Oster  78919-016 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover MWI 541 1
Surgical stapler pre-loaded MWI 17713 5
Syringes of 10 mL Fisher 14-823-224 3
Syringes of 2 mL Fisher 22-028854 3
Syringes of 20 mL Fisher 22-034507 3
Syringes of 5 mL Fisher 22-028855 3
Thermometer Agri-Pro Enterprises Inc 72000 1
Tolazine hydrochloride Akorn Animal Health 61311-486-10 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer  Fisher 14-955-025 1, for handle the tissue sample
Water hose Miracle-Gro, Walmart 554990501 1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) MWI 010728 1 bottle 
Xylazine hydrochloride MWI/VetOne 510650 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight

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References

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Biologie Ausgabe 142 Rinder Laktation bovine Brustdrüse Core-Biopsie Nadelbiopsie Gewebe-Sammlung Euter
Bovine Brustdrüse Biopsie-Techniken
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Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).

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