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Biology

소 유선 생 검 기술

doi: 10.3791/58602 Published: December 23, 2018

Summary

이 문서는 코어 및 바늘 생 검 도구를 사용 하 여 소 유선 생을 선물 한다. 수확된 조직 세포 배양 또는 유 방 생리학과 신진 대사 유전자 발현, 단백질 표정, 단백질 수정, immunohistochemistry, 대사 산물의 농도 등을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Abstract

소 유선 biopsies 유전자 발현, 신호 경로, 및 단백질 번역 조직학 분석을 포함 한 세포 생물학 연구 조직 샘플을 수집을 연구원 허용. 이 문서에서는 생 검 소 유선 (MG)의 두 가지 방법을 설명합니다. 3 건강 한 홀스타인 젖소는 과목 했다. 생 검, 전에 소 젖이 되었고 이후 가축 낙하산에서 제 지. 진통제 (flunixin meglumine, 몸 무게의 1.1 2.2 mg/kg) 생 검 jugular 정 맥 [4] 주입 15-20 분 전에 통해 관리 되었다. 서 진정, xylazine 염 산 염에 대 한 (0.01-0.05 mg/kg의 몸 무게) と 혈관을 통해 주입은 수술 전에 5-10 분. 일단 적절 하 게 진정 생 사이트 aseptically 준비 하 고 로컬 anaesthetized 피하 주사를 통해 2 %lidocaine 염 산 염의 6 mL와 함께 했다. 무 균 기술을 사용 하 여, 2 ~ 3 cm 수직 절 개를 되었다 번호 10 메스를 사용 하 여. 코어 및 바늘 생 검 도구 사용 되었다. 코어 생 검 도구 무선 드릴에 부착 되었고 바로 드릴 작업 사용 하 여 절 개를 통해 MG 조직에 삽입. 바늘 생 검 도구 절 개 사이트에 수동으로 삽입 되었다. 절차 후 즉시 보조 hemostasis 달성 하기 메 마른 수건을 사용 하 여 20 ~ 25 분에 대 한 절 개 사이트에 압력을 적용. 스테인리스 수술 스테이플 피부 절 개를 사용 했다. 스테이플 제거 10 일 수술 후 했다입니다. 코어 및 바늘 biopsies의 주요 장점은 두 가지 방법을 건강 한 소에 안전 하 게 수행 될 수 있는 최소한 침략 적 절차입니다. 우유 수확량 생 검 다음 영향을 받는 했다. 이 절차는 짧은 회복 시간을 요구 하며 합병증의 더 적은 위험. 특정 제한 생 검 후 생 검 사이트에 감염 출혈 등이 있습니다. 이러한 기술의 응용 프로그램 임상 진단 및 기본 세포 배양 등 연구 목적에 대 한 조직 컬렉션을 포함합니다.

Introduction

생 검 의료에 대 한 과목 또는 연구 목적에서 조직의 핵심 섹션을 수확 하는 절차 이다. 치료에 조직 응답의 분석 또는 관심의 다른 요소를 수 있도록 안락사1 대신 조직을 수집 하는 최소 침 습 및 널리 사용 되 기술입니다. (MG) 소 유선 조직 샘플 낙농 연구 유전자와 단백질 표정, 조직학, 세포 세포, 신호 경로 변화 관리에 대 한 응답에서 신진 대사 과정의 조직 연구에 대 한 필수적입니다 또는 환경입니다. 또한, MG 조직 진단 하 고 소 염 세균 감염2기인 같은 특정 전염병 연구 필요 합니다.

소의 젖 통 4 개의 별도 땀 샘을 포함 하 고 각 선 포함 총칭 실질 라는 독립적인 우유 분 비 시스템. 포, 덕트, 및 결합 조직 유 방 실질에 있습니다. 폐 포 (luminal) 내부 표면에 있는 상피 세포의 구성 된 미세한 구형 빈 구조 이며 전문된 myoepithelial (기저) 외부 표면에 세포. 포 합성 및 우유의 분 비에 대 한 책임이 있습니다. 실질에 섬유 결합 조직, 폐 포의 다른 그룹에서 폐 포의 그룹을 분리할 수 있으며 각 그룹 lobule3를 호출 됩니다. 여러 가지 요인이 개발 및 동물 생리학, 영양, 관리, 유전학, 및 환경4를 포함 하 여 MG의 기능 발생할 수 있습니다. 유선 염에는 또한 부정적인 MG 기능과 우유 품질5에 영향을 미치는 중요 한 요소 이다. Mastitic 병원 체에 의해 풀어 놓인 독 소는 폐 포에 손상을 하 고 MG 조직6생화학, 조직학 변화에서 발생 하는 괴 사를 일으킬 수 있습니다. 따라서, 조직학 및 각 폐 포 또는 lobule MG에서의 대사 과정은 다른 사람들 로부터 크게 달라질 수 있습니다. 따라서, 전체 유선의 대표 샘플은 biopsies 바람직한 있습니다. 단일 lobule 또는 결과 과학적 또는 진단 정보를 제한 하는 개별 치조에만 작은 biopsies 캡처할 수 있습니다. 연구 목적을 위해 유 방 생 검 조직 특성의 '스냅숏'을 제공 하지만 생 검 총 유선의 견적의 부재에 전체 유 방 기능 특성을 적절 하 게 수 없습니다 유의 해야 하는 대량.

여러 생 검 도구 인간의 사용을 위한 지난 30 년 동안 개발 되었습니다. 현재, 그 악기의 각 색 한 동물 들과 함께 사용 하기 위해 사용할 수 있습니다. 젖소에 대 한 MG 조직의 샘플을 되었습니다 가져올 외과 절단 (무딘 해 부)7, 코어 생 검 계기9,10, 생 검 바늘1,8, 등 다양 한 기법을 사용 하 여. 따라서, 젖이 젖소에 MG 생 검 기술을 휴식 진정 electrocautery hemostasis 19927 서 진정9, 아래 핵심 biopsies의 컬렉션을 사용 하 여 외과 절 개를 사용 하 여 프로시저에서 전환 해야 10,,1112. 수술 생 검 침략 메서드를 될 수 있는 비싼 혈 종 등의 합병증의 높은 발병 률을가지고, 문제, 상처 및 종양 확산13이다. 현재, 코어 생 검 그리고 바늘 생 검 (트루 컷 생)가 널리 채택 되었습니다 대안 수술 생 검으로. 코어 및 바늘 생 검 수술 생 검에 비해 장점: 절차는 최소 침 습; 주요 합병증은 희소 하다; 전신 마 취가 필요; 절차는 relativley 빠른; 복구 시간이 짧습니다. 젖 통 건강에 부정적인 영향을 최소화 하 고 우유 생산량 및 구성8,,910;에 단기 효과가 있다 그리고 비용 보다 수술 생 검13.

한 코어 생 검 절차 1996 년에 사용한 살 균, 스테인리스 정 이동식 개폐식 블레이드 전신9,10,11 없이 소 MG에서 대표적인 양의 조직 제거 하 ,12. 절차 동안, 악기는 낮은 속도, 깔끔하게 잘라 조직 핵심 도구는 조직에 고급 회전 모션을 만드는 무선 드릴에 붙어 있었다. 혜택은 더 큰 조직 샘플 (70 x 4 mm 직경, 약 0.75 ~ 1 g) 9. 10 최근 연구 보여준 V. C. 파 에 의해 설명 하는 생 검 절차 9 젖이 젖소의 성능 및 젖 통 건강에 부정적인 영향 없이 반복된 MG 조직 컬렉션을 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 가장 최근에, 연구14 젖소 생 검을 수집 하는 내부 스테인리스 정에 적용 하는 진공 큰 trocar (9.5 m m의 31 cm 긴, 외경, 내경 8 m m)를 사용 하는 MG의 반복된 biopsies을 평가 하기 위해 실시 되었다 . 이 메서드는 진정 (xylazine)와 취 (2 %lidocaine 염 산 염)를 사용합니다.

바늘 생 검은 유 방 조직 수집을 다른 기술입니다. 여러 연구 결과이 기술을 채택 했다. 한 연구1 진정 (detomidine)와 지역 마 취 제 (1 %lidocaine) 절차에 사용. 생 검, 후 소는 예방 항생제 치료를 받았다. 유 방 동맥 우유는 전후 마사지 수동으로 했다. 우유에 피는 생 검 후 최대 84 h에 대 한 관찰 되었다. 양과 우유의 구성 시간의 짧은 기간에 대 한 영향을 받았다. 최근, 연구 사용 생 검 바늘 반복된 MG biopsies 젖소8. 진정 (1 %acepromazine, 근육)과 취 (2 %lidocaine 염 산 염, 피하) 동물에 관리 되었다. 동물 또는 받지 못했습니다 intramammary 약물 이나 항생제 전에 절차 후 그리고 수술 후 기간 동안 생 사이트에서 감염의 흔적 했다. 이 연구에는 바늘을 사용 하 여 반복된 소 MG biopsies 젖소의 우유 생산 및 젖 통 건강에 사소한 부정적인 영향을 미쳤다. 일반적으로, 바늘 생 검 코어 생 검 계기 보다는 보다 적게 침략 적 방법 것으로 보인다. 그러나, 앞에서 설명 했 듯이, MG 조직의 대표적인 샘플을 수확 생 검 기술에 대 한 필수적입니다. 바늘 생 검의 한계는 적은 양의 소 MG 조직 (약 20 ~ 25 밀리 그램)를 얻은8,15.

거의 모든 연구의 사용 α-2 주 작동 근 진정와 로컬 마 취8,,910, 생 검 바늘 또는 더 큰 코어를 통해 이었다. 소 MG에서 대부분 신경 엔딩 피부와 연결 됩니다. Innervation parenchymal 조직에 스파스 유형과 뻗 기 수용 체를 통해 크게 날카로운 수술 통증을 감지 하는 신경 섬유 이다. 결과적으로, MG의 수술 조작으로 인해 통증의 생리 적 메커니즘 피부와 피하 조직3 parenchymal 조직 같은 깊은 곳에서 조직을 통해 이다. 따라서, 생 검 절차, 이건만 로컬로 피부와 피하 조직, anesthetize 하는 데 필요한로 깊은 조직으로 로컬 마 취의 침투 수술 통증을 크게 감소 하지 않습니다. 후 생 검 영역의 적절 한 준비, 동물 불편은, 주로, 억제와 관련 된.

더 큰 코어 샘플의 컬렉션 혈 종 형성을 증가 하 고 MG 실질 내 감염의 위험을 증가 시킬 수 있습니다. 따라서, 요정 요원 프로토콜은 종종 비록 그 보편성8비 경구 항생제7의 관리를 포함 됩니다. 달성 hemostasis 암소 사망률을 줄이기 위한 중요 한 요소 이기도 합니다. 상기 연구에서 생 검 사이트에 적용 된 큰 코어 생 검 계기14, 수동 압력을 사용 하 여 하 고 암소 브래지어 절차에 따라 적어도 2 h 상처에 얼음을 적용 하는 데 사용 되었다. 많은 양의 수확 하는 조직에도 불구 하 고 사료 섭취 량과 우유 수확량에만 약간의 감소는 관찰 되었다, 그리고 절차는 암소 건강에 부정적인 영향 없이 매 3 주를 반복 했다.

연구원은 젖소에서 MG 생 검을 수행 결과 생의 진단 또는 분석 품질, 기술, 그리고 암소 사망률의 용이성을 고려해 야 합니다. 정확 하 고 사전 계획 된 외과 기술은 이러한 목표를 달성 하는 것이 필수적입니다. 날짜 하려면, MG 생 연구 생 검 기술 자체를 설명 하는 반대로 생 검 결과 설명에 초점을 맞춘 고 젖이 젖소에 대 한 설명을 부족 복제를 허용 하도록 충분 한 세부 사항. 따라서,이 작품의 목표는 바늘 생 검 및 소의 생 검 밀리 그램의 안전 하 고 인간적 인 복제를 허용 하도록 충분 한 세부 사항에 더 큰 코어 생 검 기술을 설명 했다.

Protocol

설명 하는 모든 메서드는 버지니아 기술 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었다.

1입니다. 인사

  1. 수술 및 암소 처리 경험을 가진 두 개 이상 조 수 있다.
  2. 기차 모든 보조 세 번 이상, 가능 하면 절차를 수행 하기 전에 시체 물자를 사용 하 여 라이브 동물에이 프로토콜을 연관.
    참고: 훈련 된 강사에 의해 실시 해야 이전 훈련 하 고 기술을 수행.
  3. 약국에 대 한 큰 동물성 수 의사에 손에 있고 이벤트에 응급 치료 절차 동안 필요 하 게 됩니다. 이 절차 중 발생할 수 있는 긴급 포함 하지만 제한 되지 않는다: 출혈, α-2 주 작동 근 과다 복용 및 폐 부 증, 역류 및 식품 소재, 통증, 그리고 더 진정 필요로 하는 환자 저항의 열망.

2. 외과 기구, 공급 및 시설 준비

  1. 재고와 구입 모든 장비 및 소모품 ( 재료의 표참조).
  2. 깨끗 하 고 압력솥 수술 커튼, 생 검 계기, 메스 홀더, 외과 수건 및 집게.
  3. 제대로 크기의 쥐 어 짜기 자동 활송 장치 그리고 암소를 억제 헤드 게이트 있다.
  4. 짜기 자동 활송 장치 근처 테이블 작업 공간을 설정 합니다.
  5. 작업 영역 깨끗 하 고 암소를 통해 트래픽을 제한 확인 하십시오.
  6. 장비 및 쉬운 접근을 위한 작업 공간에서 공급을 구성 합니다.
  7. 작업 공간 안에 적절 한 조명이 있다.

3입니다. 동물의 준비

  1. 하루 예정된 생 검 전에 세척 하 고 동물, 특히 비료와 더러워진된 소재 제거를 젖 통을 문질러.
  2. 안전 하 고 자비 롭 감 금 소의 절차를 따릅니다.
  3. 생 검에 앞서 고 다시 생 검 시, 건강, 건강 상태 및 동물의 동작을 평가 합니다.
    주: 최소 시험 포함 한다 온도, 맥 박, 호흡 속도 뿐만 아니라 피부염에 대 한 시험 제안 된 외과 사이트 또는 세균성 감염의 다른 영역. 각 분기에서 우유 샘플을 수집 하 고 유선 염에 대 한 확인.
  4. 건강 한 소만을 사용 합니다.
  5. 완전히 우유 암소입니다.
  6. 짜기 낙하산 우유 분 비에 존재 최소화 하기 위해 우유의 2 시간 이내에 동물을 이동 합니다.
  7. 머리 게이트 동물을 제 지.

4. 진통 및 진정 작용

  1. 뒤로 방지 및 앞으로 움직임 암소의 머리에 밧줄 고삐를 놓습니다.
  2. 1 개의 측에 동물의 머리를 당겨 하 고 빠른 릴리스 매듭을 사용 하 여 장소에 머리를 쥐 어 짜기 낙하산에 밧줄을 묶어.
  3. 70% 이소프로필 알콜 면봉으로 주입의 영역을 청소 하 고 생 검 15-20 분 이전에 경 정 맥을 통해 정 맥 flunixin meglumine (몸 무게의 1.1 2.2 mg/kg)를 관리.
    참고: 일부 프로토콜에 비 스테로이드 성 항 염증 약물 관리 되는 생 검 후 경우 항 염증 성 약물 연구 결과 영향을 미치지 것입니다.
    1. 경 정 맥을 찾습니다.
    2. Jugular groove의 기지에서 압력의 신청에 의하여 경 정 맥을 올립니다.
    3. 주사기에 없는 거품 인지 확인 하려면 선택 합니다.
    4. 제기 경 정 맥에 바늘을 삽입 하 고 두 번 주사기로 0.5 mL의 혈액을 그리는 내용으로 혼합. 피는 주사기에 표시, 바늘을 재배치 합니다. 정 맥에 바늘 이면 내용을 주입.
    5. 부드럽게 바늘을 제거 합니다.
    6. 부드러운 압력으로 거 즈 출혈을 방지 하기 위해 사출 사이트에 적용 됩니다.
  4. Xylazine 염 정 맥 관리 (체중의 0.01 0.05 mg/kg) と 선박에 진정의 설립을 위한 충분 한 시간을 생 검 전에 약 5-10 분.
    주의: 폐부종의 흔적에 대 한 동물을 확인 합니다. 폐 부 증의 임상 증상에는 호흡 곤란, 심한 호흡 곤란, 호흡 곤란, 기침, 거품가 래, 그리고 푸른 혀 포함 됩니다. 폐 부 증의 징후를 관찰 하는 경우 tolazine (몸 무게의 2 ~ 4 mg/kg)를 사용 하 여 xylazine 효과 반전 하는 것이 좋습니다.
    1. 꼬리를 70% 이소프로필 알콜 면봉으로 주입의 영역을 청소.
    2. 주사기에 없는 거품 인지 확인 하려면 선택 합니다.
    3. 꼬리 선박에 바늘을 삽입 하 고 주사기로 혈액의 0.2 mL를 그릴 바늘은 그릇에 수 있도록 내용을 혼합. 선박에서 바늘 이면 주사 주사기 내용.
    4. 부드럽게 바늘을 제거 합니다.
    5. 부드러운 압력으로 거 즈 사출 사이트에 적용 됩니다.

5입니다. 생 검 사이트의 준비

  1. 절차에 대 한 꼬리를 묶어 조수가 있다.
  2. (일반적으로 위 지역에 결합 조직 컬렉션을 최소화 하 고 선 구 덩이, 그림 1에 침투를 피하기 위해), 젖 통에 생 검 사이트를 선택 하 고 선택한 생 사이트에서 더러워진된 소재 또는 배설물을 제거.

Figure 1
그림 1 . 소 젖 통 생 사이트 설명의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

  1. 관찰 하 고 생 검 동안 이러한 혈관을 피하기 위해 어떤 큰 피하 혈관을 식별 하기 위해 특별 한 주의 함께 피부를 만져.
  2. 생 검 사이트 주변 15 cm x 15 cm에서에서 머리 클립.
  3. Povidone-요오드 (0.75% 사용 가능한 요오드) 또는 액체 gluconate 스크럽 생 면을 준비 합니다. 대체 70% 이소프로필 알코올 세 번 이상 모든 가시와 보이지 않는 파편을 제거 하. 무 균 스크럽 솔루션 및 내부-아웃 방식을 사용 하 여 원형 모션에서 이소프로필 알콜 적용 합니다. 살 균 세탁 솔루션은 적어도 5 분 동안 피부 접촉 유지할 것을 인식 하시길 바랍니다.
  4. 선 블록을 만들려고 절 개 사이트에서 2 %lidocaine 염 산 염의 6 mL을 피하 입금 18 G 바늘 세트 나비 주입을 사용 합니다. 깊은 조직에 침투 하지 않습니다.
    참고: lidocaine의 복용량은 3과 8 mL 사이 변화 한다.
  5. 지역 마 취 제 3 ~ 5 분 스크럽 솔루션 및 절 개 전에 알코올의 또 다른 반복 수행에 대 한 확산을 허용 합니다. 기다리는 동안, 생 검 계기를 준비 합니다.

6. 생 검 절차

  1. 생 검 도구를 처리할 때와 절 개에 대 한 무 균 기술을 사용 합니다.
  2. 모든 보이는 오염 제거 살 균 외과 장갑 적용 하 손을 씻으십시오.
  3. 사용 순서에에서 메 마른 지역에서 수술 도구를 정렬 합니다. 번호 10 메스, 멸 균 거 즈, 조립된 생 악기, 그리고 hemostasis의 메 마른 수건 있다.
    주: 코어 생 검을 수행 하기 위해 프로시저 1 또는 바늘 생 검을 수행 하는 프로시저 2 따릅니다.

Figure 2
그림 2 . 어셈블리 및 V. C. 파, 그 외 여러분에 의해 설명 된 코어 생 검 도구 설정의 도식 표현 9 눈금 막대는 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 코어 생 검 계기 (Farr 외.9)
    1. 멸 균 글러브 (그림 2)를 사용 하 여 코어 생 검 악기를 조립 한다.
      1. 무 균 드 레이프 (그림 2A)에 7 살 균 조각을 놓으십시오.
      2. 조각 2 (그림 2B )에 도킹 시스템에 블레이드 (1 조각)를 삽입 합니다.
        주의: 블레이드 라인에 직접 손가락을 배치 하지 마십시오.
      3. 도킹 스테이션 정렬 됩니다 있도록 조각 2 (그림 2C) 위에 조각 3을 삽입 합니다.
        참고: 작품 4 (그림 2D)의 내부 벽에 도킹 시스템을 관찰 합니다.
      4. 블레이드 (1 조각)의 최종 가장자리 조각 4 (그림 2D)의 도킹 시스템에 참여 합니다.
      5. 조각 4 눈에 띄게 하 고 조각 4 조각 3 (그림 2E) 옆 인지 합니다.
      6. 조각 5 장치 (블레이드 + 조각 2)에서 (그림 2F)를 삽입 합니다.
      7. 도킹 스테이션 정렬 (그림 2G).
      8. 조각 6 조각 2의 상단에 삽입 (칼 날의 반대편) (그림 2 H)
      9. 도킹 스테이션 정렬 (그림 2 H).
      10. 도킹 스테이션 (그림 2I)로 잠금 나사 (7 조각)를 삽입 합니다.
      11. 조각 3 (블랙) 잠금 나사 커버를 앞으로 밀어.
        주의: 블레이드 출구에 손가락을 배치 하지 마십시오.
      12. 조각 4를 전진 하는 도구를 활성화 하 고 외부 도구 블레이드를 관찰.
      13. (사용 가능) 도구에 블레이드를 철회를 다시 조각 4를 당겨.
        참고: 블레이드는 도구는 biopsied 되도록 조직 안에 원하는 거리를 침투 하는 경우에 활성화 되어야 한다.
    2. 암소는 충분히 진정 생 사이트 충분히 anesthetized 확인 합니다. 반응이 되도록 피부를 대 타.
    3. 피부와 피하 조직에서 인접 번호 10 메스를 사용 하 여 원심을 통해 2 ~ 3 cm 세로 절 개를 확인 합니다.
    4. 무 균 기술을 사용 하 여 무선 드릴을 생 검 계기를 연결 합니다.
    5. 생 검 도구에 대 한 드릴 놓고 도구는 드릴에 단단히 연결 되어 있으면 확인 합니다.
    6. 개인 모든 절차 동안 꼬리를 상승 함으로써 적절 한 구속을 확인 합니다.
    7. 시계 방향 회전 및 낮은 속도 사용 하 여 드릴을 켭니다.
      참고: 드릴 살 균, 그리고 연산자 남아 있지 않는다 메 마른 때 드릴을 사용 하 여.
    8. 드릴은 회전 하는 동안 전체 생 도구 (약 7.5 cm) 절 개를 통해 젖 통에 사전.
    9. 드릴 끄고 수동으로 4 조각의 도구를 확장 합니다.
    10. 시계 방향 회전 및 낮은 속도 사용 하 여 드릴을 켭니다.
    11. 젖 통에서 조직 핵심을 포함 하는 악기를 제거 합니다.
    12. 적어도 20 분 동안 메 마른 수건을 사용 하 여 상처에 강한 압력을 즉시 적용 됩니다.
      참고: 적절 한 압력을 적용 그들의 주먹을 사용 하 여이 수행 비서가 있다.
    13. 조직 생 검 도구 핀셋을 사용 하 여 제거 합니다.
    14. 1 x 인산 염 버퍼에 식 염 수 샘플을 유지 하 고 조직의 양을 평가.
    15. 적어도 30 분에 대 한 생 검 후 암소의 생체 신호 마다 10 분 가져가 라.
    16. 생 검 사이트에 압력의 20 분 후에 출혈에 대 한 확인 합니다. 혈액의 drips 있다면 추가 5-10 분에 대 한 압력을 계속.
    17. 중지는 결국 출혈 5 m m 간격 스테인리스 스테이플을 사용 하 여 절 개를 닫습니다. 5와 8 스테이플 사이 사용 합니다.
    18. 생 지역에는 어로 졸 붕대를 적용 합니다.
    19. 수술 후 50 분에 대 한 동물을 관찰 합니다.
  2. 바늘 생 검 계기
    1. 장치에 대 한 제조업체의 지침을 따릅니다.
    2. 무 균 기술을 사용 하 여 패키지에서 생 검 바늘을 제거 합니다.
    3. 손상이 관찰 되는 경우 바늘을 삭제 합니다.
    4. 장치에 바늘을 연결 합니다.
    5. 덮개를 닫고 장치를 거 시기.
    6. 암소는 충분히 진정 생 사이트 충분히 anesthetized 확인 합니다. 반응이 되도록 피부를 대 타.
    7. 피부와 피하 조직에서 인접 번호 10 메스를 사용 하 여 원심을 통해 1 ~ 2 cm 세로 절 개를 확인 합니다.
      참고: 절 개 생 검 바늘 악기에 대 한 코어 생 검 악기 보다 더 작은 (1-2 cm)를 하실 수 있습니다.
    8. 절 개 사이트 (피부에서 약 10 ~ 13 cm)로 생 검 바늘을 삽입 합니다.
    9. 수집 조직 생 검 바늘 장치를 활성화 합니다.
    10. 젖 통에서 바늘을 제거 합니다.
    11. 적어도 20 분 동안 메 마른 수건을 사용 하 여 상처에 즉시, 강한 압력을 적용.
    12. 핀셋을 사용 하 여 생 검 바늘에서 조직을 제거 합니다.
    13. 1 x 인산 염 버퍼에 식 염 수 샘플을 유지 하 고 조직의 양을 평가.
    14. 적어도 30 분에 대 한 생 검 후 생체 신호 마다 10 분 가져가 라.
    15. 생 검 사이트에 압력의 20 분 후에 출혈에 대 한 확인 합니다.
    16. 스테인레스 스틸 스테이플 중지 되었습니다 결국 출혈을 사용 하 여 절 개를 닫습니다.
    17. 생 지역에는 어로 졸 붕대를 적용 합니다.
    18. 수술 후 50 분에 대 한 동물을 관찰 합니다.

7. 사후 생 동물 보호

  1. 동물을 관리 하는 모든 약물을 문서화 합니다.
    참고: 우유; 절차 후 36 h의 기간 동안 삭제 되었다 고기 철수가 했다 4 디 철수 기간 우유와 고기에 대 한 국가 또는 관할권 및 사용 약물에 따라 다를 수 있습니다. 로컬 규칙 및 규정을 확인 하시기 바랍니다.
  2. 우유는 생 후 7 ~ 10 d에서 혈액의 존재를 확인 합니다.
  3. 후속 milkings biopsied 분기에서 스트립 혈전을 수교 하 고 그 완벽 한 우유를 확인 제거 발생 합니다.
    참고: 1-3 milkings 절차에 대 한 biopsied 분기에서 혈전의 존재는 예상 된다. 우유에 혈액은 생 후 1 ~ 6 d에 대 한 관찰 될 수 있습니다.
  4. 우유를 항복, 관찰 하 고 만약에 가능 하다 면, 개별 매일 먹이 섭취 외과 스테이플 제거 되었습니다 때까지.
  5. 외과 물림 쇠 제거 되었습니다 때까지 하루에 두 번 체온, 호흡 및 심장 속도, 그리고 태도 대 한 동물을 모니터링 합니다.
  6. 외과 물림 쇠 제거 되었습니다 때까지 붓기, 유연함, 대 한 매일 두 번 생 사이트 및 배수의 어떤 표시 든 지를 확인 합니다. 이러한 관찰은 수 의사를 참조 하십시오.
    참고: 생 검 사이트를 청결 한 유지 하 고 필요에 따라에 어로 졸 붕대에 다시 1 ~ 3 일 마다를 적용.
  7. 치유 속도 따라 생 후 10 ~ 14 d 절 개 사이트에서 스테이플을 제거 합니다.
  8. 로컬 또는 전신 감염의 어떤 표시 든 지 관찰 하는 경우는 수 의사를 참조 하십시오.

Representative Results

현재 프로토콜 바늘 생 검 생 당 10 ~ 30 mg의 샘플을 제작 하는 동안 코어 생 검 기술 200 ~ 600 mg의 조직 샘플을 생산. 동물 수술 후 10 일을 위해 하루에 두 번 관찰 되었다. 아니 합병증 발생 절차 동안 또는 수술 기간, 정상적인 한계 안에 남아 있는 소의 중요 한 매개 변수 (평균 호흡 속도 = 31.4 ± 7.04 (SD) 당 분, 평균 심장 박동 호흡 75.9 ± 8.9 박동 분, 그리고 평균 당 = 직장 온도 = 38.2 ± 0.68 ° C, 그림 3).

수동 압력 hemostasis (약 25 분)를 달성 하기 위해 생 검 지역에, 다음 오픈 상처 최소한의 출혈 (그림 4) 보여주었다. 소 같은 다이어트 광고 libitum, 지 루 했다 고 동물 수술 기간 동안 동일한 주택 시설에 보관 했다. 동물 생 사이트;에서 감염의 표시를 보여주지 않았다 아무 통증, 출혈, 붓기, 배수, 또는 높은 온도 (그림 5) 했다. 생 검 (그림 5C)의 8 ~ 10 d 내 상처 치유.

한 동물 절차 후 8 일에 문 지르고 상처로 인해 경미한 피부 자극을 개발. 이 암소는 생 검 사이트 povidone-요오드 솔루션 및 70% 이소프로필 알코올을 사용 하 여 청소 하 여 치료 했다. 스테인레스 스틸 스테이플 배수 장치를 허용 하도록 제거 되었다 고 povidone 요오드 연 고 (1%)는 2 ~ 3 d에 대 한 생 검 사이트에 하루에 두 번 적용 되었다. 피부 자극 povidone-요오드 연 고를 적용 한 후 2 d 사라 고 더 합병증으로는 상처 치유.

혈전은 기계 젖을 짜기 전에 biopsied 분기에서 우유의 스트립 손으로 제거 되었습니다. 현재 프로토콜에서 우유에 혈전의 존재는 생 검 후 최대 3 milkings (약 36 h)에 대 한 관찰 되었다. 우유의 혈액 오염 생 검 후 최대 48 h에 대 한 관찰 되었다. 우유에는 혈액의 양 기준으로 코어 및 바늘 생 검 사이 관찰 하는 시각 차이가 있었다. 동물 (그림 6) 절차 후 우유 수확량에 있는 중요 한 감소를 보여주지 않았다. 평균 우유 구성 되었고 4.37% 지방, 3.34% 단백질, 유 당 4.64%. 평균 우유 체세포 수 (SCC) mL 당 미만 200, 000 셀 이었다.

얻은 MG 조직 1 차 셀 문화 (그림 7) 같은 다른 연구 목적을 위해 사용할 수 있습니다.

Figure 3
그림 3 . 동물 건강 지표의 평가 소 유선 생 검 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 4
그림 4 . 후 생 검 사이트 모양을 . 수동 압력 hemostasis 달성 하기 생 검 지역에 적용 했다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 생 검 사이트 사진. (A) 생 검 절차. 후 3 d 사이트 (B) 생 검 절차. 후 6 d 사이트 (C) 생 상처 았다 적절 하 게 설명 하는 절차 후 10 d 사이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 . 매일 우유 생산 소 유선 생 검 전후 (n = 3 소). 선형 모델 추정 10 일 생 검 전에 동물 생산의 하루 우유 23.35 kg. 우유 수확량은 크게 변화 하지 않았다 (P > 0.05) 10 일 전에 생 후 10 일에서에서 비록에 약간의 증가 우유 수확량 관찰 되었다 (10 일전 생 검에서에서 매일 우유의 0.0005 k g/d의 증가). 3 동물이이 프로토콜;에 사용 되었다 1 동물은 두번 biopsied (동물 1: 코어 생 검 젖 통의 왼쪽에, 오른쪽 젖 통에 생 검 바늘) 두 동물 했다 biopsied 한 번 (동물 2와 3: 코어 또는 바늘 절차를 사용 하 여 젖 통의 오른쪽에만). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 . 기본 소 유 방 상피 세포 문화의 대표적인 이미지. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

코어 및 바늘 생 검 방법이 프로토콜9,16에서 설명 했다. 동물 건강 및 생 검 전에 유선 염14 의 발생률에 대 한 자세한 평가 두 절차에 필요 합니다. 연구 목적으로, 염증이 나 감염 증의 분명 한 징후와 동물에서 기술 수행를 피해 야 한다. 이 중 고 생 검 후 합병증의 위험을 줄일 것입니다. 모든 생 검 기기 및 장치, 소독, 깨끗 하 고 생 검 사이트의 오염을 방지 소독 해야 합니다. 절차, 전에 그것은 수술 부위의 감염 (SSI)을 최소화 하는 데 필요한입니다. 일반적으로, SSI 동물 병 적 상태, 손실된 성능 및 젖소에서 높은 생산비와 연결 됩니다. 연구는 이전 생 머리 절 개 사이트, 생 지역 오염9,14, 제거 세척 및 살 균 대리인 (70% 알코올, 요오드 수술을 사용 하 여 클리핑 등 때문에 SSI를 방지 하는 방법을 보고 9, 2% 액체 아세테이트 솔루션14, 10 %povidone-요오드8스크럽) 피부 준비를 위해. 일부 연구에서 항생제의 관리는7 중 또는 생 검9; 직후 채택 되었다 그러나, 항생제 예방 치료는 현재 작업에 사용 되지 않았습니다 하 고 생 검 사이트의 아무 감염 관찰 했다. 오염을 방지 하기 위해 상처 생의, 꼬리 졸 붕대가 적용 될 때까지 생 사이트와 접촉을 방지 하기 위해 확보 해야 합니다. 이 프로토콜에서 스테이플 스는 생 후 약 10 ~ 14 d 제거 됩니다.

코어 생 검 전에 제대로 도구를 설정 하 고 드릴;에 첨부 하는 것이 중요 하다 느린 회전 속도 선택, 앞으로 회전을 선택 하 고 드릴의 역방향 모드를 사용 하지 마십시오. 절차 동안,를 사용 하 여 디지털 압력의 절 개 양쪽에 떨어져 피부 가장자리를 유지 하 고 충분히 절 개 하지 않고 피부 또는 결합 조직 도구 항목을 허용 하도록 중요 하다. 이 절차를 수행 하지, 코어 생 검 계기의 회전 하는 동안 절 개 가장자리에 드래그 발생 하 고 감염의 위험을 증가 시킬 것입니다 하 고 상처 치유를 지연 수 있습니다 추가 피부 조직 외상을 일으킬 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 현재 생 검 절차 보드 큰 동물 외과 의사에 의해 수행 되었다. 절차를 성공적으로 수행 했다 (그림 5). 두 기술은 비교적 간단 하 고 빠른 수술 절단 절차에 비해 수행 하 있습니다.

젖소8,,910,14MG 생 검 후 생 검 사이트에서 출혈 일반적입니다. 현재 프로토콜에서 최소한의 (그림 4)은 관찰 출혈는 절차 후 바로 상처에 적절 한 (강한) 압력의 응용 프로그램 때문일 수 있습니다. 적어도 20 분 동안 강한 압력은 필요, 그리고 그것은 경우에 따라 30 분 이상 필요할 수 있습니다. 심한 출혈에 적당 한 생 검 사이트에 압력의 적용 후 관찰 되는 경우, 압력을 계속 하 고 즉시 수 의사에 게 연락 하는 것이 좋습니다.

Hemostasis 암소 사망률을 줄이기 위한 중요 한 요소 이다로 한 연구 생 사이트9출혈 제어에 hemostatic 패드를 포장. 그러나, 같은 방식으로 hemostatic 패드의 사용 낙농 환경에서 미생물 오염에 대 한 높은 잠재적인 위험을 있다. 또 다른 연구14 반복된 biopsies 사이 및 생 검 및 피부 폐쇄 후 생 검 사이트에 수동 압력을 적용 하 고 적어도 2 h 생 검 다음에 사이트에 얼음을 적용. 현재 프로토콜에서 강한 압력을 20 ~ 25 분에 대 한 생 검 사이트에 적용 했다 출혈을 제어 하는 적절 한.

성공적인 생 검 기술 절차 후 짧은 기간 동안 지속 되는 우유에 최소 혈액 발생 한다. 우유 감소 및 유선 염 감염 시 우유 분 비의 중단을 방지 하려면 intramammary 혈전 biopsied 분기10,14에서 스트립 손으로 제거 되어야 한다. 현재 프로토콜에서 피는 생 후 48 h까지 우유에 관찰 되었다. 그러나, 동물의 더 큰 수를 사용 하는 연구, 우유에 피는 보다 6 일 소의 대부분에 관찰 되었다. 몇몇 동물 6 일8후 우유에 혈액을 보여주었다. 이러한 이유로, 우유 외관의 매일 관찰 절차 후 6 d 필요 하다. 동물 때 큰 조직 샘플14얻은 유선 염 감염의 어떤 표시를 전시 하지 않았다. 그러나, 이전 연구는 바늘을 사용 하 여 같은 동물에 반복된 biopsies을 수행 발견 그 유선 염 감염 발생률은 약 12% 다음 절차8. 현재 프로토콜에서 어느 동물 임상 유선 염 수술 후 감염의 시각적 표시를 했다. 또한 약간의 기회는 생 검 후 절 개 사이트를 감염 될 수 있습니다.

Tolazoline 염 산 염, 약물, 진정의 효과 반전 하는 xylazine에서 과다 복용의 경우 사용할 수 있어야. Xylazine의 과도 한 복용량은 폐부종을 발생할 수 있습니다. 폐 부 증의 임상 증상에는 호흡 곤란, 심한 호흡 곤란, 호흡 곤란, 기침, 및 거품가 래 포함 됩니다. 폐 부 증의 징후를 관찰 하는 경우 tolazine (몸 무게의 2 ~ 4 mg/kg)를 사용 하 여 xylazine 효과 반전 하는 것이 좋습니다.

현재 프로토콜 모두 바늘 생 검 및 코어 생 검을 수행 기법을 설명 합니다. 일반적으로, 바늘 생 검에 비해 코어 생 검의 장점은 젖 통 건강에 부정적인 영향을 최소와 더 큰 조직 샘플 (0.75 ~ 1 g)9 . 바늘 생 검 코어 생 검 계기 보다는 보다 적게 침략 적 방법입니다. 그러나, 여러 생 검 조직을 바늘 생 검 절차 후 우유에 혈전 뿐만 아니라 절차, 주요 출혈의 위험을 증가 시킬 수 있습니다 사용 하 여 더 많은 양의 얻을 하려고 합니다. 두 기술은 최소한의 소 병 적 원인이 고 수술 인원의 최소한의 교육으로 쉽게 달성 했다. 매일 우유 수확량 (8 ~ 10% 감소)와 그것의 구성9 및 사료 섭취 량 감소14 단기 변화는 각각 코어와 바늘 생 검 후 예상 된다. 바늘 생 검 절차의 한계는 바늘으로 제거 하는 조직의 작은 볼륨. 악기는 바늘 biopsied 되도록 조직 내 이며 여러 시도 자주 조직, 절차 후 우유와 유선 염에 혈액의 위험을 증가의 적절 한 금액을 얻기 위해 필요한 경우에 활성화 될 필요가 있다. 코어 생 검의 경우 많은 양의 조직 수술 후 출혈의 위험이 높은 포함 (> 200 mg)입니다. 또한, 생 검 도구는 사용 하기 전에 적절 한 훈련 요구를 더 어렵습니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 연구는 국립 동물 영양 프로그램 및 버지니아 기술에 의해 지원 되었다. 양 타 라 Pilonero, 박사 줄리 Settlage, 및 박사 Izabelle 텍사스의 기술 지원은 기꺼이 인정 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Isopropyl alcohol  Walmart  565106257 1 L
Aerosol spray to kill and repel flies MWI 14339 1 bottle (if necessary)
Biopsy needles, 12 G × 16 cm C. R. Bard MN1216 2
Butterfly infusion set (18 G needle) Fisher 22-258087 1
Cell culture dishes Fisher 08-772E 4
Cordless drill (low speed) Hitachi   DS10DFL  1
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors.
Cows cattle healthy
Flunixin meglumine MWI/VetOne 501018 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight
Folding table   Amazon 1
Forceps Fisher 09-753-50 1
Gloves non-sterile  Fisher 17-200-845 9, size dependent
Hard brush  Sullivan Supply 18270 1, to wash the cows
Head gate  1, customized for dairy cows
Lidocaine hydrochloride 2% injectable  MWI/VetOne 510212 6 mL was used,  from 3 to 8 mL
Livestock body wash eZall Technologies 39384 1, to wash the cows
Needle 18 G  (1 to 1/5“) Fisher 14-821-15A 6
Needle 20 G (1 to 1/5“) Fisher 14-815-526 6
Phosphate buffered saline (0.9%) Fisher 20-012-043 1 L
Povidone Iodine ointment Jeffers #VED1A 500 g (if necessary)
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) MWI/VetOne 510094 1 L
Reusable biopsy instrument  C. R. Bard MG1522 1
Rope halter Nasco farm and ranch C10852 2, cow size
Scalpel blades (#10) MWI 033870 2
Scalpel holders (#3) MWI 602008 1
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. Fisher 19-130-0038 1 case of 800
Sterile cotton gauze sponges Fisher 22-037-986 4
Sterile gauze pads Fisher 19-090-735 4
Sterile surgical gloves  Surgical gloves 19-166-679 3,  size dependent
Sterile surgical towels Fisher 50-118-0339 6
Stethoscope Littmann Master Classic II 1392 1
Surgical clipper Oster A5 078005-010-003 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical clipper blades (#40 ) Oster  78919-016 1, preparation of the animal for biopsy
Surgical staple remover MWI 541 1
Surgical stapler pre-loaded MWI 17713 5
Syringes of 10 mL Fisher 14-823-224 3
Syringes of 2 mL Fisher 22-028854 3
Syringes of 20 mL Fisher 22-034507 3
Syringes of 5 mL Fisher 22-028855 3
Thermometer Agri-Pro Enterprises Inc 72000 1
Tolazine hydrochloride Akorn Animal Health 61311-486-10 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary)
Tweezer  Fisher 14-955-025 1, for handle the tissue sample
Water hose Miracle-Gro, Walmart 554990501 1, to wash the cows
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) MWI 010728 1 bottle 
Xylazine hydrochloride MWI/VetOne 510650 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight

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References

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소 유선 생 검 기술
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Daley, V. L., Dye, C., Bogers, S. H., Akers, R. M., Rodriguez, F. C., Cant, J. P., Doelman, J., Yoder, P., Kumar, K., Webster, D., Hanigan, M. D. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J. Vis. Exp. (142), e58602, doi:10.3791/58602 (2018).More

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