Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

监测小鼠睡眠/觉醒状态期间神经回路的光遗传学操作

doi: 10.3791/58613 Published: June 19, 2019
* These authors contributed equally

Summary

在这里,我们描述了在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间对特定类型神经元的光遗传学操作方法,并举例说,我们最近对纹状体末期骨细胞核的床核进行了实验。

Abstract

近年来,光遗传学在神经科学研究领域得到了广泛的应用。在许多情况下,蛋白酶,如通道红蛋白2(ChR2),由病毒载体在各种Cre-驱动程序小鼠的特定类型的神经元细胞中表达。这些蛋白酶的激活由激光或LED通过光缆传递的光脉冲应用触发,激活效果以非常高的时间分辨率观察到。实验者能够敏锐地刺激神经元,同时监测小鼠的行为或其他生理结果。光遗传学可以启用有用的策略来评估神经元回路在调节小鼠睡眠/觉醒状态的功能。在这里,我们描述了一种技术,用于检查在脑电图(EEG)和肌电图(EMG)监测期间具有特定化学特性的神经元的光遗传学操作的影响,以评估小鼠的睡眠阶段。例如,我们描述了在纹状体末期性(BNST)的床核中GABAergic神经元的操纵。这些神经元的急性光遗传学激发在NREM睡眠期间应用时触发快速过渡到觉醒。光遗传学操作以及EEG/EMG记录可以应用于破译调节睡眠/觉醒状态的神经元回路。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

睡眠对于最佳的认知功能至关重要。最近的发现还表明,睡眠障碍与各种疾病1,2,3有关。虽然睡眠的功能尚未基本解决,但最近在理解控制睡眠/觉醒状态的神经回路和机制4方面取得了实质性进展。在哺乳动物中,有三种警惕状态:觉醒、非快速眼动(NREM)睡眠和快速眼动(REM)睡眠。觉醒性的特点是低振幅的快速脑电图振荡(5-12 Hz),具有有目的和持续的电机活性。NREM 睡眠由高振幅(增量波)的缓慢振荡(1-4 Hz)定义,缺乏意识和有目的的运动活动。REM睡眠的特点是低振幅相对快速的振荡(6-12赫兹),几乎完成双边肌肉肌张力5。

Borbely提出了一种睡眠觉醒调节理论,称为两个过程模型6,7。静温过程,也称为过程S,表示在觉醒期间积累并在睡眠期间消散的睡眠压力。另一个过程,称为过程C,是一个昼夜过程,这解释了为什么警戒水平在24小时周期中波动。除了这两个过程,等静因素对于调节睡眠/觉醒8,9也很重要。过敏因素包括营养状态和情绪。恐惧和焦虑通常伴随着觉醒的增加,以及自主和神经内分泌反应10,11,12。边缘系统被认为在调节恐惧和焦虑方面发挥作用,自主和神经内分泌反应背后的机制已经被广泛研究,但边缘系统影响睡眠/觉醒状态的途径尚未尚未透露。最近大量使用光遗传学和药理遗传学的研究表明,调节睡眠/觉醒状态的神经元和神经元回路分布在整个大脑中,包括皮质、基底前脑、丘脑、下丘脑、和脑干。特别是,光遗传学的最新进展使我们能够刺激或抑制具有高空间和时间分辨率的特定神经回路i n vivo。这项技术将允许我们了解睡眠和觉醒的神经基质,以及睡眠/觉醒状态如何受到昼夜过程、睡眠压力和包括情绪在内的同感因素的调节。本文旨在介绍如何使用光遗传学操作与睡眠/觉醒记录相结合,这有可能更新我们对大脑中在调节NREM睡眠、REM睡眠、REM睡眠方面起着一定作用的连体和机制的理解。和觉醒。理解这种机制,通过边缘系统调节睡眠/觉醒状态是对健康至关重要的,因为失眠通常与焦虑或恐惧无法入睡(失眠恐惧症)相关。

BNST被认为在焦虑和恐惧中起着至关重要的作用。GAD 67-表达GABAergic神经元是BNST 12,13的主要种群。我们研究了光遗传学操纵这些神经元(GABABNST)对睡眠/觉醒状态的影响。近年来神经科学的最大进步之一是能够操纵体内具有特定化学特性的神经元,具有高空间和时间分辨率。光遗传学对于证明神经活动和特定行为反应之间的因果关系非常有用14。我们将光遗传学描述为一种在调节睡眠/觉醒状态时检查已定义神经回路的功能连接性的方法。通过利用这一技术,在理解调节睡眠/觉醒状态神经元回路15,16,17,18,19方面取得了很大进展。.在许多情况下,蛋白酶通过Cre-驱动程序小鼠和可诱导的AAV介导基因转移的组合,在选择性大脑区域具有特殊化学特性的神经元中具体引入。此外,光敏蛋白酶(如通道性多氯环素 2 (ChR2)20或古黄素 (ArchT)21与 Cre-loxP 或 Flp-FRT 系统结合使用,可让我们操纵选择性神经元总体和特定神经通路22.

我们在这里以BNST中GABAergic神经元的实验为例。为了在指定的神经元种群中表达蛋白酶,最常使用适当的 Cre 驱动程序小鼠和 Cre 依赖性病毒载体。转基因或敲线,其中蛋白酶表达在特定神经元群体也很有用。在以下实验中,我们使用GAD67-Cre敲撞小鼠23,其中只有GABAergic神经元表达具有C57BL/6J遗传背景的Cre重组酶,以及含有ChR2(hChR2 H134R)与EYFP或EYFP融合的AAV载体作为对照带有"FLEx(翻转切除)开关"24 。该程序特别描述了在监测睡眠/觉醒状态25期间,BNST中GABAergic神经元的光遗传学激发。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

所有实验均获得筑波大学动物实验和使用委员会的批准,符合NIH指南。

1. 动物外科、病毒注射、脑电图/EMG电极和光纤植入

警告:应根据所使用的病毒的生物安全水平选择适当的保护和处理技术。AAV 应用于隔离的 P1A 分级室进行喷射,并且携带 AAV 的管子必须在所有体积都用完用后用高压灭菌器进行灭菌。手术部位和所有植入的材料在使用过程中应清洁和无菌。
注:参见图 1

  1. 用高压灭菌器消毒手术设备。
  2. 使用麻醉喷雾剂用异苯可图的老鼠麻醉。观察,直到小鼠达到所需的麻醉深度,由对用钳子捏住尾巴的反应丧失决定。在眼睛上涂上眼膏,防止眼睛干燥。
  3. 用碘溶液或70%EtOH(3x)对手术现场进行消毒,并充分干燥。在进行手术时,允许病毒在冰上解冻。用吸水性实验室工作台纸盖住手术区。
  4. 用耳条和鼻子捏合将鼠标头部固定在立体定向装置中。确认头部保持稳稳后,在头皮上做一个中端切口,以确保胸膜和 lambda 的位置位于水平线上的同一水平。
  5. 为了避免定位间隙,请适当调整鼻尖和耳杆上下的液位。布雷格玛和兰布达分别指苏图拉萨吉塔利斯和苏图拉冠状体或苏图拉羊肉的交集(图2)。
  6. 使用血清素夹固定皮肤,以保持对颅骨的访问。接触颅骨后,用碘或5%H2O2对颅骨表面进行消毒,使颅形缝合线(包括胸腔和羊羔)更清晰地呈现。
  7. 准备AAV载体注射:
    1. 用70%EtOH、100%EtOH和消毒水依次清洗10mL注射器内部(见材料表)。各5次。将注射器固定在微注射泵臂的夹子中,并确保注射器中的所有溶液都已排出。
    2. 小心吸出2μL的矿物油,没有气泡,然后吸出病毒溶液的指定体积。吸气后,操纵柱塞按钮,确认病毒溶液出现在针尖处。
      注:病毒溶液的注射量是在试验实验中使用相同的小鼠菌株和相同病毒产物确定的。应提前估计病毒溶液量与感染面积的关系。
  8. 注入 AAV 矢量:
    1. 调整微注射针尖上的胸针,并将坐标记为原始点。将尖端移到指定的注射部位(对于 BNST:前背剂 = 0.2 mm,平间边 = 1.0 mm,多索索文特 - 4.2 毫米),并将针头放在位置。使用带有 0.7 mm 硬质合金切割机的牙科钻头在头骨上打上标记,钻出直径约 2 mm 的孔。小心不要损坏杜拉或脑组织。
    2. 用棉签从孔周围清除血液后,慢慢将针头移入 BNST 的位置。用机械显微注射器缓慢地注射指定数量的病毒溶液(0.07μl/min)。完成注射后,将针头留5分钟,使溶液充分渗入BNST组织。小心地拿出针头。
    3. 对于双边注射,在另一侧重复步骤 1.8.1-1.8.2。在整个过程中,使用无菌盐水保持头骨湿润。
      注:我们使用定制的 EEG/EMG 植入物(W:5 mm,D:7 mm,H: 1 mm),带四个 EEG 电极(4 毫米)、两个 EMG 电极(2 毫米;用钳子将 4 毫米电极切割为 2 mm)和 6 个电极(4.5 毫米)(图 2A)。
  9. 焊接两根不锈钢线(见材料表),其中1毫米的绝缘层从EMG电极的两端剥离。将电极的中心调整到布雷格玛,并标记每个 EEG 电极的位置(前背 - 1.5 mm,平庸 = 1.0 mm),并确定植入物的位置(图 2B)。
  10. 植入光纤:
    1. 将光纤套圈连接到操纵器并旋转操纵臂,使其与水平线的角度为 ±30°(此过程仅用于避免电极和光纤之间的干扰,例如 BNST 刺激)。将光纤尖端放在布格玛上并记录坐标。
    2. 将尖端移到目标插入线,并标记头骨上的位置。在锚固螺钉的插入位点附近放置其他标记。用牙科钻头钻每个部位的头骨,插入光纤并固定螺钉。把螺丝钉在头骨上。小心不要用螺丝破坏杜拉或损坏任何组织。
    3. 轻轻插入光纤,直到用操纵器到达 BNST 上方。套圈应位于剩余的颅骨上(图1B)。
    4. 应用可光固化的牙科水泥(见材料表)覆盖纤维和螺钉。凝固胶水的反应时间应由制造商手册指定(我们的材料需要暴露在光线下至少 10 s 与特定的波长光发生器。在此之后,没有必要干燥胶水)。
    5. 在此步骤中,确保没有材料(螺钉或胶水)占用电极的安装空间。此外,避免在连接到光纤和电缆的铁圈的水泥上造成任何中断。在另一侧重复步骤 1.10.1-1.10.4 进行双边刺激。
  11. EEG/EMG 电极的钻孔。将电极的尖端插入孔中。握住植入物,将氰丙烯酸酯粘合剂涂抹在头骨和电极之间的空间上。再次插入并注意不要干扰任何材料。
  12. 用氰丙烯酸酯粘合剂覆盖电极和光纤的周长,然后将氰丙烯酸酯加速剂涂在胶粘剂上。此步骤可避免在铁圈到光纤电缆和电极到引线连接区域造成任何中断(图 1C)。
    注:氰丙烯酸酯粘合剂及其助燃剂对小鼠眼睛有害。注意不要引起这些化学物质的溢出。此外,请注意不要强烈接触电极和纤维,以免在胶粘剂凝固后立即出现意外偏差。
  13. 露出小鼠颈部肌肉,将 EMG 电极的导线插入肌肉下方。调整EMG电极的长度,使其位于鼻底肌下方。电极尖端和肌肉筋膜之间的光连接足以捕捉EMG信号。
  14. 应用氰丙烯酸酯粘合剂填充植入物,用加速液体凝固粘合剂。然后,将鼠标放在热垫上进行恢复,直到出现姿势反射。将加热垫温度调节到动物休息的体温(C57BL6小鼠的ZT 0-12温度为36.0 °C;不要超过38.0 °C)。
    注:无菌手术不需要抗生素。
  15. 遵循您当地机构指南的术后麻醉。将小鼠放在家庭笼子里至少7天。

2. 脑电图/EMG监测,对特定睡眠状态的靶向神经元进行光激发

警告:该协议包括使用 3B 类激光设备或 LED 设备。实验者应注意安全信息。需要护目镜。

  1. 在将激光电缆连接到光纤之前,使用缩放器调整激光强度。用套圈将激光电缆的尖端连接到未使用的光纤上,并确认光纤和电缆之间的连接处没有空间。
  2. 打开激光的主开关,等待 20 分钟,使其预热。
  3. 将激光发射到强度检查器,并将激光强度调整到10mW/mm2。将激光模式更改为晶体管逻辑,并确认光脉冲来自由模式调节器控制的光纤,该光纤的持续时间设置为 10 ms,休息时设置为 40 ms,循环为 20 次,重复 20 次(即 20 秒为 20 ms 的光脉冲为 20 Hz)。
  4. 恢复期后,将小鼠移动到实验室以记录脑电图/EMG。家老鼠在恒定的23°C与12小时的光/暗周期与食物和水可用。
  5. 连接被植入的电极和电缆适配器,将其系在滑环上,以避免纠缠。建议用铝箔等防光材料覆盖结点,以防止激光泄漏。如果需要双边实验,请使用带分叉附件的滑环。
  6. 在此协议中,我们评估 NREM 睡眠或 REM 睡眠唤醒的延迟,因此记录时间应限制在优化的时间(ZT0 定义为指示灯亮起的时间)。此协议在 ZT4 - ZT10 之间进行。让小鼠在实验室中自由停留至少1小时,以适应。
  7. 在实验期间,在同一监视器中监测EEG和EMG信号,并将小鼠的状态评估为觉醒、NREM睡眠或REM睡眠。使用每个波的增益控制,以便更轻松地区分每种状态。
  8. 要测量 NREM 睡眠到觉醒延迟,请观察稳定 NREM 睡眠 40 秒或稳定 REM 睡眠 30 秒,然后打开模式生成器开关以进行光刺激(此协议可生成 20 hz 的 10 ms 光脉冲 20 秒)。确认激光发射到植入的光纤。
  9. 记录 EEG/EMG 信号,直到睡眠状态变为唤醒状态。如果需要两次或两次以上的实验,将光遗传学操作限制在每天一次,因为光刺激是一种人工干预,可能会影响睡眠/觉醒结构。
  10. 实验后,对无菌盐碱和甲醛(PFA)进行深度麻醉和渗透,对全脑进行免疫组织化学分析26。

3. 从NREM睡眠到觉醒的延迟时间分析

  1. 记录 EEG/EMG 信号后,将信号数据传输到计算机以对睡眠/觉醒状态进行评分。该协议描述了使用记录软件进行EEG分析的方法(见材料表)。
  2. 启动睡眠符号应用程序,然后单击"文件"选项卡并选择"打开"以选择记录的数据 (.kcd 文件)。单击"睡眠"选项卡以选择"时间时间"以调整每个纪元的时间窗口(我们使用 1 个纪元/4 秒)。
  3. 根据以下标准,根据EEG/EMG信号手动对睡眠/觉醒状态进行评分:觉醒、高EMG和高频低EEG电压;NREM,低EMG音和高脑电图电压,频率高+(0.5-4赫兹);和 REM,EMG 表示高 μ (6-9 Hz) 频率的肌肉肌张力和低 EEG 电压。不连续持续 16 s(即 4 个纪元)的状态不定义为状态更改,因为它不是稳定状态。
  4. 单击并按住第一个纪元上的鼠标左键并拖动光标,直到超过 16 s(4 个纪元)的特定趋势结束。然后,释放鼠标左键,并在弹出窗口中选择适当的状态(唤醒或 NREM 睡眠或 REM 睡眠)。重复此过程,对文件中记录的所有 EEG/EMG 信号进行评分。
  5. 在 EEG 显示 NREM 或 REM 睡眠的年代内查找确切的刺激时间,以及显示刺激点后状态转换的纪元。计算刺激后和状态转换前的期间之间的纪元数。
  6. 然后将计数的年数乘以 4 s (A)。在刺激时代,拍摄屏幕截图并测量刺激点与纪元结束之间的宽度。然后,将测量的长度除以整个纪元长度,再乘以 4 s (B)。同样,计算状态变化期间 NREM 睡眠的持续时间,这意味着纪元开始到状态更改点 (C) 之间的时间。
  7. 和 A、B 和 C 求从 NREM 睡眠到唤醒的延迟。相同的过程用于分析从REM睡眠到觉醒的状态转换。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

本研究显示了GABABNST神经元的光遗传学激发对睡眠状态过渡的影响。ChR2-EYFP在BNST的GABA神经元中被重点表达。原位杂交组织化学研究表明,ChR2-EYFP在表达GAD 67 mRNA信号的神经元中共同定位,表明这些是GABAergic神经元。免疫性化学切片样本证实了光纤的位置,其尖端略高于BNST25。

图3A显示了NREM睡眠期间光刺激前后的代表性EEG/EMG痕迹。没有 EMG 信号的高压和慢频 EEG 表示 NREM 睡眠。光刺激(20 Hz脉冲为10ms脉冲20秒)在稳定的NREM睡眠后应用。刺激触发急性过渡到觉醒(低电压和高频脑电图与有源EMG信号)约2s后刺激在ChR2表达小鼠。对照小鼠 (EYFP) 在刺激后未显示过渡(从 NREM 醒来的延迟:EYFP,295.39 = 106.61 秒,n = 6; ChR2: 2.71 ± 0.59 秒, n = 6;t10 = 2.35,p < 0.05;图 3B,上部)。这些数据表明,在NREM睡眠期间,GABABNST神经元的激发会触发觉醒的快速诱导。另一方面,REM睡眠期间的光刺激没有效果(EYFP:36.45 ± 13.08 秒,n = 6; ChR2: 37.29 ± 15.19 秒, n = 6;t10 = 0.04,p = 0.484;图3B,底部),所以过渡效应只出现在NREM睡眠中。

Figure 1
图 1:注射AAV、植入光纤和EEG/EMG植入物的程序。(A) 病毒注射的实验程序.EYFP融合ChR2或EYFP(用于控制)基因纳入AAV载体,其转录被Cre重组酶激活,并双边注入BNST。(B) 光纤以 30° 角向 BNST 方向插入,以防止与电极碰撞。它周围插了两颗螺丝。(C) EEG/EMG记录装置在光纤牢固放置后植入。(D) 在手术结束时,整个手术区域应覆盖氰丙烯酸酯粘合剂,并强烈固定。确保不要将任何剂涂抹到连接电极和套圈的区域。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:定制EEG/EMG电极和电极引脚插入位。(A) 顶部:在 6 个电极引脚中,外部两个引脚被切割到 2 mm。底部:EEG/EMG 电极。(B) 这些电极和EMG传导导线然后焊接。连接区域应与任何绝缘材料(如氰丙烯酸酯粘合剂)隔离。电极的插入位点相对于胸膜(前背器 = 1.5mm,平庸 = 1.0 mm)。EMG 导线插入颈部肌肉下方,并去除绝缘保护插入部位(1 mm)的导线。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3: GABABNST的影响刺激NREM睡眠和REM睡眠的状态转换。(A) 代表EEG和EMG波和EEG功率谱.光刺激(20 Hz时10ms脉冲,20秒)应用于ChR2表达GABABNST神经元,在40秒NREM睡眠后。觉醒在2s后迅速诱导。EEG 显示低电压和高频与EMG爆裂。EEG 功率谱图还显示了从低频到高频的过渡。(B) GABABNST神经元的蛋白基因激发显示从NREM睡眠到觉醒(上部)的快速过渡,但在REM睡眠(下图)中应用同样的操作时,这种效应是看不到的。•p < 0.05,韦尔奇的t-测试。请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

我们提出了一种评估具有特定化学特性的神经元的光遗传学刺激对睡眠/觉醒状态过渡的影响的方法,并给出了GABABNST神经元操作的例子。我们的数据表明,GABABNST神经元的光遗传学激发导致从NREM睡眠到觉醒的即时过渡。

由于多种光遗传学工具的开发,各种实验设计都可用。可以使用不同类型的蛋白酶(如ChR2、SSFO、哈洛多普辛、ArchT和iChloC27)激活或抑制特定神经元的神经元活动。ChR2可以在光刺激后几毫秒激活神经元,这可用于脉冲发生器以相锁方式唤起作用电位,以检查特定睡眠阶段的急性冲击。稳定激活蛋白,如稳定步进功能蛋白酶(SSFO),在刺激后诱导神经元去极化15至30分钟,对于一些旨在观察半慢性效应28的实验也很有用。使用SSFO的去极化细胞可能对各种生理神经元输入更加敏感,并通过应用长波长光而停用。此外,我们可以通过在斧子投影部位植入光纤来激活斧子。纤维刺激可以提供有关特定子向投影通路的功能的信息。

光遗传学操作过程中的EEG/EMG记录是一种侵入性较低的方法,用于确定选择性激发/抑制神经回路对小鼠睡眠/觉醒状态的直接后果。使用这种方法,许多神经元群和神经回路已被证明参与睡眠/觉醒状态的调节。为了进一步发展这种技术,可以植入多个纤维同时操作多个通路,或者也可以与纤维光metory或微型示波器结合使用来监测神经元活动。

总之,预计光遗传学将加速解开大脑睡眠调节之谜的进展,并开发治疗难治性失眠和其他睡眠障碍的创新疗法。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

这个项目得到了默克公司的部分财政支持。

Acknowledgments

这项研究得到了默克调查员研究计划(#54843、创新领域科学研究援助卡肯希助学金、"威尔动力"(16H06401)和KAKENHI创新领域探索性研究资助资助(T.S.)的支持。(18H02595)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x1 Fiber-optic Rotary Joints Doric FRJ 1x1 FC-FC for optogenetics
6-pin header KEL corporation DSP02-006-431G
6-pin socket Hirose 21602X3GSE
A/D converter Nippon koden N/A Analog to digital converter
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP 3.70×1013(genomic copies/ml)
AAV10-EF1a-DIO-EYFP 5.82×1013(genomic copies/ml)
Ampicillin Fuji film 014-23302
Amplifier Nippon koden N/A for EEG/EMG recording
Anesthetic vaporizer Muromachi MK-AT-210D
Automatic injecter KD scientific 780311
Carbide cutter Minitor B1055 φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor 
Cyanoacrylate adhesion  (Aron alpha A) and acceleration Konishi #30533
Dental curing light 3M Elipar S10
Epoxy adhesive Konishi #04888 insulation around the solder of 6-pin and shielded cable
Fiber optic patch cord (branching) Doric BFP(#)_50/125/900-0.22
Gad67-Cre mice provided by Dr. Kenji Sakimura Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele
Hamilton syringe Hamilton 65461-01
High speed rotary micromotor kit FOREDOM K.1070 Used with carbide cutter
Interconnecting sleeve Thorlab ADAF1 φ2.5 mm Ceramic 
Isoflurane Pfizer 871119
Laser   Rapp OptoElectronic N/A 473 nm wave length
Laser intesity checker COHERENT 1098293
Laser stimulator Bio research center STO2 reffered as pulse generator in text
Optic fiber with ferrule  Thorlab FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10 provided by PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA Addgene plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA provided by Dr. Karl Deisseroth
Patch cord Doric D202-9089-0.4 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint
pHelper Stratagene
Photocurable dental cement 3M 56846
Serafin clamp Stoelting 52120-43P
Shielded cable mogami W2780 Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording
Sleep recording chamber N/A N/A Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder
Sleep sign software KISSEI COMTEC N/A for EEG/EMG analysis
Slip ring neuroscience,inc N/A for EEG/EMG analysis
Stainless screw Yamazaki N/A φ1.0 x 2.0
Stainless wire Cooner wire AS633  0.0130 inch diameter
Stereotaxic frame with digital console Koph N/A Model 940
Syringe needle Hamilton 7803-05
Vital recorder software KISSEI COMTEC N/A for EEG/EMG recording

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12, (3), 169-184 (2008).
  2. Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9, (3), 266-272 (2008).
  3. Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29, (4), 1047-1058 (2006).
  4. Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93, (4), 747-765 (2017).
  5. Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98, (4), 437-451 (1999).
  6. Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25, (2), 131-143 (2016).
  7. Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246, (2), R161-R183 (1984).
  8. Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493, (1), 92-98 (2005).
  9. Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68, (6), 1023-1042 (2010).
  10. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
  11. Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16, (6), 317-331 (2015).
  12. Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21, (4), 450-463 (2016).
  13. Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138, (12), 2499-2509 (2011).
  14. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13, (4), 251-266 (2012).
  15. de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71, (12), 1046-1052 (2012).
  16. Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (39), E2635-E2644 (2012).
  17. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
  18. Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
  19. Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8, (1), 1-12 (2017).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  21. Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
  22. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18, (4), 222-235 (2017).
  23. Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7, (December), 1-3 (2013).
  24. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28, (28), 7025-7030 (2008).
  25. Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
  26. Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. Springer. (2011).
  27. Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95, (3), 504-529 (2017).
  28. Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40, (6), 1301-1315 (2012).
监测小鼠睡眠/觉醒状态期间神经回路的光遗传学操作
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice. J. Vis. Exp. (148), e58613, doi:10.3791/58613 (2019).More

Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice. J. Vis. Exp. (148), e58613, doi:10.3791/58613 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter