Her beskriver vi metoder til optogenetisk manipulation af bestemte typer af neuroner under overvågning af søvn/vågenhed stater i mus, præsenterer vores seneste arbejde på sengen kernen af Stria terminalis som et eksempel.
I de seneste år, optogenetics har været meget udbredt i mange områder af neurovidenskabelig forskning. I mange tilfælde, en opsin, såsom kanal rhodopsin 2 (ChR2), udtrykkes ved en virus vektor i en bestemt type af neuronal celler i forskellige CRE-driver mus. Aktivering af disse opsynder udløses ved anvendelse af lysimpulser, som leveres af laser eller LED gennem optiske kabler, og effekten af aktivering observeres med meget høj tidsopløsning. Eksperimenteres er i stand til akut stimulere neuroner, mens overvågning adfærd eller et andet fysiologisk resultat i mus. Optogenetics kan gøre det muligt for nyttige strategier til at evaluere funktionen af neuronal kredsløb i reguleringen af søvn/vågenhed stater i mus. Her beskriver vi en teknik til at undersøge effekten af optogenetisk manipulation af neuroner med en specifik kemisk identitet under elektro encephalogram (EEG) og elektromyogram (EMG) overvågning for at evaluere søvn stadiet af mus. Som et eksempel beskriver vi manipulation af Gabaerge neuroner i sengen kernen af Stria terminalis (BNST). Akut optogenetisk excitation af disse neuroner udløser en hurtig overgang til vågenhed, når de anvendes under NREM søvn. Optogenetisk manipulation sammen med EEG/EMG optagelse kan anvendes til at dechifrere de neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater.
Søvn er afgørende for optimal kognitiv funktion. Nylige fund tyder også på, at søvnforstyrrelser er forbundet med en lang række sygdomme1,2,3. Selv om funktionerne i søvn er endnu stort set uløste, er der gjort betydelige fremskridt for nylig i forståelsen af neurale kredsløb og mekanismer, der styrer søvn/vågenhed stater4. I pattedyr, der er tre tilstande af årvågenhed: vågenhed, ikke-hurtig øjenbevægelse (NREM) søvn, og hurtig øjenbevægelse (REM) søvn. Vågenhed er karakteriseret ved hurtige EEG svingninger (5-12 Hz) af lav amplitude med målbevidst og vedvarende motorisk aktivitet. NREM Sleep er defineret ved langsomme svingninger (1-4 Hz) af høj amplitude (Delta bølger), med manglende bevidsthed og målbevidst motorisk aktivitet. REM søvn er karakteriseret ved relativt hurtige svingninger (6-12 Hz) af lav amplitude og næsten komplet bilateral muskel atoni5.
Borbely foreslog en teori om søvn-vågenhed forordning kendt som de to procesmodel6,7. En homeostatisk proces, også kaldet proces S, repræsenterer søvn tryk, der akkumuleres under vågenhed og spredes under søvn. En anden proces, kaldet proces C, er en cirkadisk proces, hvilket forklarer, hvorfor årvågenhed niveauer svinger i 24 h cyklus. Ud over disse to processer, allostatic faktorer er også vigtigt for regulering af søvn/vågenhed8,9. Allostatiske faktorer omfatter ernæringsmæssige tilstande og følelser. Frygt og angst er normalt ledsaget af en stigning i ophidselse sammen med autonome og neuroendokrine svar10,11,12. Det limbiske system menes at spille en rolle i reguleringen af frygt og angst, og mekanismer underliggende autonome og neuroendokrine reaktioner er blevet undersøgt udførligt, men den vej, hvormed det limbiske system påvirker søvn/vågenhed stater har ikke endnu ikke blevet afsløret. Et stort antal nylige undersøgelser ved hjælp af opto-og farmakogenetik har antydet, at neuroner og neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater er fordelt i hele hjernen, herunder cortices, basal forhjernen, thalamus, hypothalamus, og hjernestammen. Især har de seneste fremskridt inden for optogenetik gjort det muligt for os at stimulere eller hæmme specifikke neurale kredsløb in vivo med høje rumlige og tidsmæssige opløsninger. Denne teknik vil give fremskridt i vores forståelse af de neurale substrater af søvn og vågenhed, og hvordan søvn/vågenhed stater er reguleret af døgnrytmen processer, søvn tryk, og allostatiske faktorer, herunder følelser. Dette papir har til formål at introducere, hvordan man bruger optogenetisk manipulation kombineret med søvn/Wake optagelse, som kunne have potentialet til at opdatere vores forståelse af de connectomes og mekanismer i hjernen, der spiller en rolle i reguleringen af NREM søvn, REM søvn, og vågenhed. Forståelse af denne mekanisme, hvormed limbiske systemet regulerer søvn/vågenhed stater er af afgørende betydning for sundhed, fordi søvnløshed er normalt forbundet med angst eller frygt for at være i stand til at sove (somniphobia).
BNST menes at spille en væsentlig rolle i angst og frygt. Gad 67-udtrykker GABAergic neuroner er en stor population af bnst12,13. Vi undersøgte effekten af optogenetisk manipulation af disse neuroner (GABABnst) på søvn/vågenhed stater. En af de største fremskridt inden for neurovidenskab i de seneste år har været metoder, der muliggør manipulation af neuroner med særlige kemiske identiteter in vivo, med høje rumlige og tidsmæssige resolutioner. Optogenetics er meget nyttigt for at demonstrere årsagssammenhæng mellem neurale aktivitet og specifikke adfærdsmæssige responser14. Vi beskriver optogenetics som en metode til at undersøge den funktionelle konnektivitet af definerede neurale kredsløb i reguleringen af søvn/vågenhed stater. Ved at udnytte denne teknik, er store fremskridt opnået i forståelsen af neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater15,16,17,18,19 . I mange tilfælde introduceres opsynder specifikt i neuroner med særlige kemiske identiteter i selektive hjerneområder ved en kombination af CRE-driver-mus og CRE-inducerbar AAV-medieret genoverførsel. Yderligere, fokal ekspression af foto-følsomme opsynder såsom channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller archaerhodopsin (archt)21 kombineret med en CRE-Loxp eller FLP-FRT system giver os mulighed for at manipulere en selektiv neuronal population og specifikke neurale pathway22.
Vi beskriver her eksperimenter på GABAergic neuroner i BNST som et eksempel. For at udtrykke opsynder i en udpeget neuronal population, passende CRE driver mus og CRE-afhængige virus vektorer anvendes hyppigst. Transgene eller Knock-in linjer, hvor opsynder er udtrykt i særlige neuronal populationer er også nyttige. I de følgende eksperimenter, brugte vi GAD67-CRE Knock-in mus23 , hvor kun GABAergic neuroner Express CRE rekombinase med en C57BL/6j genetisk baggrund, og en AAV vektor, som indeholder ChR2 (hChR2 H134R) smeltet med eyfp eller eyfp som en kontrol med en “FLEx (flip-excision) switch”24. Proceduren beskriver specifikt optogenetisk excitation af GABAergic neuroner i BNST under overvågning af søvn/vågenhed stater25.
Vi her præsenterede en metode til at evaluere effekten af optogenetisk stimulering af neuroner med særlige kemiske identiteter på tilstandsovergange af søvn/vågenhed og gav et eksempel på manipulation af GABABnst neuroner. Vores data viste, at optogenetisk excitation af GABABnst neuroner resulterer i umiddelbar overgang fra NREM søvn til vågenhed.
Forskellige eksperimentelle designs er tilgængelige på grund af udviklingen af talrige typer af optogenetiske værkt…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Merck investigator Studies program (#54843), en KAKENHI-støtte til videnskabelig forskning i innovative områder, “WillDynamics” (16H06401) (T.S.), og en KAKENHI-støtte til sonderende forskning i innovative områder (T.S.) (18H02595).
1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
pHelper | Stratagene | ||
Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |