Summary
Her beskriver vi metoder til optogenetisk manipulation af bestemte typer af neuroner under overvågning af søvn/vågenhed stater i mus, præsenterer vores seneste arbejde på sengen kernen af Stria terminalis som et eksempel.
Abstract
I de seneste år, optogenetics har været meget udbredt i mange områder af neurovidenskabelig forskning. I mange tilfælde, en opsin, såsom kanal rhodopsin 2 (ChR2), udtrykkes ved en virus vektor i en bestemt type af neuronal celler i forskellige CRE-driver mus. Aktivering af disse opsynder udløses ved anvendelse af lysimpulser, som leveres af laser eller LED gennem optiske kabler, og effekten af aktivering observeres med meget høj tidsopløsning. Eksperimenteres er i stand til akut stimulere neuroner, mens overvågning adfærd eller et andet fysiologisk resultat i mus. Optogenetics kan gøre det muligt for nyttige strategier til at evaluere funktionen af neuronal kredsløb i reguleringen af søvn/vågenhed stater i mus. Her beskriver vi en teknik til at undersøge effekten af optogenetisk manipulation af neuroner med en specifik kemisk identitet under elektro encephalogram (EEG) og elektromyogram (EMG) overvågning for at evaluere søvn stadiet af mus. Som et eksempel beskriver vi manipulation af Gabaerge neuroner i sengen kernen af Stria terminalis (BNST). Akut optogenetisk excitation af disse neuroner udløser en hurtig overgang til vågenhed, når de anvendes under NREM søvn. Optogenetisk manipulation sammen med EEG/EMG optagelse kan anvendes til at dechifrere de neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater.
Introduction
Søvn er afgørende for optimal kognitiv funktion. Nylige fund tyder også på, at søvnforstyrrelser er forbundet med en lang række sygdomme1,2,3. Selv om funktionerne i søvn er endnu stort set uløste, er der gjort betydelige fremskridt for nylig i forståelsen af neurale kredsløb og mekanismer, der styrer søvn/vågenhed stater4. I pattedyr, der er tre tilstande af årvågenhed: vågenhed, ikke-hurtig øjenbevægelse (NREM) søvn, og hurtig øjenbevægelse (REM) søvn. Vågenhed er karakteriseret ved hurtige EEG svingninger (5-12 Hz) af lav amplitude med målbevidst og vedvarende motorisk aktivitet. NREM Sleep er defineret ved langsomme svingninger (1-4 Hz) af høj amplitude (Delta bølger), med manglende bevidsthed og målbevidst motorisk aktivitet. REM søvn er karakteriseret ved relativt hurtige svingninger (6-12 Hz) af lav amplitude og næsten komplet bilateral muskel atoni5.
Borbely foreslog en teori om søvn-vågenhed forordning kendt som de to procesmodel6,7. En homeostatisk proces, også kaldet proces S, repræsenterer søvn tryk, der akkumuleres under vågenhed og spredes under søvn. En anden proces, kaldet proces C, er en cirkadisk proces, hvilket forklarer, hvorfor årvågenhed niveauer svinger i 24 h cyklus. Ud over disse to processer, allostatic faktorer er også vigtigt for regulering af søvn/vågenhed8,9. Allostatiske faktorer omfatter ernæringsmæssige tilstande og følelser. Frygt og angst er normalt ledsaget af en stigning i ophidselse sammen med autonome og neuroendokrine svar10,11,12. Det limbiske system menes at spille en rolle i reguleringen af frygt og angst, og mekanismer underliggende autonome og neuroendokrine reaktioner er blevet undersøgt udførligt, men den vej, hvormed det limbiske system påvirker søvn/vågenhed stater har ikke endnu ikke blevet afsløret. Et stort antal nylige undersøgelser ved hjælp af opto-og farmakogenetik har antydet, at neuroner og neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater er fordelt i hele hjernen, herunder cortices, basal forhjernen, thalamus, hypothalamus, og hjernestammen. Især har de seneste fremskridt inden for optogenetik gjort det muligt for os at stimulere eller hæmme specifikke neurale kredsløb in vivo med høje rumlige og tidsmæssige opløsninger. Denne teknik vil give fremskridt i vores forståelse af de neurale substrater af søvn og vågenhed, og hvordan søvn/vågenhed stater er reguleret af døgnrytmen processer, søvn tryk, og allostatiske faktorer, herunder følelser. Dette papir har til formål at introducere, hvordan man bruger optogenetisk manipulation kombineret med søvn/Wake optagelse, som kunne have potentialet til at opdatere vores forståelse af de connectomes og mekanismer i hjernen, der spiller en rolle i reguleringen af NREM søvn, REM søvn, og vågenhed. Forståelse af denne mekanisme, hvormed limbiske systemet regulerer søvn/vågenhed stater er af afgørende betydning for sundhed, fordi søvnløshed er normalt forbundet med angst eller frygt for at være i stand til at sove (somniphobia).
BNST menes at spille en væsentlig rolle i angst og frygt. Gad 67-udtrykker GABAergic neuroner er en stor population af bnst12,13. Vi undersøgte effekten af optogenetisk manipulation af disse neuroner (GABABnst) på søvn/vågenhed stater. En af de største fremskridt inden for neurovidenskab i de seneste år har været metoder, der muliggør manipulation af neuroner med særlige kemiske identiteter in vivo, med høje rumlige og tidsmæssige resolutioner. Optogenetics er meget nyttigt for at demonstrere årsagssammenhæng mellem neurale aktivitet og specifikke adfærdsmæssige responser14. Vi beskriver optogenetics som en metode til at undersøge den funktionelle konnektivitet af definerede neurale kredsløb i reguleringen af søvn/vågenhed stater. Ved at udnytte denne teknik, er store fremskridt opnået i forståelsen af neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater15,16,17,18,19 . I mange tilfælde introduceres opsynder specifikt i neuroner med særlige kemiske identiteter i selektive hjerneområder ved en kombination af CRE-driver-mus og CRE-inducerbar AAV-medieret genoverførsel. Yderligere, fokal ekspression af foto-følsomme opsynder såsom channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller archaerhodopsin (archt)21 kombineret med en CRE-Loxp eller FLP-FRT system giver os mulighed for at manipulere en selektiv neuronal population og specifikke neurale pathway22.
Vi beskriver her eksperimenter på GABAergic neuroner i BNST som et eksempel. For at udtrykke opsynder i en udpeget neuronal population, passende CRE driver mus og CRE-afhængige virus vektorer anvendes hyppigst. Transgene eller Knock-in linjer, hvor opsynder er udtrykt i særlige neuronal populationer er også nyttige. I de følgende eksperimenter, brugte vi GAD67-CRE Knock-in mus23 , hvor kun GABAergic neuroner Express CRE rekombinase med en C57BL/6j genetisk baggrund, og en AAV vektor, som indeholder ChR2 (hChR2 H134R) smeltet med eyfp eller eyfp som en kontrol med en "FLEx (flip-excision) switch"24. Proceduren beskriver specifikt optogenetisk excitation af GABAergic neuroner i BNST under overvågning af søvn/vågenhed stater25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter her blev godkendt af dyret eksperiment og brug komité af universitetet i Tsukuba, der opfylder NIH retningslinjer.
1. dyre kirurgi, virus indsprøjtning, elektrode til EEG/EMG og optisk fiber implantation
Forsigtig: Der bør vælges passende beskyttelses-og håndteringsteknikker baseret på biosikkerheds niveauet for den virus, som skal anvendes. AAV skal anvendes i et isoleret P1A klassificeret rum til injektion, og røret transporterer AAV skal steriliseres med en autoklave, når al volumenet er opbrugt. Operationsstedet og alle implanterede materialer skal være rene og sterile under brug.
Bemærk: Se figur 1.
- Desinficer det kirurgiske udstyr med autoklave.
- Bedøve mus med isofluran ved hjælp af en bedøvelse vaporizer. Observere, indtil musen har nået den ønskede dybde af anæstesi, bestemt af tab af respons til at klemme halen med pincet. Anvend oftalmisk salve til øjnene for at forhindre dem i at tørre.
- Desinficer det kirurgiske felt med jod-opløsning eller 70% EtOH (3x) og tør tilstrækkeligt. Lad virussen tø på isen, når operationen udføres. Dæk operationsområdet med absorberende laboratorie bænk papir.
- Fastgør musens hoved i det stereotaktiske apparat med ørepuder og en næse kniv. Efter at have bekræftet hovedet holdes stabilt, lave en mellemsagittal snit i hovedbunden for at sikre, at positionerne af bregma og lambda er placeret på samme niveau på en vandret linje.
- For at undgå en positionering hul, passende justere niveauerne af næse knibe og øre stænger op og ned. Bregma og lambda refererer til skæringspunktet mellem henholdsvis sutura saggitalis og sutura coronalis eller sutura lambdoidal (figur 2).
- Brug Serafin klemmer til at holde huden for at bevare adgangen til kraniet. Efter udsættelse af kraniet, Desinficer overfladen af kraniet med jod eller 5% H2O2, for at muliggøre kranie suturer, herunder bregma og lambda, der skal visualiseres tydeligere.
- Forbered AAV vektor injektion:
- Vask indersiden af en 10 mL sprøjte (Se tabel over materialer) sekventielt med 70% etoh, 100% EtOH, og steriliseret vand, 5 gange hver. Fastgør sprøjten i klemmen på en mikroindsprøjtnings pumpe arm, og sørg for, at alle opløsningen i sprøjten er afladet.
- Aspirer forsigtigt 2 μL mineralolie uden luftbobler, og Aspirer derefter det udpegede volumen af virus opløsningen. Efter aspiration, manipulere stempel knappen og bekræfte, at virus opløsning opstår på spidsen af nålen.
Bemærk: Injektionsvolumenet af virus opløsningen blev bestemt i pilotforsøg med samme musestamme og samme virus produkt. Forholdet mellem mængden af virus opløsning og omfanget af infektionsområdet bør estimeres på forhånd.
- Injicér AAV-vektor:
- Juster spidsen af mikroinjektionsnål på bregma og Bemærk koordinaterne som det oprindelige punkt. Flyt spidsen til det udpegede injektionssted (for BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolaterale ± 1,0 mm, dorsoventral-4,2 mm) og Placer spidsen af nålen på positionen. Sæt et mærke på kraniet og bore huller på ca. 2 mm i diameter ved hjælp af en tand boremaskine med en 0,7 mm hårdmetal fræser. Pas på ikke at beskadige Dura-eller hjernevæv.
- Efter at have fjernet blod fra omkring hullerne med en vatpind, langsomt flytte nålen ind i positionen af BNST. Injicer langsomt den udpegede mængde virus opløsning (0,07 μl/min) med en mekanisk mikroinjektor. Efter at have afsluttet injektionen, lad nålen i 5 min for at tillade opløsningen til tilstrækkeligt at infiltrere BNST væv. Tag forsigtigt nålen ud.
- Ved bilateral injektion gentages trin 1.8.1-1.8.2 på den anden side. Under hele proceduren, holde kraniet fugtig med anvendelser af sterile saltvand.
Bemærk: Vi brugte brugerdefinerede EEG/EMG implantater (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) med fire EEG-elektroder (4 mm), to EMG elektrode (2 mm, skær 4 mm elektroden til 2 mm med Nippers) og 6 elektroder (4,5 mm) (figur 2a).
- Lodde to rustfri stålledninger (Se tabel over materialer), hvorfra 1 mm af isoleringen er afskåret begge ender til EMG elektroder. Juster elektrodernes midte til bregma, og marker positionen for hver EEG-elektrode (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolaterale ± 1,0 mm), og bestem implantatets placering (figur 2b).
- Implantat optiske fibre:
- Fastgør en optik fiber ferrule til manipulatoren og drej manipulatoren armen, så den har en vinkel på ± 30 ° mod en horisontal linje (denne proces er kun nødvendig for at undgå interferens mellem elektroder og optiske fibre, såsom i tilfælde af BNST stimulation). Sæt fiber spidsen på bregma og Optag koordinaterne.
- Flyt spidsen til den målrettede indsættelses linje, og Markér positionen på kraniet. Sæt også ekstra mærker nær indsætnings stedet for anker skruerne. Bor kraniet på hvert sted med en tand boremaskine til at indsætte den optiske fiber og fastgør skruen. Fastgør skruen på kraniet. Vær omhyggelig med ikke at bryde Dura eller beskadige noget væv med skrue.
- Indsæt optisk fiber forsigtigt, indtil du når over BNST med en manipulator. Ferrule skal hvile på det resterende kranium (figur 1b).
- Anvende foto kurable dental cement (Se tabel over materialer) til at dække fiber og skruen. Reaktionstiden for at størkne limen skal specificeres i producentens manual (vores materiale skal udsættes for lys i mindst 10 s med specifik bølgelængde foto-generator. Det er unødvendigt at tørre limen efter dette).
- I dette trin skal du sørge for, at ingen materialer (skrue eller lim) optager monteringsplads til elektroderne. Desuden undgå at gøre nogen afbrydelse i cement til ferrule tilslutning til optisk fiber og kabel. Gentag trin 1.10.1-1.10.4 på den modsatte side for bilateral stimulation.
- Bore huller til EEG/EMG-elektroderne. Indsæt spidsen af elektroderne i hullerne. Hold implantatet og anvende cyanoacrylat klæbemiddel til rummet mellem kraniet og elektroderne. Indsæt igen med opmærksomhed ikke at blande sig med nogen materialer.
- Dæk omkredsen af elektroderne og optiske fibre med cyanoacrylatlim efterfulgt af anvendelse af cyanoacrylataccelerant på klæbemidlet. Dette trin undgår at forårsage nogen afbrydelse ved det ferrule-to-optik kabel og elektrode-til-bly wire tilslutnings zone (figur 1c).
Bemærk: Cyanoacrylat klæbemiddel og dets brændte er skadelige for muse øjet. Vær opmærksom på ikke at forårsage spild af disse kemiske stoffer. Også, være omhyggelig med ikke at kraftigt røre elektroderne og fibrene for at undgå uventede afvigelse umiddelbart efter klæbende størkning. - Udsætte musens nakke muskler og indsætte ledningerne til EMG elektroden under musklen. Juster længden af EMG-elektroden, så den lokaliserer lige under de nakke muskler. Let forbindelse mellem spidsen af elektroden og muskel fascia er nok til at fange EMG-signalet.
- Påfør cyanoacrylat klæbemiddel til at fylde implantaterne og størkne klæbemidlet med acceleration væske. Derefter sætte musen på en varmepude til nyttiggørelse, indtil den postural refleks vises. Justér varmepuden temperatur til dyrenes hvile kropstemperatur (36,0 °C i ZT 0-12 i tilfælde af C57BL6 mus; må ikke overstige 38,0 °C).
Bemærk: Et antibiotikum er ikke påkrævet for steril kirurgi. - Følg dine lokale institutionelle retningslinjer for post-operative analgesi. Opbevar musene i et hjem bur i en restitutionsperiode på mindst 7 dage.
2. EEG/EMG overvågning med foto-excitation af målrettede neuroner i specifikke dvaletilstande
Forsigtig: Denne protokol omfatter brug af klasse 3B laserudstyr eller LED-enheder. Eksperimentare skal være opmærksom på sikkerhedsoplysninger. Beskyttende øjen briller er påkrævet.
- Før du tilslutter laser kablet til den optiske fiber, justere laser intensitet med en scaler. Tether spidsen af laser kablet til en ubrugt optisk fiber med en ferrule og Bekræft, at der ikke er plads ved krydset mellem fiber og kablet.
- Tænd hovedafbryderen på laseren og vent 20 min for at varme op.
- Udsender laseren til intensitets kontrollen og justerer laser intensiteten til 10 mW/mm2. Skift laser tilstand til transistor logik og Bekræft, at lys impulser udsendes fra fiber kontrolleret af mønster regulator, som er indstillet til 10 MS for varighed, 40 MS for hvile, 20 gange for cyklus, og 20 gange Gentag (det vil, 20 Hz af 10 MS lys impulser til 20 s).
- Efter restitutionsperioden skal du flytte musene til det eksperimentelle kammer til optagelse af EEG/EMG. Hus mus ved en konstant 23 ° c med en 12 h lys/mørk cyklus med mad og vand til rådighed ad libitum.
- Tilslut den implanterede elektrode og kabel adapter, som er bundet til en glide ring for at undgå indfiltrning. Det anbefales at dække krydset med letuigennemtrængeligt materiale såsom aluminiumsfolie for at forhindre laser lækage. Hvis et bilateralt eksperiment er påkrævet, skal du bruge en glide ring med en bifurcate-fastgørelse til kablerne.
- I denne protokol vurderer vi ventetid til vågenhed fra NREM-søvn eller REM-søvn, så optagelsestiden bør begrænses i optimeret zeitgeber-tid (ZT0 defineres som det tidspunkt, hvor lyset er tændt). Denne protokol blev gennemført mellem ZT4-ZT10. Lad musene forblive frit i det eksperimentelle kammer i mindst 1 h som akklimatisering.
- I løbet af forsøgsperioden, Monitor EEG og EMG signaler i samme skærm og evaluere musens tilstand som vågenhed, NREM søvn eller REM søvn. Brug Gain-kontrolelementet for hver bølge for at gøre det lettere at skelne mellem de enkelte stater.
- Til måling af NREM-søvn til vågenhed ventetid, observere stabil NREM søvn for 40 s eller stabil REM søvn for 30 s, derefter tænde kontakten af mønstergeneratoren til foto stimulation (denne protokol genererer 20 Hz 10 MS lys impulser til 20 s). Bekræft laser emission til de implanterede optiske fibre.
- Optag EEG/EMG-signaler, indtil den sovende tilstand ændres til vågenhed. Hvis to eller flere eksperimentelle forsøg er nødvendige, begrænse optogenetisk manipulation til en gang om dagen, fordi photic er en kunstig intervention, som kan påvirke søvn/vågenhed arkitektur.
- Efter forsøget, dybt anæstetize og perfuse med sterile saltvand og PARAFORMALDEHYD (PFA) til prøvetagning af hele hjernen til immun Histokemisk analyse26.
3. analyse af latenstid fra NREM Sleep til vågenhed
- Efter optagelse EEG/EMG signaler, overføre signal data til en computer for at score søvn/vågenhed stater. Denne protokol beskriver metoden til EEG-analyse med optagelses software (Se tabel over materialer).
- Start programmet Sleep Sign, og klik på fanen filer , og vælg Åbn for at vælge de optagede data (. kcd-fil). Klik på fanen dvale for at vælge Epoch tid til justering af tidsvinduet for hver epoke (vi bruger 1 epoke/4 sek.).
- Manuelt score søvn/vågenhed stater baseret på EEG/EMG signaler, i henhold til følgende kriterier: vågenhed, høj EMG og lav EEG spænding med høj frekvens; NREM, lav EMG-tone og høj EEG-spænding med høj δ (0,5-4 Hz) frekvens; og rem, EMG indikerer muskel atoni og lav EEG spænding med høj ε (6-9 Hz) frekvens. En stat, der ikke fortløbende fortsætter for 16 s (dvs. 4 epoker), er ikke defineret som en tilstandsændring, fordi den ikke er en stabil tilstand.
- Klik og hold venstre museknap på den første epoke og træk markøren, indtil den specifikke tendens på mere end 16 s (4 epochs) er afsluttet. Slip derefter venstre museknap, og vælg den relevante tilstand (vågenhed eller NREM Sleep eller REM Sleep) i pop-up-vinduet. Gentag denne procedure for at score alle EEG/EMG-signaler, som er optaget i filen.
- Find det nøjagtige tidspunkt for stimulering i epoken, hvor EEG viser NREM eller REM-søvn, og epoken viser Tilstandsovergang efter stimulerings punktet. Tæl antallet af epoker mellem perioderne lige efter stimulation og lige før State Transition.
- Multiplicér derefter optalt antal epoker med 4 s (A). I epoken af stimulation, tage et skærmbillede og måle bredden mellem stimulerings punktet og slutningen af epoken. Dividerer derefter den målte længde med hele Epoch-længden og multipliceres med 4 s (B). Tilsvarende beregne varigheden af NREM søvn i epoken af staten ændring, hvilket betyder, at tiden mellem starten af epoken og staten ændre punkt (C).
- Sum A, B og C for at få Latensen fra NREM Sleep til vågenhed. Den samme procedure anvendes til analyse af Tilstandsovergang fra REM-søvn til vågenhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nuværende undersøgelse viste effekten af optogenetisk excitation af GABABnst neuroner på søvntilstand overgang. ChR2-EYFP blev foisk udtrykt i GABA neuroner i BNST. En in situ hybridiseringhistokemisk undersøgelse viste, at ChR2-EYFP var colokaliseret i neuroner, der udtrykker GAD 67 mRNA-signaler, hvilket indikerer, at disse er Gabaerge neuroner. Immunohistokemiske skive prøver bekræftede positionen af den optiske fiber, hvis spids var lige over BNST25.
Figur 3a viser repræsentative EEG/EMG-spor før og efter foto stimulation under NREM-søvn. Højspænding og langsom frekvens EEG uden EMG-signaler repræsenterer NREM-søvn. Foto stimulation (10 MS pulser ved 20 Hz i 20 sek.) blev anvendt efter stabil NREM-søvn. Stimulation udløser akut overgang til vågenhed (lav spænding og højfrekvens EEG med aktive EMG-signaler) omkring 2 s efter stimulation i ChR2-udtrykker mus. Control MICE (EYFP) viste ikke overgang efter stimulation (ventetid for at vågne fra NREM: EYFP, 295,39 ± 106,61 sek, n = 6; ChR2:2,71 ± 0,59 sek, n = 6; t10 = 2,35, s < 0,05; Figur 3b, øvre). Disse data tyder på, at excitation af GABABnst neuroner under NREM søvn udløser hurtig induktion af vågenhed. På den anden side havde foto stimulation under REM-søvn ingen effekt (EYFP: 36,45 ± 13,08 sek, n = 6; ChR2:37,29 ± 15,19 sek, n = 6; t10 = 0,04, p = 0,484; Figur 3b, nederst) så en overgangseffekt dukkede kun op i NREM Sleep.
Figur 1 : Procedure til injektion af AAV, implantat optiske fibre og EEG/EMG-implantater. A) eksperimentel procedure for virus indsprøjtning. EYFP-fbrugt ChR2 eller EYFP (til kontrol) gen inkorporeret i AAV-vektor, hvis transskription aktiveres af CRE rekombinase, blev bilateralt injiceret i BNST. (B) optiske fibre blev indsat mod bnst i en 30 ° vinkel til vandret for at forhindre kollision med elektroden. Der blev indsat to skruer omkring den. (C) EEG/EMG-optagelses anordning blev implanteret efter sikker placering af optiske fibre. D) ved afslutningen af operationen skal hele operationsområdet dækkes med cyanoacrylatlim og fastgøres kraftigt. Sørg for ikke at anvende nogen agent til den region, som forbinder elektroden og ferrules. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Brugerdefinerede EEG/EMG elektrode og elektrode stifter indsættelse sites. (A) Top: ud af 6 elektrode stifter skæres de eksterne to stifter ned til 2 mm. bund: EEG/EMG elektroder. (B) disse elektroder og EMG ledning ledninger er derefter loddede. Tilslutnings zonen skal isoleres med enhver isolering som cyanoacrylatlim. Indsættelse steder af elektroder er i forhold til bregma (anteroposterior ± 1.5 mm, mediolaterale ± 1,0 mm). EMG ledninger er indsat under nakkemusklen med fjernelse af isolering beskytter ledningen på indsætnings stedet (1 mm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Effekten af GABAbnst stimulering af stats overgangen i NREM-søvn og REM-søvn. A) repræsentative EEG-og EMG-bølge-og EEG-effekt spektrum. Foto stimulation (10 MS pulser ved 20 Hz for 20 sek) blev anvendt til ChR2-udtrykker GABABnst neuroner efter 40 s NREM søvn. Vågenhed blev hurtigt induceret efter en 2 s. EEG viste lav spænding og høj frekvens med EMG sprængning. EEG Power spektrogram viste også overgangen fra lav til høj frekvens. (B) optogenetisk excitation af GABAbnst neuroner viste hurtig overgang fra NREM søvn til vågenhed (øvre), men denne effekt blev ikke set i tilfælde af at anvende den samme manipulation i REM-søvn (bund). *p < 0,05, welchs t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi her præsenterede en metode til at evaluere effekten af optogenetisk stimulering af neuroner med særlige kemiske identiteter på tilstandsovergange af søvn/vågenhed og gav et eksempel på manipulation af GABABnst neuroner. Vores data viste, at optogenetisk excitation af GABABnst neuroner resulterer i umiddelbar overgang fra NREM søvn til vågenhed.
Forskellige eksperimentelle designs er tilgængelige på grund af udviklingen af talrige typer af optogenetiske værktøjer. Det er muligt at aktivere eller hæmme neuronal aktivitet af bestemte neuroner ved hjælp af forskellige former for opsiner, såsom ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, og iChloC27. ChR2 kan aktivere neuroner et par millisekunder efter foto-stimulation og dette kan bruges til at fremkalde action potentialer i en fase-Lock måde af en pulsgenerator til at undersøge den akutte virkning i specifikke søvnstadier. En stabilt aktivering af opsin såsom stabil Step funktion opsin (SSFO), som inducerer depolarisering af neuroner i 15 til 30 min efter stimulation, kan også være nyttigt for nogle former for eksperimenter designet til at observere en semi-kronisk effekt28. Depolariserede celler med SSFO kan blive mere følsomme over for forskellige fysiologiske neuronal input og deaktiveres ved at anvende lang bølgelængde lys. Desuden kan vi aktivere axoner ved implantation af optiske fibre på stedet af en axonal projektion. Fiber stimulation kunne give oplysninger om funktionen af en bestemt axonal projektion pathway.
EEG/EMG optagelse under optogenetisk manipulation er en mindre invasiv metode til at bestemme de direkte konsekvenser af selektiv excitation/hæmning af neurale kredsløb på søvn/vågenhed stater i mus. Med denne metode, mange neuronal populationer og neurale kredsløb har vist sig at være involveret i reguleringen af søvn/vågenhed stater. Mod yderligere udvikling af denne teknik, er det muligt at implantere flere fibre til at manipulere flere veje samtidig, eller dette kunne også anvendes i kombination med fiber fotometory eller miniscopes til at overvåge neuronal aktiviteter.
Afslutningsvis, det forventes, at optogenetics vil fremskynde fremskridt i frigøre mysteriet om søvn regulering af hjernen og udviklingen af innovative terapier for refraktær søvnløshed og andre søvnforstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette projekt blev delvis støttet finansielt af Merck & Co.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Merck investigator Studies program (#54843), en KAKENHI-støtte til videnskabelig forskning i innovative områder, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.), og en KAKENHI-støtte til sonderende forskning i innovative områder (T.S.) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A.
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E.
- LeDoux, J. E.
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y.
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
