Summary
Здесь мы представляем методологий для оценки целостности мембраны spermatozoan, сотовой функция, связанный с спермы оплодотворение компетенции. Мы опишем три методики для оценки Флуориметрическое мембран сперматозоидов: одновременное окрашивание с конкретными флуоресцентных зондов, флуоресцентной микроскопии и передовые спермы посвященный проточной цитометрии. Также представлены примеры объединения методологии.
Abstract
Стандартный спермиограммы, описывающих качество спермы главным образом основаны на физиологические и визуальных параметров, таких как объем эякулята и концентрации, подвижности и прямолинейное и морфология спермы и жизнеспособность. Однако ни один из этих оценок является достаточно хорошим предсказать качество спермы. Учитывая, что поддержание жизнеспособности сперматозоидов и оплодотворение потенциал зависит от целостности мембраны и внутриклеточных функциональность, оценки этих параметров может позволить лучше прогноза спермы оплодотворение компетенции. Здесь мы опишем три возможные методы для оценки качества спермы с помощью конкретных флуоресцентных зондов, в сочетании с флуоресцентной микроскопии или потока цитометрии анализы. Анализ начисленных плазматической мембраны целостности с помощью 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и пропидий йодидом (PI), методу мембраны целостности с помощью флуоресцеин конъюгированных Изотиоцианаты Pisum sativum агглютининов (FITC-PSA) и Митохондриальные мембраны целостность с помощью 5, 5', 6, 6'-тетра хлоро-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl карбоцианиновыми йодид (JC-1). Также представлены комбинации этих методов. Например использование annexin V в сочетании с PI флуорохромов позволяет оценки апоптоза и расчета доли apoptotic спермы (apoptotic индекс). Мы считаем, что эти методологии, основанные на изучении мембран сперматозоидов, очень полезны для оценки качества спермы.
Introduction
Целостности и функциональности мембран сперматозоидов являются некоторые из факторов, свидетельствующих о спермы жизнеспособность и потенциал оплодотворение. Плазматической мембраны действует как барьер между внутриклеточные и внеклеточной отсеков, тем самым сохраняя сотовой осмотического равновесия1. Любой стресс, который вызывает повреждение целостности плазматической мембраны может ухудшить гомеостаза, уменьшить жизнеспособность и оплодотворение потенциала и повышения клеточной смерти. Например криоконсервация уменьшает жизнеспособность спермы из-за повреждения его плазматической мембраны, в результате изменений температуры и осмотического стресса2. Ранее мы сообщали, что разоблачение Сперма быков в низких концентрациях пищевых загрязнителей, таких как пестицида Атразин, его основной метаболит diaminochlorotriazine или микотоксинов афлатоксин B1, уменьшает спермы жизнеспособность1,3 . Это было обусловлено маркировки double-stranded дна с DAPI в сочетании с PI, который связывается с ДНК клеток с поврежденной плазматической мембраны.
Акросома реакции (AR) включает в себя слияние внешних Акросома мембраны и вышележащих плазматической мембраны, приводит в выпуске методу ферменты4,5. Это основные события-вителлинового проникновения и дальнейшее слияние спермы с ооцитов6. Таким образом оценки целостности методу мембраны является полезным параметром для оценки качества спермы и мужской фертильности7,8,9. Некоторые люминесцентные методы подходят для проверки целостности Акросома, FITC-PNA или FITC-PSA8,10. В наших предыдущих исследований, используя шаблоны FITC-PSA пятная1,3мы представили точные определения для (i) нетронутыми Акросома, (ii) поврежден Акросома мембраны и (iii) отреагировали Акросома. В настоящем докладе мы оцениваем статус Акросома сперматозоидов посвященный проточной цитометрии и сравнить результаты для тех, кто с помощью микроскопии флуоресцирования.
Митохондрии являются многофункциональный органеллы связанных, среди прочего, СПС синтеза, реактивнооксигенных видов производства, кальция сигнализации и апоптоз. Физиологических расстройств, включая мужского и женского бесплодия, связаны с измененной митохондриальной функции11. Митохондрии спермы расположены в midpiece и играть решающую роль в подвижности спермы12. Также принято что высокий митохондриальной мембранного потенциала (ΔΨm) связан с нормальной моторики и высокой оплодотворение потенциала13. Напротив низкая ΔΨm ассоциируется с повышенным уровнем реактивнооксигенных видов и снижение оплодотворение ставка14. Тем не менее различные экологические соединений, например эндокринные расстройства, могут побудить клеточного стресса и привести к преходящее повышение в ΔΨm, гиперполяризации1,3, рост производства, из свободных радикалов и в конечном итоге, апоптоз15. Флуоресцентный зонд 5, 5', 6, 6'-тетра хлоро-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl карбоцианиновыми йодид (JC-1) позволяет, например, изучение последствий пищевого токсинов на сперму ΔΨm1,3.
Стандартный спермиограммы, основанные на физиологических и морфологических параметров, не являются достаточно хорошими для того предсказать качество спермы. Для обеспечения качества спермы требуются более точные методы. Здесь, мы предлагаем две возможные методы для определения качества спермы, основанные на оценках мембран сперматозоидов: одновременное четырехместные окрашивание с конкретными флуоресцентных зондов и микроскопии флуоресцирования, описанные в наших исследованиях1,3 и передовые спермы посвященный проточной цитометрии, недавно использовались в нашей лаборатории и уже используется другими16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с 1994 года израильские руководящие принципы защиты животных. Говядину спермы было поставлено коммерческих израильской компании для искусственного осеменения и разведения. Эякуляции 11 быков были оценены в этом исследовании.
1. спермы пробоподготовки
Примечание: Процедура основана на лабораторных рот протокол1,3.
- Получите примерно 1 – 6 мл спермы быков в 15 мл при комнатной температуре.
- Для каждого 1 мл спермы добавить 6 мл подогретую (при 37 ° C) NKM буфера (110 мм NaCl, 5 мм KCl, MOPS 20 мм [propanesulfonic 3-N-morphilino кислоты; рН 7,4]) и центрифуги 8 мин на 600 x g, 1 – 2 раза до супернатант чистыми.
Примечание: Если концентрация сперматозоидов или начальный объем очень высоки, разделить на две трубы на первой стирки. - Немедленно удалить и отбросить ясно супернатант и оставить супернатант выше гранулы примерно 1 см.
- Тщательно худой трубы под углом в 30° для увеличения площади поверхности для спермы, чтобы плавать вверх и подождите 20 – 30 мин, чтобы позволить сперматозоидов плавать вверх на 37 ° C.
Примечание: Можно увидеть мутность. - С помощью микропипеткой тщательно, удалите верхний 1 мл супернатанта, содержащий количество подвижных сперматозоидов к новой пробке 1,5 мл.
- Держите спермы при 37 ° C до использования.
- Оцените количество сперматозоидов с помощью Нойбауэр Горяева.
Примечание: Вместо него может использоваться различные Счетной палаты, но подсчета отличается.- Чтобы предотвратить движение сперматозоидов, разбавляют 100 мкл подвижных сперматозоидов с 10 мл двойной дистиллированной воды (DDW) (1: 100 разрежения) в 15 мл тюбик и осторожно перемешать.
- Загрузка 10 мкл пример в каждой стороне Горяева и coverslip. Убедитесь в том избежать образования пузырь внутри камеры, поскольку это может привести к неточной сперматозоидов.
- Наблюдать под микроскопом соединение с 20 X цели.
Примечание: Полная сетка на Горяева содержит 9 больших квадратов, каждый 1 мм2, и coverglass лежит 0,1 мм над уровнем пола камеры. Таким образом объем над Центральной счетной области составляет 0,1 мм3 или 0.1 мкл. Центральная площадь Горяева содержит 25 средних квадратов и каждый средний квадрат имеет 16 меньших квадратов с одной линии. - Подсчитать общее количество клеток в 4 квадратов средний угол и Центральной площади. Для высокой точности граф двух палат (обе стороны Горяева Нойбауэр) и использовать средний показатель для расчета концентрации клеток.
- Рассчитайте количество сперматозоидов, умножив среднее число путем 5 (чтобы получить количество ячеек на подсчет район), 10 000 (чтобы получить количество клеток в 1 мл разбавленной пробы). Затем умножьте полученный граф на коэффициент разбавления (1: 100).
Примечание: Например, среднее количество спермы, учтенные в 5 25 средних квадратов в районе Центральный счетных палат-150 ([152 + 148] / 2). Таким образом среднее количество сперматозоидов на камеру (или на 0.1 мкл) — 150 x 5 = 750. Умножьте 750 на 10000, чтобы получить количество клеток в 1 мл разбавленной пробы (7500000) и умножьте на 100 (коэффициент разрежения) для получения 75 x 107 клеток / мл оригинального образца спермы.
2. метод #1: Одновременной оценки мембран сперматозоидов, с использованием нескольких флуоресцентных зондов
Примечание: Мембран сперматозоидов (плазма, методу и митохондриальных) были оценены как описано Celeghini et al.10, с некоторыми изменениями. Была использована Epifluorescent микроскопии, в сочетании с цифровой камеры с возбуждением в 450-490 Нм и выбросов на 515-565 Нм, используя фильтр тройной.
-
Подготовка запасов решений.
- Подготовьте DAPI Стоковый раствор 0,1 мг/мл, растворяя 5 мг DAPI в 50 мл-фосфатный буфер (PBS). Подготовка 50 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C. Перед использованием разбавьте раствор с PBS в 1:10 (рабочий раствор; 10 мкг/мл).
- Подготовьте FITC – PSA Стоковый раствор 1 мг/мл, растворяя 1 мг в 1 мл PBS FITC-СРП. Подготовка 50 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C. Перед использованием разбавьте раствор с PBS в 1:10 (рабочий раствор; 100 мкг/мл).
- Подготовьте раствор 1 мг/мл JC-1, растворяя 1 мг в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) JC-1. Подготовка 10 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C. Перед использованием разбавьте раствор с ДМСО в 1:10 (рабочий раствор; 0,1 мг/мл).
- Подготовьте раствор Пи, растворяя 10 мг PI в 400 мкл PBS (давая 2,5 мг/мл). Хранить при + 4 ° C. Разбавьте 1 шток с PBS в 1:20 (рабочий раствор; 0,125 мг/мл). Хранить при температуре + 4 ° C как Стоковый раствор.
Предупреждение: PI является потенциальным мутагены и должны быть обработаны с осторожностью. Краситель должны утилизироваться в соответствии с местными нормами и безопасно.
- Передать новые 1,5 мл (25 x 106 сперматозоидов/мл) 133 мкл, количество подвижных сперматозоидов (шаг 1.5).
Примечание: Если образец концентрация выше, развести его в буфере NKM для достижения требуемой концентрации; Если концентрация образца кромки образца ниже, центрифуга полученные надосадке после плавания вверх на 1000 x g 5 мин, удалить супернатант 0,5 мл и количество спермы снова. - 17 мкл DAPI (рабочий раствор) и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C.
- Центрифуга на 1000 x g 5 минут и удалить супернатант.
- Пелле 100 мкл NKM буфера.
- Добавьте 50 мкл FITC – PSA, 2 мкл JC-1 и 3 мкл PI (рабочие решения) и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C.
- Центрифуга на 1000 x g 5 минут и удалить супернатант.
- Пелле 40 мкл буфера NKM и Ресуспензируйте, закупорить.
- Передача 10 мкл пример стеклянное скольжение, мазок и coverslip.
-
Визуализировать немедленно с помощью эпифлуоресцентного (40 x цель использования) с тройной фильтр, оснащенный цифровой камерой и захватить изображение отдельно для каждого фильтра.
Примечание: Существует никакого значения порядку фильтры визуализирована.- Визуализировать под DAPI канал с возбуждением 358 Нм и выбросов на 461 Нм.
- Визуализируйте под FITC канал для зеленых мономеров с возбуждением в 450-490 Нм и выбросов на 515-565 Нм.
- Визуализировать под PI канал для красных агрегатов с возбуждением 488 нм и выбросов на 590 нм.
- Визуализировать под JC-1 красный агрегатов с возбуждением в 559 Нм и выбросов в диапазоне 574-627 Нм; JC-1 зеленый мономеров с возбуждением в 488 нм и выбросов в диапазоне от 500 – 535 Нм.
- Объединение трех изображений, полученных из фильтров в формате JPG/JPEG, с помощью параметра «слияние» камеры программного обеспечения.
- Открыть изображение, Объединенные с помощью инструмента «Краска» и используйте параметр кисти для обозначения подсчитанных сперматозоидов.
-
Классифицировать сперматозоидов, основанные на флуоресценции, излучаемый каждой зонд:
- В целом оценки по крайней мере 200 сперматозоидов на слайде — все клетки появляются синие (DAPI).
- Оценки жизнеспособности путем подсчета мертвые клетки, которые появляются фиолетовые (PI [красный] + [синий] DAPI) и рассчитать процент мертвых клеток (мертвые клетки/всего подсчет клеток x 100).
- Оцените состояние Акросома с помощью шаблонов флуоресцентной окраски (FITC – PSA). Расчет процентных долей различных шаблонов (нетронутыми, повреждены или отреагировал Акросома клеток/всего подсчет клеток x 100).
Примечание: Поврежденные мембраны акросомной появляется как полностью окрашенные, зеленый Акросома капитализации; отреагировал методу мембраны показывает остаточного зеленый экваториальных или верхней окрашивание; ячейки, содержащие нетронутыми методу мембраны не представят любые зеленые пятнать методу региона. - Оцените ΔΨm путем разграничения сперматозоидов с высоким ΔΨm, которые exhibit midpiece красный окрашенных и сперматозоиды с низкой ΔΨm, которые exhibit Грин окрашенных midpiece. Граф красный и зеленый midpieces отдельно и вычислить их соотношение (красный/зеленый).
3. техника #2: Оценка мембран сперматозоидов с готовым наборы и проточной цитометрии
Примечание: Оценки целостности плазматической мембраны, Митохондриальные мембраны потенциал и методу мембраны целостность была выполнена с готовых к использованию потока цитометрии комплекты, содержащие лиофилизированные флуорохромов в каждой скважине. Процедура была выполнена по словам производителей с некоторыми изменениями.
-
Оценки целостности плазматической мембраны
- Возьмите нужное количество скважин из пакета жизнеспособность и концентрации Kit (PI и SYbr14), их передачи рабочей базы и крышка с гибкой крышкой (защищает от света).
- 199 мкл буфферезированный раствор для цитометрии в колодец.
- 1 мкл однородных спермы на 57 х 106/мл (57 000 ячеек на хорошо) и гомогенизации, закупорить.
- Крышка с черной крышкой.
- Проинкубируйте втечение 10 мин при 37 ° C, защищать от света.
- Запуск образца через проточный цитометр с параметра «жизнеспособность».
-
Митохондриальные мембраны потенциал
- Возьмите нужное количество скважин из пакета митохондриальной деятельности комплект (JC-1), их передачи рабочей базы и крышка с гибкой крышкой (защищает от света).
- 10 мкл абсолютного этанола в колодец и Пипетка ресуспензируйте порошок настоящее в колодец.
- 190 мкл PBS в колодец и гомогенизации, закупорить.
- 0,75 мкл однородных спермы на 57 х 106/мл (50 000 ячеек на хорошо) и гомогенизации, закупорить.
- Крышка с черной крышкой.
- Инкубируйте 30 минут при 37 ° C, защищать от света.
- Запуск образца через проточный цитометр с деятельностью ʽmitochondrial параметр '.
-
Целостность методу мембраны
Примечание: FITC – PSA пятная (см. метод #1) дает возможность оценки 3 категории Акросома (нетронутыми Акросома, отреагировал Акросома и поврежденных Акросома). С помощью проточный цитометр и жизнеспособности и целостности комплекта Акросома (PI и FITC-PNA), сперматозоиды разделяются на эти 3 категории.- Возьмите нужное количество скважин из пакета жизнеспособность и Акросома целостности комплект, передать их рабочей базы и крышка с гибкой крышкой (защищает от света).
- 200 мкл буфферезированный раствор для цитометрии в колодец.
- 0,7 мкл однородных спермы на 57 х 106/мл (40 000 ячеек на хорошо) и гомогенизации, закупорить.
- Крышка с черной крышкой.
- Инкубируйте 45 минут при 37 ° C, защищать от света.
- Запуск образца через проточный цитометр с ʽInCyte параметр '.
- Анализировать полученные гистограммы стробирования три маркер области по интенсивности флуоресценции, представляющих незначительный, низкий флуоресцирующих клетки с неповрежденными, безупречная Акросома (R1), низкий флуоресцирующих клетки с остаточной окрашенных частью Акросома (R2) и весьма флюоресцирующей клетки с нарушается Акросома (R3).
Примечание: Используйте раздел «анализ файлов, приобретенных с помощью других модулей» в руководстве пользователя инструмент для создания трех регионов (R1, R2, R3).
4. техника #3: Оценка мембран сперматозоидов, с использованием флуоресцентных зондов и проточной цитометрии
Примечание: Использование annexin V в сочетании с PI флуорохромов позволяет оценки апоптоза и расчета доли apoptotic спермы (apoptotic индекс).
- Подготовка 1 x annexin V привязки буфера от 20 x Стоковый раствор (разбавить 500 мкл annexin V привязки буфера 20 x Стоковый раствор с 9,5 мл стерильной дистиллированной воды).
- Оцените с помощью Горяева Нойбауэр, как описано в разделе 1.7 сперматозоидов.
- Вымойте 106 сперматозоидов в 1 мл раствора 1 x annexin V привязки буфер и центрифуги на 300 x g за 10 мин.
- Полностью удалить супернатант.
- Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл 1 x annexin V привязки буфера.
- 10 мкл annexin V, конъюгированных с FITC.
- Хорошо перемешайте и Инкубируйте 15 мин в темноте при комнатной температуре.
- Вымойте сперматозоидов, добавив 1 мл 1 x annexin V привязки буфера за 106 клеток и центрифуги на 300 x g за 10 мин.
- Полностью удалить супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл 1 x annexin V привязки буфера за 106 клеток всего.
- Добавьте 1 мкг/мл PI непосредственно перед анализом с проточный цитометр.
- Запуск образца через проточный цитометр на ʽInCyte'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает оценки одновременного Флуориметрическое мембран сперматозоидов (плазма, методу и митохондриальных) с использованием PI, DAPI, FITC-PSA и JC-1. Оценка мембран сперматозоидов с помощью одновременных окрашивание с четырьмя флуоресцентных зондов позволяет, например, оценки доли спермы в каждой категории — жить против мертвых; высокий и низкий ΔΨm; нетронутыми против. повреждены Акросома — одновременно для каждого сперматозоида.
На рисунке 2 представлены результаты спермы мембраны оценки с использованием Флуориметрическое зонды. В эксперименте использовались только Семен, содержащий по меньшей мере 80% подвижных сперматозоидов. По крайней мере 200 клеток были рассмотрены на быка. Это была возможность оценить различия в качестве образца спермы с точки зрения целостности мембраны. К примеру, эякулята быка № 7 был сравнительно низкий процент от мертвых клеток, низкая доля спермы с псевдо отреагировали Акросома и выше митохондриальной мембраны, потенциал, по сравнению с эякулята быка № 1.
Рисунок 3 показывает репрезентативных выборок, оцениваются для жизнеспособности (рис. 3A–3 C) и митохондриальной активности (рис. 3D–3F). Интенсивностью флюоресценции образцов были оценены выделенный микрокапиллярной спермы проточный цитометр, с специализированного программного обеспечения. Этот проточный цитометр содержит один твердофазный синий лазер (448 Нм) и два фотодиодов: вперед разброс и разброс стороне. Это специально меры свойства выбросов спермы с тремя трубками фотоэлектронный умножитель (зеленый: 525/30 Нм, желтый: 583/26 Нм; красный: 655/50 Нм) и вмещает оптические фильтры и splitters16. Это дает возможность оценки 5000 сперматозоидов на анализ.
Комплект для оценки жизнеспособности содержит зонд с дифференциальной проницаемость жизнеспособным (нетронутыми плазматической мембраны) и мертвых (повреждения плазматической мембраны) сперматозоидов (рис. 3 c). Сперма ΔΨm была оценена с помощью комплект, который различает поляризованных митохондриальной мембраны (флуоресценции в оранжевый) и деполяризованный митохондриальной мембраны (флуоресценции в зеленый) (Рисунок 3F).
Рисунок 4 представляет оценку Акросома целостности выполняется с помощью готовых к использованию комплекта, читать с проточной цитометрии (цифры 4A–4 C), разделив результирующая гистограммы закрытом сперматозоидов на три маркер области, представляющих незначительным флуоресцирующих низким клетки с неповрежденными, безупречная Акросома (R1), низкий флуоресцирующих клетки с остаточной окрашенных частью Акросома (R2), и высоко флуоресцирующих клетки с нарушается Акросома (R3).
Таблица 1 представляет сравнение двух методов Флуориметрическое для оценки мембран сперматозоидов. Же образцов спермы из трех различных Быки были оценены для жизнеспособности, митохондриальных мембранного потенциала (ΔΨm) и Акросома целостности с помощью одновременных четырехместные окрашивания, а также проточной цитометрии. Это сравнение очень важно, как он показывает результаты сопоставления, с помощью каждого из двух методов. Данные были проанализированы анализ и t критерия Стьюдента. Статистически значимой разницы не наблюдались.
Рисунок 5 показывает репрезентативной выборки, оценки апоптоза, используя annexin V (AV) и флуорохромов пропидий йодидом (PI). Использование этих двух зондов позволяет различать четыре модели, указывающее жизнеспособных клеток (AV-, PI-), ранних apoptotic клетки (AV +, PI-), apoptotic клетки (AV +, PI +) и отмершие клетки (AV-, PI +).
Рисунок 1: Микрофотография эпифлуоресцентного сперматозоидов окрашенных одновременно с несколькими флуоресцентных зондов. (A) одновременное окрашивание с четырьмя датчиками, PI, DAPI, FITC-PSA и JC-1) (B) живых сперматозоидов с DAPI окрашивания ядра и высокой митохондриальной мембранного потенциала (ΔΨm), окрашенных с зонд JC-1. Dead сперматозоидов (C) с поврежденной плазматической мембраны окрашенных Пи зонд, повреждены Акросома витражи с зонда FITC-PSA и низким ΔΨm. (D) Live, отреагировали Акросома сперматозоидов с остаточной экваториальных окрашивание и низким ΔΨm. (E) Live, отреагировали Акросома сперматозоидов с остаточной верхняя окрашивание и высокой ΔΨm. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Оценка мембран сперматозоидов быка с помощью зондов Флуориметрическое. (A) спермы жизнеспособность определяли с флуоресцентных зондов 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и пропидий йодидом (PI). (B) Акросома статус был определен согласно FITC-PSA пятная шаблонов. Представлены доли с отреагировал Акросома сперматозоидов. (C) митохондриальной мембранного потенциала (ΔΨm) была проведена оценка использования с флуоресцентный зонд JC-1 и представлены как соотношение между средней доли Красного Витражи (высокий потенциал) и зеленый окрашенных спермы (низкий потенциал). Данные представлены в виде % клеток из всего вычисления ячейки. По крайней мере 200 сперматозоидов были проанализированы на быка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: жизнеспособности (A-C) и оценку флуоресценции митохондриальной активности (D-F) репрезентативных выборок измеряется EasyCyte проточный цитометр. Гистограммы представляют ungated сперматозоидов и мусора (A, D), закрытого сперматозоидов (B, E), распределение сперматозоидов жизнеспособным (зеленый) и мертвых (красный) клетки (C) и распределение сперматозоидов поляризованные (желтый) и деполяризованный) зеленый) митохондриальной мембраны (F). Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: флуоресценции оценки целостности Акросома репрезентативных выборок измеряется EasyCyte проточный цитометр. (A) гистограммы ungated сперматозоидов и мусора. (B, C) Гистограммы закрытом сперматозоидов с оценкой Акросома целостности выполняется с набором готовых к использованию, читать с адаптированы параметр «InCyte», разделив в результате гистограмму закрытого сперматозоидов на три области маркер, представляющий незначительным, низкий флуоресцирующих клетки с неповрежденными, безупречная Акросома (R1), низкий флуоресцирующих клетки с остаточной окрашенных часть Акросома (R2) и весьма флюоресцирующей клетки с нарушается Акросома (R3). Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Среднее количество клеток | Vialbility | Митохондриальные мембраны потенциал | Акросома целостность | ||||||
| Жизнеспособные | Мертвых | Деполяризованный | Поляризованные | Красный/зеленый соотношение | Нетронутыми Акросома | Отреагировал Акросома | Нарушена Акросома | ||
| Четырехместный пятнать | 253 | 32.7 ± 1.53% | 67.3 ± 1.53% | 65.7 ± 2,25% | 34.3 ± 2,52% | 0.5 ± 0,06 | 37.3 ± 7,2% | 38.0 ± 5,7% | 24,3 ± 3,0% |
| Cytomtery поток | 5000 | 32,3% ± 2.08 | 67.7 ± 2.08% | 65.0 ± 1.00% | 35.0 ± 1.00% | 0.5 ± 0,02 | 39,5 ± 5,7% | 39,5 ± 6,5% | 21,0 ± 8,0% |
Таблица 1: сравнение двух методов Флуориметрическое для оценки мембран сперматозоидов. Же образцов спермы были оценены для жизнеспособности, митохондриальных мембранного потенциала и Акросома целостности с помощью одновременных четырехместные окрашивание и проточной цитометрии. Данные представлены как означает долю ± SD исследуемых клеток, рассчитанные для 3 реплицирует.
Рисунок 5: Annexin V и PI флуоресценции репрезентативной выборки измеряется проточный цитометр. Гистограммы представляют (A) ungated сперматозоидов и мусора и (B) распределение закрытом сперматозоидов в начале apoptotic (AV +, PI-), apoptotic (AV +, PI +), жизнеспособным (AV-, PI-) и некротические (AV-, PI +) клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Спермы оплодотворение потенциал зависит от нескольких факторов, отражающих его качество. Высокая концентрация сперматозоидов и высокая доля весьма подвижных сперматозоидов может считаться высокого качества спермы. Тем не менее, такая оценка не принимать во внимание другие сотовые и функциональных параметров. Использование «стендовые» микрокапиллярной проточный цитометр может быть легко адаптирована для оценки различных структур спермы с использованием флуоресцентных зондов, как показано ранее другими17 и продемонстрировали здесь (техника #3). Например, крайне важное значение для возникновения успешного оплодотворения естественной целостности Акросома сперматозоидов и таким образом, гарантируется точной оценки по методу статуса. Такая оценка может осуществляться легко классификации Акросома статуса с помощью шаблонов люминесцентные окрашивание (FITC-PSA, FITC-PNA, то есть, метод #1, как описывалось ранее)1,3. В частности, очень важно определить долю спермы с нетронутыми Акросома (то есть, экспонаты неокрашенных Акросома) по сравнению с поврежденной Акросома. В отношении последнего, сперматозоиды с поврежденной Акросома могут exhibit (i) полностью окрашенные методу колпачок, который означает, что повреждена мембрана, позволяя краситель течь через мембрану в Акросома везикул; (ii) отреагировали Акросома сперматозоидов, что выставлять только остаточного Акросома содержание, указав, что AR уже произошло (т.е. псевдо AR). Следует отметить, что такой оценки могут быть также выполнены с посвященный проточный цитометр.
Комплект готовых к использованию жизнеспособность и Акросома целостности определяет как жизнеспособность спермы (жизнеспособной или мертвых) и акросомной целостности (нетронутыми или нарушается). Здесь, мы предлагаем использовать выделенный проточный цитометр для определения трех вышеупомянутых методу статусов (то есть, нетронутыми, повреждены, отреагировали). Мы адаптировали микрокапиллярной потока цитометр платформы для более точной оценки, который идентифицирует отреагировали Акросома сперматозоидов (т.е. низкой флуоресценции) исключая их от тех, с нарушается Акросома (высокая флуоресценции), а не включая их с имеющие нетронутыми Акросома. Это дает точную долю спермы с функциональными или нефункциональным Акросома. Сперматозоиды с отреагировал Акросома, а также нарушена методу мембраны потеряли их способность оплодотворить яйцеклетку. Кроме того точный анализ может пролить свет на основные Акросома изменения, т.е. механизм, поврежденные мембраны Акросома против псевдо Акросома активации.
Мы сравнили результаты, полученные с техника #1 и #2 техника и нашел большую совместимость между ними, в частности в оценке жизнеспособности и ΔΨm (Таблица 1). Одно из главных преимуществ использования выделенных проточный цитометр является большое количество оцененные сперматозоидов относительно небольшое количество сперматозоидов, которые оцениваются на практике путем микроскопии флуоресцирования и зонды (тысячи против сотен, соответственно ). Кроме того Последняя процедура является длительным и субъективным, даже при исполнении опытного наблюдателя. Как только проточной цитометрии обнаруживает связанных частицами флуоресценции, нет необходимости мыть несвязанных зонд из раствора, который является длительным шаг17. С другой стороны Оценка Флуориметрическое мембран сперматозоидов, описанные в метод #1 позволяет одновременной оценки нескольких оболочек. Мы смогли использовать как четыре флуоресцентных зондов вместе1,3.
Наконец следует отметить, что выделенный проточный цитометр был разработан как открытый пробирного модуль, предоставляя все основные инструменты для образца сбора и анализа данных. Приобретение функция позволяет собирать различные виды информации из ячейки выборки и поэтому позволяет адаптации для более точной оценки, как показано ниже для Акросома статус и apoptotic индекса.
В заключение методик, описанных в данном документе являются очень полезными для оценки качества спермы. Изучение мембран сперматозоидов крайне важно для определения компетенции спермы оплодотворение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что не существует никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить израильская компания «СЬОН» для искусственного осеменения и селекции (Хефец Хаим, Израиль) за их помощь и сотрудничество и г-жа Li Na (IMV технологий, L'Aigle, Франция) для помощи с инструмент установки и обучения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20x stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
