Summary
نقدم هنا، منهجيات لتقييم سلامة غشاء سبيرماتوزوان، ميزة خلوية المرتبطة باختصاص إخصاب الحيوانات المنوية. يصف لنا ثلاث تقنيات لتقييم فلوريميتريك أغشية الحيوانات المنوية: تلطيخ متزامنة مع تحقيقات الفلورسنت محددة والأسفار الفحص المجهري الخلوي تدفق متقدمة مخصصة للحيوانات المنوية. وترد أيضا أمثلة للجمع بين المنهجيات.
Abstract
سبيرميوجرامس القياسية التي تصف نوعية الحيوانات المنوية معظمها يستند المعلمات الفسيولوجية والمرئية، مثل حجم السائل المنوي وتركيز وحركية والحركة التقدمية، ومورفولوجية الحيوانات المنوية والجدوى. غير أن أيا من هذه التقييمات جيدة بما يكفي للتنبؤ بنوعية السائل المنوي. نظراً لأن الحفاظ على سلامة الحيوانات المنوية والإخصاب المحتملة يتوقف على سلامة الغشاء ووظائف داخل الخلايا، قد تمكن التقييم لهذه المعلمات تنبؤ أفضل من اختصاص إخصاب الحيوانات المنوية. وهنا يصف لنا ثلاثة أساليب مجدية لتقييم جودة الحيوانات المنوية باستخدام المسابر الفلورسنت الخاصة جنبا إلى جنب مع الأسفار مجهرية أو التدفق الخلوي التحليلات. تحليلات لتقييم سلامة غشاء البلازما باستخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) ويوديد propidium (PI)، سلامة الغشاء أكروسومال باستخدام fluorescein isothiocyanate مترافق بسام بيسوم agglutinin (فيتك-PSA) و سلامة غشاء الميتوكوندريا استخدام 5, 5 ', 6, 6'-تترا-الكلورو-1، 1 '، 3، 3'-تيترايثيلبينزيميدازوليل كاربوسيانيني يوديد (JC-1). وترد أيضا مزيج من هذه الأساليب. على سبيل المثال، استخدام أننيكسين V جنبا إلى جنب مع بي فلوروتشروميس يتيح تقييم المبرمج وحساب نسبة apoptotic الحيوانات المنوية (apoptotic الفهرس). ونحن نعتقد أن هذه المنهجيات، التي تستند إلى دراسة الأغشية المني، مفيدة جداً لتقييم مدى جودة الحيوانات المنوية.
Introduction
سلامة ووظيفة الحيوانات المنوية الأغشية عدد قليل من العوامل التي تشير إلى بقاء الحيوانات المنوية والإخصاب المحتملة. غشاء البلازما يعمل كحاجز بين الأقسام داخل الخلية وخارج الخلية، وبالتالي الحفاظ على توازن ناضح الخلوية1. أي الإجهاد الذي يؤدي إلى الأضرار بسلامة غشاء البلازما قد يضعف التوازن والحد من القدرة على البقاء والتسميد وزيادة موت الخلية. على سبيل المثال، يقلل نعد بقاء الحيوانات المنوية نظراً الأضرار التي لحقت بغشاء البلازما، ونتيجة للتغيرات في درجات الحرارة والضغط التناضحي2. ذكرت سابقا أن تعريض الحيوانات المنوية الثور بتركيزات منخفضة من الملوثات المنقولة مثل والاترازين مبيدات الآفات، وبه ديامينوتشلوروتريازيني المستقلب الرئيسي أو ميكوتوكسين الأفلاتوكسين B1، يقلل من الحيوانات المنوية البقاء1،3 . وكان تحديد هذا بواسطة وسم الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل مع DAPI في تركيبة مع بي، التي تلزم للحمض النووي للخلايا بغشاء البلازما تالفة.
أكروسومي رد فعل (ع) ينطوي على الانصهار الغشاء الخارجي أكروسومي وغشاء البلازما السطحية أسفر عن الإفراج عن الإنزيمات أكروسومال4،5. هذه هي الأحداث الأساسية لاختراق zona pellucida ودمج مزيد من الحيوانات المنوية مع البويضات6. ولذلك، يشكل تقييم سلامة غشاء أكروسومال معلمة مفيدة لتقييم نوعية السائل المنوي وخصوبة الذكور7،،من89. عدة تقنيات الفلورسنت مناسبة للتحقق من سلامة acrosome، فيتك-السلطة الوطنية الفلسطينية أو بسا فيتك8،10. في دراساتنا السابقة، باستخدام أنماط بسا فيتك المصبوغة1،3، تقدم تعاريف دقيقة ل (ط) acrosome سليمة، (ثانيا) تلف غشاء acrosome و (ثالثا) كان رد فعل أكروسومي. في التقرير الحالي، وعلينا تقييم الوضع acrosome استخدام مخصصة للحيوانات المنوية التدفق الخلوي ومقارنة النتائج لتلك باستخدام مجهر الأسفار.
الميتوكوندريا هي العضيات متعدد الوظائف المعنية في، في جملة أمور، ATP التوليف، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، وإشارات الكالسيوم والمبرمج. الاختلالات الوظيفية الفيزيولوجية، بما في ذلك العقم الذكور والإناث، ترتبط بتغيير الوظيفة المتقدرية11. يتم ترتيب في ميدبيسي الميتوكوندريا الحيوانات المنوية وتلعب دوراً حاسما في حركية الحيوانات المنوية12. من المقبول أيضا أن غشاء الميتوكوندريا العالية المحتملة (ΔΨm) يرتبط بحركية طبيعية والتسميد عالية القدرة13. وفي المقابل، ΔΨm منخفضة يرتبط بمستوى مرتفع من الأنواع الأكسجين التفاعلية وانخفاض معدل الإخصاب14. على الرغم من ذلك، يمكن أن تحفز الإجهاد الخلوية المركبات البيئية المختلفة، على سبيل المثال اختلال الغدد الصماء، ويؤدي إلى زيادة مؤقتة في ΔΨm، فرط الاستقطاب1،3، وزيادة إنتاج الجذور الحرة، وفي نهاية المطاف، [ابوبتوسس]15. التحقيق الفلورسنت 6، 5، 5 '، 6'-تترا-الكلورو-1، 1 '، 3، 3'-تيترايثيلبينزيميدازوليل كاربوسيانيني يوديد (JC-1) تمكن على سبيل المثال، بدراسة آثار السموم المنقولة على الحيوانات المنوية ΔΨm1،3.
سبيرميوجرامس القياسية، استناداً إلى المعلمات الفسيولوجية والمورفولوجية، ليست جيدة بما يكفي للتنبؤ بنوعية السائل المنوي. أساليب أكثر دقة مطلوبة لضمان جودة الحيوانات المنوية. هنا، نحن نقدم اثنين من الأساليب الممكنة لتحديد نوعية الحيوانات المنوية على أساس تقييمات أغشية الحيوانات المنوية: تلطيخ رباعية متزامنة مع تحقيقات الفلورسنت محددة والفحص المجهري الأسفار، ووصف لنا الدراسات1،3 ومؤخرا استخدمت الخلوي تدفق متقدمة مخصصة للحيوانات المنوية، في المختبر، وسبق استخدامها من قبل الآخرين16،،من1718.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الإسرائيلية عام 1994 للرفق بالحيوان. تم توفير الحيوانات المنوية البقري من شركة إسرائيلية تجارية للتلقيح الاصطناعي، وتربية. وقيمت الدفقات من شيكاغو بولز 11 في هذه الدراسة.
1-الحيوانات المنوية عينة إعداد
ملاحظة: ويستند الإجراء في المختبر روث البروتوكول1،3.
- الحصول على حوالي 1 – 6 مل من السائل المنوي الثور في أنبوب 15 مل في درجة حرارة الغرفة.
- لكل 1 مل من السائل المنوي، إضافة 6 مل من المخزن المؤقت نكم بريوارميد (عند 37 درجة مئوية) (110 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، والمماسح 20 مم [حمض 3-N-مورفيلينو بروبانيسولفونيك؛ ودرجة الحموضة 7.4]) والطرد المركزي لدقيقة 8 في 600 x غ، 1-2 مرات حتى المادة طافية واضحة.
ملاحظة: إذا كان تركيز الحيوانات المنوية أو وحدة التخزين الأولية مرتفعة جداً، تنقسم إلى أنابيب اثنين في غسل الأولى. - على الفور إزالة وتجاهل المادة طافية واضحة وترك حوالي 1 سم من المادة طافية فوق بيليه.
- العجاف بعناية هذه الأنابيب بزاوية 30 درجة زيادة المساحة السطحية للحيوانات المنوية السباحة حتى والانتظار 20 – 30 دقيقة للسماح للمني للسباحة حتى عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: ويمكن رؤية التعكر. - استخدام ميكروبيبيتي عناية، إزالة العلوي 1 مل من المادة طافية الذي يحتوي على المني متحركة لأنبوب 1.5 مل جديدة.
- تبقى الحيوانات المنوية عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ويقدر عدد الحيوانات المنوية استخدام هيموسيتوميتير نويباور.
ملاحظة: دائرة عد مختلفة يمكن استخدامها بدلاً من ذلك، ولكن عملية عد الأصوات المختلفة.- لمنع حركة المني، تمييع 100 ميليلتر من المني متحركة مع 10 مل ماء المقطر مزدوجة (دو) (تخفيف 1: 100) في أنبوب 15 مل وتخلط برفق.
- تحميل 10 ميليلتر من العينة في كل جانب من هيموسيتوميتير وساترة. تأكد من تجنب تشكيل فقاعة داخل الدائرة كما قد يؤدي هذا عدد الحيوانات المنوية غير دقيقة.
- مراقبة تحت مجهر المركب مع هدف X 20.
ملاحظة: الشبكة كاملة في هيموسيتوميتير تحتوي على 9 مربعات كبيرة، كل 1 مم2، وتقع كوفيرجلاس 0.1 ملم فوق أرض الدائرة. وهكذا، وحدة التخزين عبر المنطقة الوسطى في عد الأصوات هو 0.1 ملم3 أو 0.1 ميليلتر. المنطقة الوسطى من هيموسيتوميتير تحتوي على مربعات متوسطة 25 وكل مربع متوسط المربعات الصغيرة 16 مع أسطر مفردة. - حساب إجمالي عدد الخلايا الموجودة في المربعات الزاوية متوسطة 4 والساحة المركزية. لدقة أعلى، عد دائرتين (كلا الجانبين من هيموسيتوميتير نويباور) واستخدام المتوسط لحساب تركيز الخلية.
- حساب عدد الحيوانات المنوية بضرب عدد يعني الحصول على 5 (للحصول على عدد الخلايا في منطقة العد) و 10,000 (للحصول على العدد الخلايا كل 1 مل عينة المخففة). ثم اضرب عدد مرات الحصول على عامل إضعاف (1: 100).
ملاحظة: على سبيل المثال، متوسط عدد الحيوانات المنوية عدها في 5 مربعات متوسطة 25 داخل منطقة الفرز المركزية من دائرتين هو 150 ([152 + 148]/2). وهكذا، هو متوسط عدد الحيوانات المنوية كل دائرة (أو لكل ميليلتر 0.1) 150 × 5 = 750. اضرب 750 من 10,000 الحصول على العدد الخلايا كل 1 مل عينة المخففة (7,500,000) وثم ضرب 100 (عامل إضعاف) للحصول على خلايا 75 × 107 الواحد مل عينة السائل المنوي أصلية.
2-أسلوب #1: تقييم المتزامن لأغشية الحيوانات المنوية الفلورسنت متعددة باستخدام يسبر
ملاحظة: قيمت أغشية الحيوانات المنوية (البلازما، أكروسومال و mitochondrial) كما تم وصفه سابقا سيليغيني et al.10، مع إدخال بعض التعديلات عليها. واستخدمت ابيفلوريسسينت المجهري، جنبا إلى جنب مع كاميرا رقمية مع الإثارة في 450-490 نانومتر والانبعاثات في 515-565 نانومتر باستخدام عامل تصفية ثلاثي.
-
إعداد حلول الأسهم.
- إعداد 0.1 مغ/مل الحل الأسهم DAPI بتذويب 5 ملغ DAPI في 50 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS). إعداد 50 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، تمييع الحل الأسهم مع برنامج تلفزيوني في 01:10 (حل عملي؛ 10 ميكروغرام/مل).
- تحضير 1 ملغ/مل الحل الأسهم فيتك – PSA بتذويب 1 مغ من فيتك – PSA في 1 مل من برنامج تلفزيوني. إعداد 50 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، تمييع الحل الأسهم مع برنامج تلفزيوني في 01:10 (حل عملي؛ 100 ميكروغرام/مل).
- تحضير حل الأسهم 1 ملغ/مل JC-1 بإذابة 1 مغ من JC-1 في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). إعداد 10 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، تمييع الحل الأسهم مع [دمس] في 01:10 (حل عملي؛ 0.1 مغ/مل).
- إعداد الحل بي الأسهم بتذويب 10 مغ PI في 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (إعطاء 2.5 ملغ/مل). مخزن في + 4 درجة مئوية. تمييع الأسهم 1 مع برنامج تلفزيوني في 01:20 (حل عملي؛ 0.125 مغ/مل). تخزين في + 4 درجة مئوية كحل أسهم.
تنبيه: PI مطفر محتملة وينبغي التعامل معها بحذر. يجب التخلص من الصبغة بأمان، ووفقا للوائح المحلية المطبقة.
- نقل ميليلتر 133 من المني متحركة (الخطوة 1.5) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة (25 × 106 الحيوانات المنوية/mL).
ملاحظة: إذا كان تركيز العينة أعلى، تمييع في المخزن المؤقت نكم لتحقيق تركيز المطلوبة؛ إذا كان تركيز العينة من السباحة حتى العينة أقل، الطرد المركزي المادة طافية التي تم الحصول عليها بعد السباحة حتى في س 1,000 ز لمدة 5 دقائق وإزالة 0.5 مل من المادة طافية وعدد الحيوانات المنوية مرة أخرى. - إضافة 17 ميليلتر من DAPI (حل عملي) واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- لبيليه، إضافة 100 ميليلتر نكم المخزن المؤقت.
- إضافة 50 ميليلتر من فيتك – PSA، 2 ميليلتر من JC-1 و 3 ميليلتر من PI (تعمل الحلول) واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
- بيليه، إضافة 40 ميليلتر من المخزن المؤقت نكم وريسوسبيند بيبيتينج.
- نقل 10 ميليلتر من العينة الشريحة الزجاجية وتشويه وساترة.
-
تصور فورا بالفحص المجهري ابيفلوريسسينسي (استخدام 40 x هدف) مع عامل تصفية ثلاثي، مجهزة بكاميرا رقمية، والتقاط صورة لكل مرشح على حدة.
ملاحظة: لا يوجد أي أهمية ترتيب مرشحات تصور.- تصور تحت قناة DAPI مع الإثارة في 358 نيوتن متر والانبعاثات في 461 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- تصور تحت قناة فيتك مونومرات الأخضر مع الإثارة في 450-490 نانومتر والانبعاثات في 515 – 565 نانومتر.
- تصور تحت قناة بي للمجاميع حمراء مع الإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات في 590 نانومتر.
- تصور تحت جيمي كارتر-1 المجاميع حمراء مع الإثارة في 559 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات في نطاق 574 – 627 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ جيمي كارتر-1 مونومرات الأخضر مع الإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات في المجموعة من 500 – 535 نانومتر.
- دمج الصور الثلاث الواردة من عوامل التصفية في تنسيق JPG/JPEG، باستخدام الخيار "دمج" لبرنامج الكاميرا.
- فتح الصورة المدمجة مع أداة "الرسام" واستخدم خيار الفرشاة لوضع علامة المني الأصوات التي تم فرزها.
-
تصنيف المني استناداً إلى الأسفار التي تنبعث من كل التحقيق:
- تقييم المني 200 على الأقل من كل شريحة بشكل عام – كافة الخلايا تظهر الأزرق (DAPI).
- تقييم الجدوى طريق عد الخلايا الميتة، التي تظهر الأرجواني (PI [الأحمر] + [الأزرق] DAPI) وحساب النسبة المئوية للخلايا الميتة (مجموع الخلايا الميت عد الخلايا x 100).
- تقييم حالة acrosome باستخدام الأنماط لتلطيخ الفلورسنت (فيتك – PSA). حساب النسب المئوية لأنماط مختلفة (acrosome سليمة أو التالفة أو رد فعل إلى مجموع الخلايا عد الخلايا x 100).
ملاحظة: غشاء أكروسومال التالفة يظهر كغطاء acrosome تماما الملون، أخضر؛ يظهر رد فعل غشاء أكروسومال المتبقية الخضراء الاستوائية أو العلوي تلطيخ؛ الخلايا التي تحتوي على غشاء أكروسومال سليمة سوف لا يحمل أي صبغة خضراء من منطقة أكروسومال. - تقييم ΔΨm بالتمييز بين المني مع ΔΨm عالية، مما يحمل ميدبيسي ملطخة بالأحمر، والمنى مع انخفاض ΔΨm الذي يحمل ميدبيسي الملون الأخضر. عد الأحمر والأخضر ميدبيسيس كل على حدة وحساب النسبة (أحمر/أخضر).
3-أسلوب #2: تقييم أغشية الحيوانات المنوية مع مجموعات جاهزة للاستخدام والتدفق الخلوي
ملاحظة: وأجرى تقييم سلامة غشاء البلازما، سلامة غشاء أكروسومال والمحتملة غشاء الميتوكوندريا مع مجموعات قياس التدفق جاهزة للاستخدام تحتوي على فلوروتشروميس المجففة بالتبريد في كل بئر. وكان تنفيذ الإجراء حسب الشركات المصنعة مع إدخال بعض التعديلات عليها.
-
تقييم نزاهة غشاء البلازما
- أن العدد المطلوب من الآبار من مجموعة أدوات البقاء وتركيز (PI و SYbr14)، ونقلها إلى قاعدة العمل وتغطية بغطاء مرن (حماية من الضوء).
- إضافة ميليلتر 199 الحل مخزنة للخلوي كل بئر.
- أضف 1 ميليلتر من السائل المنوي متجانسة في 57 × 106/mL (الخلايا 57,000 كل بئر) وتجانسه قبل بيبيتينج.
- وتغطي اللوحة بغطاء أسود.
- احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
- تشغيل العينة من خلال سيتوميتير التدفق مع الإعداد 'استمرارية'.
-
غشاء الميتوكوندريا المحتملة
- أخذ العدد المطلوب من الآبار من الحزمة من نشاط المتقدرية مجموعة (JC-1)، وتحويلها إلى قاعدة العمل وتغطية بغطاء مرن (حماية من الضوء).
- إضافة 10 ميليلتر من الإيثانول المطلقة كل بئر و "الماصة؛" ريسوسبيند هذا المسحوق داخل البئر.
- إضافة ميليلتر 190 من برنامج تلفزيوني كل بئر وتجانسه قبل بيبيتينج.
- إضافة ميليلتر 0.75 من السائل المنوي متجانسة في 57 × 106/mL (الخلايا 50,000 كل بئر) وتجانسه قبل بيبيتينج.
- وتغطي اللوحة بغطاء أسود.
- احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
- تشغيل العينة من خلال سيتوميتير التدفق بالنشاط ʽmitochondrial الإعداد '.
-
سلامة غشاء أكروسومال
ملاحظة: تلطيخ فيتك – هيكل السلام والأمن (انظر أسلوب #1) يتيح تقييم 3 فئات أكروسومي (acrosome سليمة ورد acrosome acrosome التالفة). استخدام تدفق سيتوميتير والسلامة & acrosome سلامة kit (PI وفيتك – السلطة الوطنية الفلسطينية)، مفصولة المني في هذه الفئات 3.- أخذ العدد المطلوب من الآبار من مجموعة طقم النزاهة صلاحية & أكروسومي، ونقلهم إلى قاعدة العمل وتغطية بغطاء مرن (حماية من الضوء).
- إضافة 200 ميليلتر من حل مخزنة للخلوي كل بئر.
- إضافة ميليلتر 0.7 من السائل المنوي متجانسة في 57 × 106/mL (الخلايا 40,000 كل بئر) وتجانسه قبل بيبيتينج.
- وتغطي اللوحة بغطاء أسود.
- احتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
- تشغيل العينة من خلال سيتوميتير التدفق مع ʽInCyte الإعداد '.
- تحليل الرسم البياني الناتجة من النابضة ثلاثة مجالات علامة وفقا لكثافة الأسفار، تمثل الخلايا ضئيلة، الاستشعاع منخفضة مع سليمة، أونستاينيد أكروسومي (R1)، منخفضة الاستشعاع الخلايا مع بقايا الملون جزء من أكروسومي (R2) و الغاية الاستشعاع الخلايا مع تعطل acrosome (R3).
ملاحظة: استخدام المقطع "تحليل الملفات التي تم الحصول عليها باستخدام الوحدات النمطية الأخرى" في دليل مستخدم أداة من أجل إنشاء المناطق الثلاث (R1, R2, R3).
4-الأسلوب #3: تقييم أغشية الحيوانات المنوية باستخدام المسابر الفلورسنت والتدفق الخلوي
ملاحظة: استخدام أنيكسين V جنبا إلى جنب مع بي فلوروتشروميس يتيح تقييم المبرمج وحساب نسبة apoptotic الحيوانات المنوية (apoptotic الفهرس).
- إعداد 1 × أنيكسين المخزن المؤقت ملزم الخامس من 20 x حل الأسهم (ميليلتر 500 مخفف من أنيكسين V ربط المخزن المؤقت 20 x حل الأسهم مع 9.5 مل ماء المقطر المعقم).
- ويقدر عدد الحيوانات المنوية استخدام هيموسيتوميتير نويباور وصفها في الفرع 1-7.
- غسل المني6 10 في 1 مل 1 × أنيكسين V ربط المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x غ لمدة 10 دقائق.
- نضح المادة طافية تماما.
- ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر 1 × أنيكسين V ربط المخزن المؤقت.
- إضافة 10 ميليلتر annexin الخامس يضاف إلى فيتك.
- يخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- غسل المني بإضافة 1 مل 1 x أننيكسين V ملزمة المخزن المؤقت لكل 10 من6 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق.
- نضح المادة طافية تماما.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من annexin x 1 V ملزمة العازلة الواحدة 106 مجموع الخلايا.
- أضف 1 ميكروغرام/مل بي قبل التحليل مع سيتوميتير تدفق مباشرة.
- تشغيل العينة من خلال سيتوميتير التدفق على ʽInCyte '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الشكل 1 يبين فلوريميتريك المتزامنة التقييم أغشية الحيوانات المنوية (البلازما، أكروسومال و mitochondrial) PI، DAPI، فيتك-PSA وجيمي كارتر-1. تقييم الأغشية الحيوانات المنوية استخدام تلطيخ متزامنة مع أربعة تحقيقات الفلورسنت يسمح، على سبيل المثال، تقييم نسبة الحيوانات المنوية في كل فئة من فئات – يعيش مقابل الميت؛ ارتفاع مقابل انخفاض ΔΨm؛ سليمة مقابل. أضرار acrosome – في وقت واحد لكل المني.
الشكل 2 يعرض النتائج من الحيوانات المنوية غشاء التقييم باستخدام المسابر فلوريميتريك. السائل المنوي يحتوي على الأقل 80% متحركة المني فقط استخدمت في التجربة. وتم فحص خلايا على الأقل 200 كل الثور. كان من الممكن لتقييم الاختلافات في نوعية عينة الحيوانات المنوية فيما يتعلق بسلامة الغشاء. على سبيل المثال، كان السائل المنوي للثور رقم 7 نسبة منخفضة نسبيا من الخلايا الميتة، ردت نسبة منخفضة من الحيوانات المنوية مع الزائفة أكروسومي وأعلى غشاء الميتوكوندريا المحتملة، بالمقارنة مع السائل المنوي للثور رقم 1.
ويبين الشكل 3 عينات تمثيلية تقييم الجدوى (الشكل 3 ألف–ج 3) والنشاط المتقدرية (3D الرقم–3F). وقيمت fluorescence كثافة العينات بتدفق سيتوميتير الحيوانات المنوية ميكروكابيلاري مخصصة، مع برامج مخصصة. سيتوميتير تدفق هذا يحتوي على واحد الليزر الأزرق في المرحلة الصلبة (448 nm) وهما photodiodes: الأمام مبعثر ومبعثر الجانب. أنها تدابير على وجه التحديد خصائص الانبعاثات الحيوانات المنوية مع ثلاثة ضوئي أنابيب (الأخضر: 525/30 نانومتر، أصفر: 583/26 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ والأحمر: 655/50 نانومتر) ويستوعب عوامل التصفية وشق بصري16. ويمكن تقييم المني 5,000 للتحليل.
يتضمن أدوات تقييم صلاحية تحقيق ذات النفاذية التفاضلية لصالحه (غشاء البلازما سليمة) والمنى الميت (غشاء البلازما التالفة) (الشكل 3). وقيمت ΔΨm الحيوانات المنوية باستخدام مجموعة أدوات التي تميز بين الاستقطاب غشاء الميتوكوندريا (الأسفار التي تظهر باللون البرتقالي) و depolarized غشاء الميتوكوندريا (الأسفار التي تظهر باللون الأخضر) (رقم 3F).
ويعرض الشكل 4 تقييما لسلامة acrosome أداء أدوات جاهزة للاستخدام، قراءة مع التدفق الخلوي (4A الأرقام–ج 4)، مع تقسيم الرسم البياني الناتجة من بوابات المني إلى ثلاثة مجالات ماركر، تمثل الخلايا الاستشعاع منخفضة لا تذكر مع سليمة، أونستينيد أكروسومي (R1)، الاستشعاع منخفضة الخلايا مع بقايا الملون جزء من أكروسومي (R2)، والغاية الاستشعاع الخلايا مع تعطل acrosome (R3).
ويعرض الجدول 1 مقارنة بين اثنين من التقنيات فلوريميتريك لتقييم الأغشية الحيوانات المنوية. وقيمت عينات الحيوانات المنوية نفسها من الثيران الثلاثة المختلفة للاستمرارية وغشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨm) وسلامة acrosome استخدام تلطيخ رباعية المتزامنة، فضلا عن التدفق الخلوي. هذه المقارنة أمر بالغ الأهمية، ذلك لأنها تبين النتائج المتطابقة باستخدام كل من الطريقتين. تم تحليل البيانات تحليلاً واختبار t للطالب. وقد لوحظت لا فروق يعتد بها إحصائيا.
ويبين الشكل 5 عينة تمثيلية للمبرمج استخدام annexin الخامس (AV) وفلوروتشروميس (PI) يوديد propidium تقييم. استخدام هذين يسبر يتيح التمييز بين أربعة أنماط تشير إلى خلايا قابلة للحياة (AV و PI)، المبكر apoptotic الخلايا (AV +، PI-) والخلايا أبوبتوتيك (AV +، PI +) والخلايا نخرية (AV-، PI +).
رقم 1: فوتوميكروجرافي ابيفلوريسسينسي من المني الملون في وقت واحد مع عدة تحقيقات الفلورسنت. (أ) المتزامن تلطيخ مع أربعة تحقيقات PI، DAPI، فيتك-PSA وجيمي كارتر-1) المني (ب) يعيش مع تلطيخ DAPI نواة وغشاء الميتوكوندريا العالية المحتملة (ΔΨm)، ملطخة بمسبار 1 جيمي كارتر. المني الميت (ج) مع غشاء البلازما التالفة ملطخة بمسبار PI، تضررت acrosome ملطخة بمسبار بسا فيتك و ΔΨm منخفضة. (د) حية، ردت acrosome المني مع تلطيخ الاستوائية المتبقية وانخفاض ΔΨm. (ﻫ) حية، ردت acrosome المني مع تلطيخ العليا المتبقية و ΔΨm عالية. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تقييم الثور أغشية الحيوانات المنوية باستخدام المسابر فلوريميتريك. (أ) الحيوانات المنوية جدوى مصممة مع نيون المسابير 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) ويوديد propidium (PI). أكروسومي (ب) تم تحديد حالة وفقا لأنماط المصبوغة فيتك-هيكل السلام والأمن. قدم هي نسبة المني مع رد فعل أكروسومي. (ج) Mitochondrial غشاء المحتملة (ΔΨm) وتم تقييم استخدام مع المسبار الفلورسنت جيمي كارتر-1 وقدم كالنسبة بين متوسط نسبة ملطخة بالأحمر (إمكانات عالية) والملون الأخضر الحيوانات المنوية (احتمال ضعيف). يتم عرض البيانات في المئة من الخلايا من الخلايا تقييم إجمالي. وجرى تحليل المني 200 على الأقل كل الثور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: صلاحية (أ-ج) وتقييم fluorescence المتقدرية النشاط (د-و) من عينات تمثيلية تقاس بتدفق إيسيسيتي سيتوميتير. وتمثل رسوم بيانية أونجاتيد المني والمنى الحطام (أ، د)، عن طريق بوابة (ب، ه)، توزيع المني لصالحه (الأخضر) وخلايا الميت (أحمر) (ج)، وتوزيع المني للاستقطاب (أصفر) و (ديبولاريزيد الأخضر) غشاء الميتوكوندريا (F). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: Fluorescence تقييم السلامة acrosome لعينات تمثيلية تقاس بتدفق إيسيسيتي سيتوميتير. (أ) المدرج التكراري المني أونجاتيد والحطام. (ب، ج) رسوم بيانية لبوابات المني مع تقييم السلامة acrosome يؤديها مع عدة جاهزة للاستخدام، وقراءة مع تكييف الإعداد 'إينسيتي'، تقسيم الرسم البياني الناتجة من بوابات المني في ثلاثة مجالات ماركر، يمثلون لا يعتد بها، الخلايا الاستشعاع منخفضة مع سليمة، أونستينيد أكروسومي (R1)، خلايا الاستشعاع منخفضة مع بقايا الملون جزء من أكروسومي (R2) والخلايا عالية الاستشعاع مع تعطل acrosome (R3). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| لا متوسط الخلايا | فيالبيليتي | إمكانات غشاء الميتوكوندريا | سلامة أكروسومي | ||||||
| قابلة للاستمرار | الميت | ديبولاريزيد | الاستقطاب | نسبة الأحمر/الأخضر | سليمة أكروسومي | وكان رد فعل أكروسومي | أكروسومي تعطل | ||
| تلوين رباعية | 253 | 32.7 ± 1.53% | 67.3 ± 1.53% | 65.7 ± 2.25% | 34.3 ± 2.52% | 0.5 ± 0.06 | 37.3 ± 7.2% | 38.0 ± 5، 7% | 24.3 ± 3، 0% |
| تدفق سيتومتيري | 5,000 | 32.3 ± 2.08% | 67.7 ± 2.08% | 1.00 65.0 ± % | 35.0 ± 1.00% | 0.5 ± 0.02 | 39.5 ± 5، 7% | 39.5 ± 6.5% | 21.0 ± 8.0% |
الجدول 1: مقارنة بين اثنين من التقنيات فلوريميتريك لتقييم الأغشية الحيوانات المنوية. وقيمت عينات الحيوانات المنوية نفسها للبقاء وغشاء الميتوكوندريا المحتملة والنزاهة acrosome استخدام تلطيخ رباعية المتزامنة والتدفق الخلوي. يتم عرض البيانات كما يعني نسبة ± SD من فحص الخلايا، وتحسب ل 3 replicates.
الرقم 5: أننيكسين fluorescence الخامس وبي عينة تمثيلية تقاس cytometer تدفق. رسوم بيانية تمثل (A) أونجاتيد المني والحطام وتوزيع المني بوابات لأوائل أبوبتوتيك (AV + PI-)، أبوبتوتيك (AV + بي +)، (ب) قابلة للاستمرار (AV-، PI) نخرية (AV-، PI +)، والخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحيوانات المنوية إخصاب محتمل يعتمد على عوامل متعددة تعكس نوعيته. تركيزات عالية من المني ونسبة عالية من المني متحركة عالية تدريجيا قد يعتبر السائل المنوي عالية الجودة. ومع ذلك، مثل هذا تقييم لا تأخذ في الاعتبار المعلمات الخلوية والفنية الأخرى. استخدام سيتوميتير ميكروكابيلاري 'مقاعد البدلاء-أعلى' تدفق يمكن تكييفها بسهولة لتقييم مختلف هياكل الحيوانات المنوية باستخدام المسابر الفلورسنت، كما هو موضح سابقا قبل الآخرين17 وأظهرت هذه الوثيقة (الأسلوب #3). على سبيل المثال، سلامة acrosome الحيوانات المنوية مهم جداً لحدوث الإخصاب الطبيعية الناجحة ويبرر ذلك التقييم الدقيق لحالة أكروسومال. يمكن إجراء هذا تقييم بسهولة بتصنيف حالة أكروسومي باستخدام أنماط نيون تلطيخ (فيتك بسا، فيتك-السلطة الوطنية الفلسطينية، أي أسلوب #1، كما هو موضح سابقا)1،3. على وجه الخصوص، من المهم جداً لتحديد نسبة الحيوانات المنوية مع acrosome سليمة (أي معارض أكروسومي أونستينيد) بالنسبة لأولئك مع acrosome التالفة. مع الاحترام للحيوانات المنوية الأخير، مع acrosome التالفة يمكن أن يحمل كاب أكروسومال (ط) ملطخة الكامل، مما يدل على أن الغشاء معطوب، تمكن الصبغة تتدفق عبر الغشاء حويصلة أكروسومي؛ (ثانيا) أكروسومي--كان رد فعل الحيوانات المنوية الذي يحمل acrosome المتبقية المحتوى فقط، مشيراً إلى أن ع قد حدث بالفعل (أي زائف AR). تجدر الإشارة إلى أنه يمكن أيضا إجراء مثل هذا تقييم مع cytometer تدفق مخصصة.
طقم النزاهة صلاحية & acrosome جاهزة للاستخدام يحدد كلا بقاء الحيوانات المنوية (قابلة للحياة أو ميتا) وسلامة أكروسومال (سليمة أو تعطل). هنا، فإننا نقترح استخدام cytometer تدفق مخصصة لتعريف حالات أكروسومال الثلاثة المذكورة آنفا (أي، سليمة، بأضرار، وكان رد فعل). علينا تكييف ميكروكابيلاري تدفق cytometer منهاج التقييم أكثر دقة، والذي يعرف بالحيوانات المنوية كان رد فعل أكروسومي (أي انخفاض الأسفار) بينما استبعادها من تلك مع تعطل acrosome (الفلورية العالية)، بدلاً من بما في ذلك لهم مع الحاصلين أكروسومي سليمة. وهذا يعطي نسبة دقيقة من الحيوانات المنوية مع acrosome وظيفي أو غير وظيفي. الحيوانات المنوية مع رد فعل acrosome، فضلا عن تعطل غشاء أكروسومال قد فقدت قدرتها على تخصيب البويضات. وعلاوة على ذلك، التحليل الدقيق قد تلقي الضوء على الآلية الكامنة وراء التغيير أكروسومي، أي، تلف غشاء acrosome مقابل تفعيل acrosome الزائفة.
نحن مقارنة النتائج المحققة مع أسلوب #1 و 2 # تقنية، والعثور على التوافق الكبير بينهما، لا سيما في تقييم الجدوى و ΔΨm (الجدول 1). واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام سيتوميتير تدفق مخصصة هو العدد الكبير من تقييم المني بالنسبة لعدد صغير من المني التي يتم تقييمها في الممارسة بالفحص المجهري الأسفار والمسابير (آلاف مقابل مئات، على التوالي ). وعلاوة على ذلك، هذا الإجراء الأخير مضيعة للوقت وغير موضوعية، حتى عندما يؤديها مراقب خبرة. كما تكشف التدفق الخلوي فقط المرتبطة بالجسيمات الفلورية، ليست هناك حاجة لغسل التحقيق غير منضم من الحل، وهي خطوة تستغرق وقتاً طويلاً17. من ناحية أخرى، يمكن تقييم فلوريميتريك أغشية الحيوانات المنوية هو موضح في أسلوب #1 تقييم الأغشية متعددة متزامنة. كنا قادرين على استخدام ما يصل إلى أربعة تحقيقات الفلورسنت معا1،3.
وأخيراً، تجدر الإشارة إلى أن سيتوميتير تدفق مخصص وضع كوحدة تحليل مفتوحة، توفير جميع الأدوات الأساسية لتحليل البيانات والحصول على عينة. الدالة اقتناء يتيح جمع أنواع مختلفة من المعلومات من عينة خلية وبالتالي يسمح التكيف لتقييم أكثر دقة، كما هو موضح هنا لمؤشر الحالة و apoptotic acrosome.
وفي الختام، المنهجيات المبينة في هذه الورقة مفيدة جداً لتقييم مدى جودة السائل المنوي. فحص الأغشية المني أمر بالغ الأهمية لتحديد اختصاص إخصاب الحيوانات المنوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن هناك لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر "سيون" شركة إسرائيلية للتلقيح الاصطناعي، وتربية (حاييم هافيتز، إسرائيل) لمساعدتهم والتعاون، والسيدة لي نا (التكنولوجيات IMV، L'Aigle، فرنسا) للحصول على المساعدة مع أداة الإعداد والتدريب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20x stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
