Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fluorimetri teknikker til vurdering af Sperm membraner

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58622
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Animal Sperm Research Center, Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem

Summary

Vi præsenterer her, metoder til at vurdere spermatozoan membran integritet, en cellulær funktion tilknyttet sperm befrugtning kompetence. Vi beskriver tre teknikker for fluorimetri vurdering af sperm membraner: samtidige farvning med specifikke fluorescerende sonder, Fluorescens mikroskopi og avancerede sæd-dedikeret flowcytometri. Eksempler på kombinerer metoder er også præsenteret.

Abstract

Standard spermiograms der beskriver sædkvalitet er for det meste baseret på de fysiologiske og visuelle parametre, såsom ejakulatvolumen og koncentration, motilitet og progressive motilitet, og sperm morfologi og levedygtighed. Men ingen af disse vurderinger er gode nok til at forudsige sædkvaliteten. I betragtning af at vedligeholdelse af sperm levedygtighed og befrugtning potentielle afhænger membran integritet og intracellulære funktionalitet, kan evaluering af disse parametre aktiverer en bedre forudsigelse af sperm befrugtning kompetence. Her beskriver vi tre mulige metoder til at evaluere sædkvalitet ved hjælp af specifikke fluorescerende sonder kombineret med Fluorescens mikroskopi eller flow flowcytometri analyser. Analyser vurderes plasma membran integritet ved hjælp af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium Iodid (PI), acrosomal membran integritet ved hjælp af fluorescein isothiocyanat-konjugeret Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) og mitokondrielle membran integritet ved hjælp af 5, 5', 6, 6'-tetra-chlor-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine Iodid (JC-1). Kombinationer af disse metoder er også præsenteret. For eksempel, brug af annexin V kombineret med PI fluorokromer muliggør vurdering af apoptose og beregningen af andelen af apoptotiske sæd (apoptotiske indeks). Vi mener, at disse metoder, som er baseret på undersøge sædcelle membraner, er meget nyttige til vurdering af sædkvalitet.

Introduction

Integritet og funktionalitet af sperm membraner er nogle af de faktorer, der angiver sperm levedygtighed og befrugtning potentielle. Plasmamembran fungerer som en sikkerhedsbarriere mellem intracellulære og ekstracellulære rum, dermed bevare cellulære osmotiske balance1. Nogen stress, der inducerer skader på plasma membran integritet kan forringe homøostase, reducere levedygtighed og befrugtning kapacitet og øge celledød. For eksempel reducerer kryopræservering sperm levedygtighed skyldes til skade på sin plasma membran, som følge af ændringer i temperatur og osmotisk stress2. Vi har tidligere rapporteret at udsætte bull sæd til lave koncentrationer af fødevarebårne kontaminanter som pesticid atrazin, dets vigtigste metabolit diaminochlorotriazine eller mykotoksiner aflatoksin B1, reducerer sperm levedygtighed1,3 . Dette blev bestemt ved mærkning dobbelt-strenget DNA med DAPI i kombination med PI, som binder sig til DNA af celler med en beskadiget plasmamembran.

Acrosome reaktion (AR) indebærer fusion af den ydre acrosome membran og den overliggende plasma membran resulterer i frigivelse af acrosomal enzymer4,5. Disse er væsentlige begivenheder for zona pellucida penetration og yderligere sammenlægning af sperm med oocyt6. Evaluering af acrosomal membran integritet udgør derfor, en nyttig parameter for at evaluere sædkvalitet og mandlige fertilitet7,8,9. Flere fluorescerende teknikker er velegnet til kontrol af acrosome integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I vores tidligere undersøgelser, ved hjælp af mønstre af FITC-PSA farvning1,3, vi fastsat præcise definitioner for (i) intakt acrosome, (ii) beskadiget acrosome membran og (iii) reagerede acrosome. I den foreliggende betænkning, vi vurdere acrosome status ved hjælp af sæd-dedikeret flowcytometri og sammenligne resultaterne til dem, der bruger Fluorescens mikroskopi.

Mitokondrier er multifunktionelle organeller involveret, blandt andre ting, ATP syntesen, reaktive ilt arter produktion, calcium signalering apoptose. Fysiologiske dysfunktioner, herunder mandlige og kvindelige infertilitet, er forbundet med ændrede mitokondrie funktion11. Sperm mitokondrier er arrangeret i midpiece og spiller en afgørende rolle i sperm motilitet12. Det er blevet godt modtaget, høj mitokondrielle membran potentiale (ΔΨm) er forbundet med normale motilitet og høj befrugtning kapacitet13. Derimod lave ΔΨm er forbundet med en forhøjet niveau af reaktive ilt arter og reduceret befrugtning sats14. Ikke desto mindre kan forskellige miljømæssige forbindelser, for eksempel endokrine disruptorer, fremkalde cellulært stress og føre til en forbigående stigning i ΔΨm, hyperpolarisering1,3, øget produktion af frie radikaler og i sidste ende, apoptose15. Fluorescerende sonden 5, 5', 6, 6'-tetra-chlor-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine Iodid (JC-1) giver mulighed for undersøgelse for eksempel virkninger af fødevarebårne toksiner på sæd ΔΨm1,3.

Standard spermiograms, baseret på fysiologiske og morfologiske parametre, der ikke er gode nok til at forudsige sædkvaliteten. Mere præcise metoder er nødvendige for at sikre sædkvalitet. Her, vi give to mulige metoder til at bestemme sædkvalitet baseret på vurderinger af sperm membraner: samtidige firedobbelt farvning med specifikke fluorescerende sonder og Fluorescens mikroskopi, beskrevet i vores undersøgelser1,3 og avancerede sæd-dedikeret flowcytometri, for nylig udnyttet i vores laboratorium, og allerede bruges af andre16,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenterne blev udført efter 1994 israelske retningslinjer for dyrevelfærd. Kvæg sæd blev leveret af kommercielle israelsk selskab til kunstig befrugtning og avl. Ejakulerer 11 tyre blev vurderet i denne undersøgelse.

1. sperm prøve forberedelse

Bemærk: Proceduren er baseret på Roth laboratoriet protokol1,3.

  1. Få ca. 1 – 6 mL af tyresæd i en 15 mL tube ved stuetemperatur.
  2. For hver 1 mL af sæd, tilføje 6 mL af forvarmet (ved 37 ° C) NKM buffer (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic syre, pH 7,4]) og centrifugeres for 8 min på 600 x g, 1 – 2 gange indtil supernatanten er klart.
    Bemærk: Hvis koncentrationen af sædceller eller det oprindelige volumen er meget høj, opdelt i to rør ved den første vask.
  3. Straks fjerne og supernatanten klar og forlader ca 1 cm af supernatanten ovenfor pelleten.
  4. Forsigtigt lean rør på et 30° vinkel at øge arealet for sædceller at svømme op og vente 20-30 min for at tillade sædcellerne at svømme op ved 37 ° C.
    Bemærk: Turbiditet kan ses.
  5. Med en mikropipette omhyggeligt, Fjern den øverste 1 mL af supernatanten indeholdende de motile sædceller til en ny 1,5 mL tube.
  6. Holde sæden ved 37 ° C indtil brug.
  7. Estimere antal sædceller ved hjælp af en Neubauer hemocytometer.
    Bemærk: En anden optælling kammer kan bruges i stedet, men optællingen er forskellige.
    1. For at forhindre sædcelle bevægelse, fortyndes 100 µL af de motile sædceller med 10 mL dobbeltdestilleret vand (DDW) (1: 100 fortynding) i en 15 mL tube og blandes forsigtigt.
    2. Læg 10 µL af prøven i hver side af hemocytometer og coverslip. Sørg for at undgå boble dannelse inde i salen, da dette kan resultere i en unøjagtig sædkvalitet.
    3. Observere under et sammensat mikroskop med en 20 X mål.
      Bemærk: Den fulde nettet på en hemocytometer indeholder 9 store firkanter, hver 1 mm2, og daekglas hviler 0.1 mm over gulvet i salen. Volumen over det centrale tælle område er således 0.1 mm3 eller 0,1 µL. Det centrale område af hemocytometer indeholder 25 medium firkanter og hvert medium square har 16 mindre firkanter med enkeltstreger.
    4. Tæl antallet af celler findes i 4 medium hjørne pladser og det centrale torv. Højere præcision, tæller to kamre (begge sider af Neubauer hemocytometer) og bruge gennemsnittet for at beregne celle koncentration.
    5. Beregne sædkvalitet ved at gange den gennemsnitlige antal fremstillet af 5 (for at opnå antallet af celler pr. tælle område) og 10.000 (at opnå antallet af celler pr. 1 mL fortyndet prøve). Multiplicer de opnåede tæller med fortyndingsfaktoren (1: 100).
      Bemærk: For eksempel, et gennemsnitligt antal sædceller tælles i 5 af de 25 medium pladser i de centrale tælle område med to kamre er 150 ([152 + 148] / 2). Det gennemsnitlige antal sperms pr. kammer (eller pr. 0,1 µL) er således 150 x 5 = 750. Gange 750 af 10.000 for at opnå antallet af celler pr. 1 mL fortyndet prøve (7,500,000) og derefter gange med 100 (fortyndingsfaktoren) at skaffe 75 x 107 celler pr. mL af oprindelige sædprøve.

2. teknik #1: Samtidige vurdering af Sperm membraner ved hjælp af flere fluorescerende sonder

Bemærk: Sperm membraner (plasma, acrosomal og mitokondriel) blev vurderet som tidligere beskrevet af Celeghini et al.10, med nogle ændringer. Epifluorescerende mikroskopi blev brugt, kombineret med et digitalt kamera med excitations på 450-490 nm- og på 515-565 nm med en tredobbelt filter.

  1. Forberede stamopløsninger.
    1. Forberede 0,1 mg/mL DAPI stamopløsning ved at opløse 5 mg af DAPI i 50 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Forberede 50 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C. Før brug, fortyndes stamopløsning med PBS på 1:10 (brugsopløsning; 10 µg/mL).
    2. Forberede 1 mg/mL FITC-PSA stamopløsning ved at opløse 1 mg af FITC-PSA i 1 mL PBS. Forberede 50 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C. Før brug, fortyndes stamopløsning med PBS på 1:10 (brugsopløsning; 100 µg/mL).
    3. Forberede 1 mg/mL JC-1 stamopløsning ved at opløse 1 mg af JC-1 i 1 mL af dimethylsulfoxid (DMSO). Forberede 10 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C. Før brug, fortyndes stamopløsning med DMSO på 1:10 (brugsopløsning; 0,1 mg/mL).
    4. Forberede PI stamopløsningen ved at opløse 10 mg af PI i 400 µL af PBS (giver 2,5 mg/mL). Opbevares ved + 4 ° C. Fortynd stock 1 med PBS på 1:20 (brugsopløsning; 0,125 mg/mL). Opbevar ved + 4 ° C som en stamopløsning.
      Forsigtig: PI er en potentiel mutagen og skal håndteres med omhu. Farvestoffet skal bortskaffes sikkert og i overensstemmelse med gældende lokale bestemmelser.
  2. Overføre 133 µL af de motile sædceller (trin 1,5) til en ny 1,5 mL tube (25 x 106 sædceller/mL).
    Bemærk: Hvis prøven koncentration er højere, fortynde det i NKM buffer til at opnå den nødvendige koncentration; Hvis prøven koncentrationen af svømme op prøve er lavere, centrifugeres den opnåede supernatanten efter svømning op på 1.000 x g i 5 min, fjerne 0,5 mL af supernatanten og tælle sæden igen.
  3. Tilføje 17 µL af DAPI (brugsopløsning) og inkuberes i 10 min. ved 37 ° C.
  4. Der centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min og supernatanten.
  5. Pellet, tilføje 100 µL af NKM buffer.
  6. Tilsæt 50 µL af FITC-PSA, 2 µL af JC-1 og 3 µL af PI (arbejder løsninger) og inkuberes i 10 min. ved 37 ° C.
  7. Der centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
  8. Pellet, tilføje 40 µL af NKM buffer og resuspend af pipettering.
  9. Overfør 10 µL af prøven til et glas dias, smøre og coverslip.
  10. Visualisere straks ved epifluorescensmikroskop mikroskopi (brug 40 x mål) med en tredobbelt filter, udstyret med et digitalt kamera og tage et billede særskilt for hvert filter.
    Bemærk: Der er ingen betydning efter filtre visualiseret.
    1. Visualisere under DAPI kanal med excitations på 358 nm- og på 461 nm.
    2. Visualisere under FITC kanal for grøn monomerer med excitations på 450-490 nm- og på 515-565 nm.
    3. Visualisere under PI kanal for rød aggregater med excitations på 488 nm- og på 590 nm.
    4. Visualisere under JC-1 rød aggregater med excitation på 559 nm og udledning i rækken af 574-627 nm; JC-1 grøn monomerer med excitation på 488 nm og emission i rækken af 500-535 nm.
  11. Flette de tre billeder modtaget fra filtrene i JPG/JPEG format, ved hjælp af indstillingen "Flet" af kamera-software.
  12. Åbn det flettede billede med "Maling" værktøj og bruge indstillingen børste til at markere optalte sædcellerne.
  13. Klassificere sædcellerne baseret på fluorescens udledes fra hvert sonde:
    1. Generelt evalueres mindst 200 sædceller pr. slide — alle celler vises blå (DAPI).
    2. Vurdere levedygtigheden ved optælling af døde celler, der vises lilla (PI [rød] + DAPI [blå]) og beregne procentdelen af døde celler (døde celler/total tælles cellerne x 100).
    3. Vurdere acrosome status ved hjælp af mønstre af fluorescerende farvning (FITC-PSA). Beregne procenter af de forskellige mønstre (intakt, beskadigede eller monomers acrosome celler/total tælles cellerne x 100).
      Bemærk: Beskadiget acrosomal membran vises som et fuldt farves, grøn acrosome cap; monomers acrosomal membran viser resterende grønne ækvatoriale eller øvre farvning; celler, der indeholder intakt acrosomal membran vil ikke udstille nogen grøn farvning af den acrosomal region.
    4. Vurdere ΔΨm ved at skelne mellem sædcellerne med høj ΔΨm, som udviser en rød-farvede midpiece og sædcellerne med lav ΔΨm, som udviser en grøn-farvet midpiece. Tælle røde og grønne midpieces separat og beregne deres ratio (rød/grøn).

3. teknik #2: Vurdering af Sperm membraner med klar-til-brug Kits og flowcytometri

Bemærk: Vurdering af plasma membran integritet, mitokondrielle membran potentiale og acrosomal membran integritet blev udført med klar-til-brug flow flowcytometri møntsæt frysetørrede fluorokromer i hver brønd. Proceduren blev udført ifølge producenterne med nogle ændringer.

  1. Plasma membran integritet evaluering
    1. Tage det ønskede antal boringer fra pakken af levedygtighed og koncentration kit (PI og SYbr14), overføre dem til arbejde base og dække med en fleksibel låg (beskyttelse mod lys).
    2. Tilføje 199 µL af bufferopløsning til flowcytometri pr. brønd.
    3. Tilføj 1 µL af homogene sæd på 57 x 106/mL (57.000 celler pr. brønd) og homogeniseres ved pipettering.
    4. Dække plade med sort låg.
    5. Der inkuberes i 10 min. ved 37 ° C beskyttet mod lys.
    6. Kør prøven gennem flow forskellige med indstillingen 'bæredygtighed'.
  2. Mitokondrielle membran potentiale
    1. Tage det ønskede antal boringer fra pakken af mitokondrie-aktivitet kit (JC-1), overføre dem til arbejde base og dække med en fleksibel låg (beskyttelse mod lys).
    2. Tilsæt 10 µL absolut ethanol pr. brønd og afpipetteres for at resuspend pulver stede i brønden.
    3. Tilføje 190 µL af PBS pr. brønd og homogeniseres ved pipettering.
    4. Tilføje 0,75 µL af homogene sæd på 57 x 106/mL (50.000 celler pr. brønd) og homogeniseres ved pipettering.
    5. Dække plade med sort låg.
    6. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C beskyttet mod lys.
    7. Kør prøven gennem flow Flowcytometret med indstillingen ʽmitochondrial aktivitet '.
  3. Acrosomal membran integritet
    Bemærk: FITC-PSA farvning (Se teknik #1) gør det muligt for evalueringen af 3 acrosome kategorier (intakt acrosome, monomers acrosome og beskadigede acrosome). Ved hjælp af flow forskellige og levedygtighed & acrosome integritet kit (PI og FITC-PNA), er at sædcellerne adskilt i disse 3 kategorier.
    1. Tage det ønskede antal boringer fra levedygtighed & acrosome integritet kit-pakken, overføre dem til arbejde base og dække med en fleksibel låg (beskyttelse mod lys).
    2. Tilføje 200 µL af bufferopløsning til flowcytometri pr. brønd.
    3. Tilføje 0,7 µL af homogene sæd på 57 x 106/mL (40.000 celler pr. brønd) og homogeniseres ved pipettering.
    4. Dække plade med sort låg.
    5. Inkuber i 45 min. ved 37 ° C beskyttet mod lys.
    6. Kør prøven gennem flow Flowcytometret med indstillingen ʽInCyte'.
    7. Analysere den resulterende histogram af gating tre markør områder ifølge fluorescens intensitet, der repræsenterer ubetydelig, lav-fluorescerende celler med intakte, unstained acrosome (R1), lav-fluorescerende celler med resterende farvede del af acrosome (R2) og stærkt fluorescerende celler med forstyrret acrosome (R3).
      Bemærk: Brug afsnittet "analysere filer anskaffes ved hjælp af andre moduler" i brugervejledningen til instrument for at skabe de tre regioner (R1, R2, R3).

4. teknik #3: Vurdering af Sperm membraner ved hjælp af fluorescerende sonder og flowcytometri

Bemærk: Brug af annexin V kombineret med PI fluorokromer muliggør vurdering af apoptose og beregningen af andelen af apoptotiske sæd (apoptotiske indeks).

  1. Forberede 1 x annexin V binding buffer fra 20 x stamopløsning (fortyndet 500 µL af annexin V binding buffer 20 x stamopløsning med 9,5 mL sterilt, destilleret vand).
  2. Anslå sædkvalitet ved hjælp af en Neubauer hemocytometer som beskrevet i afsnit 1.7.
  3. Vask 106 sædcellerne i 1 mL af 1 x annexin V binding buffer og centrifugeres ved 300 x g i 10 min.
  4. Opsug supernatanten helt.
  5. Resuspenderes i 100 µL 1 x annexin V binding buffer.
  6. Tilsæt 10 µL af annexin V konjugeret med FITC.
  7. Bland godt og Inkuber i 15 min. i mørke ved stuetemperatur.
  8. Vask sædcellerne ved at tilføje 1 mL af 1 x annexin V binding buffer pr. 106 celler og centrifugeres ved 300 x g i 10 min.
  9. Opsug supernatanten helt.
  10. Resuspenderes celle i 500 µL 1 x annexin V binding buffer pr. 106 samlede celler.
  11. Tilføj 1 µg/mL PI umiddelbart inden analyse med en flow Flowcytometret.
  12. Kør prøven gennem flow forskellige på ʽInCyte'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser samtidige fluorimetri vurdering af sperm membraner (plasma, acrosomal og mitokondriel) ved hjælp af PI, DAPI, FITC-PSA og JC-1. Vurdering af sperm membraner ved hjælp af samtidige farvning med fire fluorescerende sonder tillader for eksempel vurdere andelen af sædceller i hver kategori – live vs døde; høj vs lav ΔΨm; intakt vs. beskadiget acrosome — samtidig for hver sædcelle.

Figur 2 præsenterer resultaterne af sperm membran evaluering ved hjælp af fluorimetri sonder. Kun sæd, der indeholdt mindst 80% motile sædceller blev anvendt i forsøget. Mindst 200 celler blev undersøgt pr. tyr. Det var muligt at vurdere forskelle i stikprøven sædkvalitet i form af membran integritet. For eksempel sæd af tyren no. 7 havde en forholdsvis lille procentdel af døde celler, et lavt antal sædceller med pseudo reagerede acrosome og højere mitokondrielle membran potentiale, i forhold til sæd af tyren no. 1.

Figur 3 viser repræsentative prøver evalueres for levedygtighed (figur 3A-3 C) og mitokondrie-aktivitet (figur 3D-3F). Fluorescens intensiteter af prøverne blev evalueret af en dedikeret microcapillary sperm flow forskellige, med dedikeret software. Dette flow forskellige indeholder en solid-fase blå laser (448 nm) og to fotodioder: videresende scatter og side scatter. Det specifikt måler sperm emission egenskaber med tre photomultiplier rør (grøn: 525/30 nm, gul: 583/26 nm; red: 655/50 nm) og plads til optiske filtre og splittere16. Det giver mulighed for evaluering af 5.000 sædceller pr. analyse.

Levedygtighed evaluering kit indeholder en sonde med differentieret permeabilitet til levedygtige (intakt plasma membran) og døde (beskadigede plasma membran) sædcellerne (figur 3 c). Sperm ΔΨm blev vurderet ved hjælp af et kit, der skelner mellem polariseret mitokondrielle membran (Fluorescens i orange) og depolariseret mitokondrielle membran (Fluorescens i grønt) (figur 3F).

Figur 4 præsenterer en evaluering af acrosome integritet udført med klar-til-brug kit, læse med flowcytometri (tal 4A-4 C), opdele den resulterende histogram af gated sædcellerne i tre markør områder, der repræsenterer ubetydelig lav-fluorescerende celler med intakte, unstained acrosome (R1), lav-fluorescerende celler med resterende farvede del af acrosome (R2), og stærkt fluorescerende celler med forstyrret acrosome (R3).

Tabel 1 præsenterer en sammenligning af de to fluorimetri teknikker til vurdering af sperm membraner. De samme sperm prøver fra tre forskellige tyre blev evalueret for levedygtighed, mitokondrielle membran potentiale (ΔΨm) og acrosome integritet ved hjælp af samtidige firedobbelt farvning samt flowcytometri. Denne sammenligning er meget vigtigt, da det viser matchende resultater ved hjælp af hver af de to teknikker. Data blev analyseret af en analyse og Students t-test. Ingen statistisk signifikante forskelle blev observeret.

Figur 5 viser et repræsentativt udsnit evalueret for apoptose ved hjælp af annexin V (AV) og propidium Iodid (PI) fluorokromer. Brug af disse to sonder kan skelne mellem fire mønstre med angivelse af levedygtige celler (AV-, PI-), tidlige apoptotiske celler (AV +, PI-), apoptotiske celler (AV +, PI +) og nekrotiske celler (AV-, PI +).

Figure 1
Figur 1: epifluorescensmikroskop fotomikrografi af sædcellerne farves samtidig med flere fluorescerende sonder. (A) samtidig farvning med fire sonder PI, DAPI, FITC-PSA og JC-1) (B) levende sædcelle med DAPI farvning af kernen og høj mitokondrielle membran potentiale (ΔΨm), farves med JC-1 sonde. (C) døde sædcelle med beskadigede plasmamembran farves med PI sonde, beskadiget acrosome farves med FITC-PSA sonde og lav ΔΨm. (D) Live, acrosome-reagerede sædcelle med resterende ækvatoriale farvning og lav ΔΨm. (E) Live, acrosome-reagerede sædcelle med resterende øverste farvning og høj ΔΨm. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: vurdering af bull sperm membraner ved hjælp af fluorimetri sonder. (A) Sperm rentabilitet blev fastlagt med fluorescerende sonder 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium Iodid (PI). (B) Acrosome status var bestemt efter FITC-PSA farvning mønstre. Præsenteret er andelen af sædcellerne med monomers acrosome. (C) mitokondrielle membran potentiale (ΔΨm) blev evalueret ved hjælp af med JC-1 fluorescerende sonde og præsenteres som forholdet mellem gennemsnitlig andel af rød-farvede (høje potentiale) og green-farvede (lavt potentiale) sperm. Data præsenteres som procent af celler fra samlede evaluerede celler. Mindst 200 sædcellerne blev analyseret pr. tyr. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: levedygtighed (A-C) og mitokondrie-aktivitet (D-F) Fluorescens vurdering af repræsentative prøver måles af EasyCyte flow Flowcytometret. Histogrammer repræsenterer ungated sædcellerne og vragrester (A, D), gated sædcellerne (B, E), fordeling af sædcellerne at levedygtige (grøn) og døde (rød) celler (C) og fordeling af sædcellerne at polariseret (gul) og depolariseret ( grøn) mitokondrielle membran (F). Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: fluorescens vurdering af acrosome integritet af repræsentative prøver måles af EasyCyte flow Flowcytometret. (A) Histogram af ungated sædcellerne og snavs. (B, C) Histogrammer af gated sædcellerne med evaluering af acrosome integritet udført med klar-til-brug kit, læse med tilpasset indstilling 'InCyte', dividere den resulterende histogram af gated sædcellerne i tre markør, der repræsenterer ubetydelig, lav-fluorescerende celler med intakte, unstained acrosome (R1), lav-fluorescerende celler med resterende farvede del af acrosome (R2) og stærkt fluorescerende celler med forstyrret acrosome (R3). Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Gennemsnitlige nr af celler Vialbility Mitokondrielle membran potentiale Acrosome integritet
Levedygtige Døde Depolariseret Polariseret Rød/grøn forholdet Intakte Acrosome Monomers Acrosome Forstyrret Acrosome
Firedobbelt farvning 253 32.7 ± 1,53% 67.3 ± 1,53% 65,7 ± 2,25% 34.3 ± 2.52% 0,5 ± 0,06 37,3 ± 7,2% 38,0 ± 5,7% 24.3 ± 3.0%
Flow Cytomtery 5.000 32.3 ± 2,08% 67.7 ± 2,08% 65,0 ± 1,00% 35,0 ± 1,00% 0,5 ± 0,02 39,5 ± 5,7% 39,5 ± 6,5% 21.0 ± 8,0%

Tabel 1: sammenligning af de to fluorimetri teknikker til vurdering af sperm membraner. De samme sperm prøver blev evalueret for levedygtighed, mitokondrielle membran potentiale og acrosome integritet ved hjælp af samtidige firedobbelt farvning og flowcytometri. Data præsenteres som betyder andel ± SD af de undersøgte celler, beregnet for 3 replikater.

Figure 5
Figur 5: Annexin V og PI fluorescens af en repræsentativ stikprøve målt ved en flow Flowcytometret. Histogrammer repræsenterer (A) ungated sædcellerne og snavs og (B) fordeling af de låge sædcellerne til tidlig apoptotiske (AV +, PI-), apoptotiske (AV +, PI +), levedygtig (AV-, PI-) og nekrotiske (AV-, PI +) celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sperm befrugtning potentielle afhænger af flere faktorer som afspejler dens kvalitet. En høj koncentration af sædceller og en høj andel af meget gradvis motile sædceller kan anses for høj kvalitet sæd. Dog sådan evaluering tager ikke hensyn til andre cellulære og funktionelle parametre. Brug af 'bænk-top' microcapillary flow forskellige kan tilpasses nemt til evaluering af forskellige sperm strukturer ved hjælp af fluorescerende sonder, som tidligere vist af andre17 og demonstreret heri (teknik #3). For eksempel sperm acrosome integritet er yderst vigtigt for forekomst af vellykket naturlig befrugtning og derfor præcis evaluering af acrosomal status er berettiget. Sådan evaluering kan udføres nemt ved klassificeringen af acrosome status ved hjælp af mønstre af fluorescerende farvning (FITC-PSA, FITC-PNA, dvs., teknik #1, som tidligere beskrevet)1,3. Især, det er meget vigtigt at bestemme andelen af sperm med intakt acrosome (dvs., udstiller en unstained acrosome) i forhold til dem med beskadigede acrosome. Med hensyn til den sidstnævnte, sperm med beskadigede acrosome kan udstille (i) en fuldt farves acrosomal cap, som angiver, at membranen er beskadiget, aktivering farvestof til at flyde gennem membranen ind acrosome vesikel; (ii) acrosome-reagerede sædceller, der udviser kun resterende acrosome indhold, der angiver, at AR opstod allerede (dvs. pseudo AR). Det skal bemærkes, at sådan en evaluering kan også udføres med dedikeret flow Flowcytometret.

Klar-til-brug levedygtighed & acrosome integritet kit definerer både sperm levedygtighed (levedygtige eller død) og acrosomal integritet (intakt eller forstyrret). Her, vi foreslår at bruge dedikerede flow forskellige til at definere de tre ovennævnte acrosomal statusser (dvs., intakt, beskadiget, reagerede). Vi tilpasset microcapillary flow forskellige platform for mere nøjagtig evaluering, som identificerer den acrosome-reagerede sæd (dvs. lav fluorescens) samtidig udelukke dem fra dem, der har forstyrret acrosome (høj fluorescens), snarere end herunder dem med dem, der har en intakt acrosome. Dette giver en præcis del af sperm med funktionelle eller ikke-fungerende acrosome. Sæd med monomers acrosome samt forstyrret acrosomal membranen har mistet deres evne til at befrugte oocyt. Desuden nøjagtig analyse kan kaste lys over mekanismen bag acrosome ændring, dvs, beskadiget acrosome membran vs pseudo acrosome aktivering.

Vi sammenlignet resultaterne med teknik #1 og teknik #2, og fundet stor kompatibilitet mellem dem, især i vurderingen af levedygtighed og ΔΨm (tabel 1). En af de vigtigste fordele ved at bruge den dedikerede flow Flowcytometret er det store antal evaluerede sædcellerne i forhold til det lille antal sædceller, der vurderes i praksis af Fluorescens mikroskopi og sonder (tusindvis vs hundredvis, henholdsvis ). Desuden, den sidstnævnte procedure er tidskrævende og subjektive, selv når de udføres af en erfaren observatør. Som flowcytometri registrerer kun partikel-associerede fluorescens, er der ingen grund til at vaske den ubundne sonde fra den løsning, som er en tidskrævende trin17. På den anden side muliggør fluorimetri vurdering af sperm membraner i teknik #1 beskrevne samtidige vurdering af flere membraner. Vi var i stand til at bruge så mange som fire fluorescerende sonder sammen1,3.

Endelig skal det bemærkes, at den dedikerede flow forskellige blev udviklet som en åben analyse modul, giver alle de grundlæggende værktøjer til prøven erhvervelse og data analyse. Erhvervelse funktion gør det muligt at indsamle forskellige typer af oplysninger fra en celle prøve og derfor giver tilpasning til mere nøjagtig evaluering, som vist her for acrosome status og apoptotiske indeks.

Til sidst, er de metoder, der er beskrevet i denne hvidbog meget nyttige til vurdering af sædkvalitet. Undersøge sædcelle membraner er meget vigtige til bestemmelse af sperm befrugtning kompetence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke "SION" israelsk selskab for kunstig befrugtning og opdræt (Hafetz-Haim, Israel) for deres hjælp og samarbejde og Ms. Li Na (IMV teknologier, L'Aigle, Frankrig) for at få hjælp med opsætning af instrument og uddannelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] Sigma M1254
PBS Sigma P5493
DMSO Sigma D2438
Ethanol absolute Sigma 64-17-5
Hemacytometer Neubauer Germany hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542 fluorescent probe
PI (propidium iodide ) Sigma P4170 fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) Sigma L0770 fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) ENZOBiochem, New York, NY, USA ENZ52304 fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC MACS, Miltenyi Biotec 130-093-060 fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20x stock solution MACS, Miltenyi Biotec 130-092-820 buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u Nikon, Tokyo, Japan inverted fluorescence microscope
Nis Elements Nikon, Tokyo, Japan software
Nikon DXM1200F Nikon, Tokyo, Japan digital camera
Guava EasyCyte Plus IMV Technologies, L'Aigle, France microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies software
Buffered solution for cytometry IMV Technologies, L'Aigle, France 023862 buffer
Viability and concentration kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024708 kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024864 kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 025293 kit for acrosome integrity assessment
JMP-13 SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA software
Bovine sperm "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 141 Sperm acrosome reaktion mitokondrielle membran potentiale plasma membran fluorescerende sonde flowcytometri sæd evaluering
Fluorimetri teknikker til vurdering af Sperm membraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Komsky-Elbaz, A., Roth, Z.… More

Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes. J. Vis. Exp. (141), e58622, doi:10.3791/58622 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter