Summary
כאן, אנו מציגים מתודולוגיות להעריך spermatozoan הקרומיות, הסלולר תכונה המשויכת מיומנות ההפריה של הזרע. אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה fluorimetric של זרע ממברנות: צביעת בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות cytometry זרימה זרע ייעודיים מתקדמים. דוגמאות של שילוב מתודולוגיות של מוצגים.
Abstract
Spermiograms סטנדרטית המתארת איכות הזרע מתבססים בעיקר על הפרמטרים פיזיולוגיים וחזותית, כמו לפלוט נפח, ריכוז, תנועתיות, תנועתיות מתקדמת, ו זרע-מורפולוגיה הכדאיות. עם זאת, הערכות אלה לא מספיק טוב כדי לנבא את איכות הזרע. בהתחשב בכך תחזוקה של זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה תלוי הקרומיות ופונקציונליות תאיים, הערכה של פרמטרים אלה עשויות לאפשר חיזוי טוב יותר של מיומנות ההפריה של הזרע. כאן, אנו מתארים שלוש שיטות האפשריים כדי להעריך את איכות הזרע שימוש ספציפי הגששים פלורסנט בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ או לזרום cytometry ניתוחים. ניתוחים העריכו propidium יודיד (PI), הקרומיות acrosomal באמצעות fluorescein מצומדת isothiocyanate של קרום פלזמה תקינות באמצעות 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) אפון השדה agglutinin (FITC-PSA) ו מיטוכונדריאלי הקרומיות באמצעות 5, 5', 6, 6'-טטרה-כלורו-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1). שילובים של שיטות אלה מוצגים. למשל, השימוש annexin V בשילוב עם PI fluorochromes מאפשר הערכת אפופטוזיס וחישוב שיעור אפופטוטיים להיפגע זרע (אפופטוטיים להיפגע אינדקס). אנו מאמינים כי שיטות אלה, אשר מבוססים על בחינת ממברנות תא זרע, הם מאוד שימושי עבור הערכת איכות הזרע.
Introduction
שלמות והפונקציונליות של ממברנות זרע הם כמה הגורמים המציין זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה. קרום פלזמה משמש כמחסום בין תאים תאיים, חוץ-תאית, ובכך שמירה על שיווי משקל osmotic הסלולר1. מתח שגורם נזק שלמות קרום פלזמה עלול לפגום הומאוסטזיס, תצמצם הקיבולת הכדאיות, הפריה ולהגדיל מוות של תאים. למשל, הקפאה קריוגנית מפחיתה את הכדאיות זרע עקב נזק שלה קרום פלזמה, עקב שינויי טמפרטורה ומתח osmotic2. בעבר דיווחנו כי חשיפת זרע בול ריכוזים נמוכים של והקאה מזהמים כגון מסוג אטרזין של חומרי הדברה, diaminochlorotriazine העיקריים המטבוליט שלה או את aflatoxin mycotoxin B1, מפחית את הזרע הכדאיות1,3 . זה נקבע על-ידי תיוג ה-DNA גדילי כפול עם דאפי בשילוב עם PI, אשר נקשר ה-DNA של תאים עם קרום פלזמה פגום.
תגובה acrosome (AR) כרוך פיוז'ן של קרום acrosome החיצוני של קרום פלזמה שמעליה וכתוצאה מכך שחרורו של אנזימים acrosomal4,5. אלה אירועים חיוני עבור חדירה zona-pellucida ומיזוג נוסף של הזרע עם oocyte6. לכן, הערכת הקרומיות acrosomal מהווה פרמטר שימושי כדי להעריך את איכות תאי הזרע ואת פוריות הגבר-7,-8,-9. מספר טכניקות פלורסנט מתאימים עבור אימות תקינות acrosome, FITC-הרשות הפלסטינית או FITC-PSA8,10. במחקרים קודמים שלנו, באמצעות דפוסי FITC-PSA מכתימים1,3, סיפק הגדרות מדויקות עבור (i) acrosome ללא פגע, (ii) פגום acrosome ממברנה ואנו (iii) הגיב acrosome. בדו ח הנוכחי, לנו להעריך את מצב acrosome באמצעות cytometry זרימה ייעודיים זרע ולהשוות את התוצאות לאלה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
המיטוכונדריה הם רב תכליתיים organelles מעורב ב, בין אחרים דברים, ATP סינתזה, ייצור מינים חמצן תגובתי, סידן איתות אפופטוזיס. תפקוד פיזיולוגי, כולל פוריות זכר ונקבה, הם קשורים פונקציה מיטוכונדריאלי שונה11. זרע המיטוכונדריה מסודרים של midpiece, לשחק תפקיד מכריע תנועתיות הזרע12. זה מקובל גם גבוהה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (ΔΨm) מזוהה עם נורמלי תנועתיות הפריה גבוהה קיבולת13. לעומת זאת, ΔΨm נמוכה קשורה עם רמה גבוה של מינים חמצן תגובתי שומן מופחתת הפריה שיעור14. בכל זאת, תרכובות סביבתיים שונים, למשל האנדוקרינית משבשים, יכול לגרום מתח סלולארית, להוביל גידול ארעי של ΔΨm, hyperpolarization1,3, ייצור מוגבר של רדיקלים חופשיים, בסופו של דבר. אפופטוזיס15. החללית פלורסנט 5, 5', 6, 6'-טטרה-כלורו-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1) מאפשר בחינת לדוגמה, את ההשפעות של רעלים והקאה על זרע ΔΨm1,3.
Spermiograms סטנדרטי, בהתבסס על פרמטרים פיזיולוגיים, מורפולוגיים, אינם טובים מספיק לחזות ספירת זרע. שיטות מדויקות יותר נדרשים כדי להבטיח את איכות הזרע. כאן, אנו מספקים שתי שיטות האפשריים כדי לקבוע את איכות הזרע בהתבסס על הערכות של זרע ממברנות: צביעת מרובע בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופ פלורסצנטיות, תיאר ב שלנו מחקרים1,3 cytometry זרימה מתקדמות ייעודיים זרע, מנוצל לאחרונה המעבדה שלנו, כבר נמצא בשימוש על-ידי אחרים16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ישראל 1994 עבור רווחת בעלי חיים. זרע שור סופקו על ידי חברה ישראלית מסחרית עבור הזרעה והשבחה. שופך של שוורים 11 הוערכו במחקר זה.
1. זרע מדגם הכנה
הערה: התהליך מבוסס על המעבדה רוט פרוטוקול1,3.
- להשיג כ 1-6 מ"ל של שור מאודה בשפופרת 15 מ"ל בטמפרטורת החדר.
- כל 1 מ של זרע, להוסיף 6 מ של NKM prewarmed (ב- 37 מעלות צלזיוס) מאגר (110 מ מ NaCl, 5 מ מ. אשלגן כלורי, 20 מ מ מגבים [חומצה 3-N-morphilino propanesulfonic; pH 7.4]), צנטריפוגה במשך 8 דקות ב 600 x גרם, 1 – 2 פעמים עד תגובת שיקוע לנקות.
הערה: אם ריכוז הזרע או אמצעי האחסון הראשונית הן גבוהות מאוד, לפצל שני צינורות ברחיצת הראשון. - מיד להסיר, למחוק את תגובת שיקוע ברור ולהשאיר כ 1 ס מ של תגובת שיקוע מעל בגדר.
- בזהירות להישען על הצינורות בזווית של 30 מעלות כדי להגדיל את שטח הפנים לזרע לשחות במעלה ולהמתין 20 – 30 דקות כדי לאפשר spermatozoa לשחות במעלה ב 37 º C.
הערה: ניתן לראות עכירות. - באמצעות micropipette של בקפידה, להסיר את העליון 1 מ"ל של תגובת שיקוע המכילה את תאי spermatozoa על צינור 1.5 מ.
- לשמור את הזרע ב 37 ° C עד השימוש.
- מעריכים את ספירת הזרע באמצעות hemocytometer נויבאואר.
הערה: תא ספירה שונות יכול לשמש במקום, אך הספירה שונה.- כדי למנוע תנועה תא זרע, לדלל 100 µL של spermatozoa תאי עם 10 מ ל מים מזוקקים כפול (DDW) (דילול מטריים) צינור 15 מ"ל ומערבבים בעדינות.
- טען µL 10 המדגם בכל צד של hemocytometer ושל coverslip. לוודא למנוע היווצרות בועה בתוך החדר כמו התוצאה עשויה ספירת זרע לא מדויק.
- להתבונן במיקרוסקופ מתחם עם יעד X 20.
הערה: הרשת מלאה ב- hemocytometer מכילה 9 ריבועים גדולים, לכל 1 מ2, coverglass נח 0.1 מ מ מעל הרצפה של החדר. לפיכך, אמצעי האחסון מעל אזור הספירה המרכזי נמצא 0.1 מ מ3 או 0.1 µL. האזור המרכזי של hemocytometer מכיל 25 ריבועים בינוני, כל ריבוע בינוני יש 16 ריבועים קטנים יותר עם שורות בודדות. - לספור את המספר הכולל של תאים נמצא 4 ריבועים פינה בינוני, הכיכר המרכזית. לקבלת דיוק גבוה יותר, נחשב שני תאים (משני הצדדים של hemocytometer נויבאואר) ושימוש הממוצע לחישוב התא ריכוז.
- לחשב את ספירת הזרע על-ידי הכפלת המספר אומר שהושג על ידי 5 (כדי לקבל את מספר התאים לפי ספירת אזור) ועל ידי 10,000 (כדי לקבל את מספר התאים לכל 1 מ של דגימה מדולל). ואז להכפיל את ספירת שהושג על ידי הגורם דילול (1: 100).
הערה: לדוגמה, מספר ממוצע של זרע במניין 5 הריבועים בינונית 25 בתוך אזור הספירה המרכזית של שני תאים הוא 150 ([152 + 148] / 2). לכן, המספר הממוצע של תאי זרע לכל קאמרית (או לכל 0.1 µL) הוא 150 x 5 = 750. הכפל 750 מאת 10,000 כדי להשיג מספר התאים לכל 1 מ של דגימה מדולל (7,500,000) ולאחר מכן להכפיל ב- 100 (דילול פקטור) כדי לקבל 75 x 107 תאים לכל מיליליטר דגימת זרע המקורי.
2. טכניקת #1: הערכת סימולטני של ממברנות הזרע באמצעות פלורסנט מרובים רגשים
הערה: זרע ממברנות (פלזמה, acrosomal ו מיטוכונדריאלי) היו העריכו כאמור שתואר על ידי Celeghini et al.10, עם מספר שינויים. מיקרוסקופ פלורסנטי שימש, בשילוב עם מצלמה דיגיטלית עם עירור ב- 450-490 nm, פליטה-515-565 nm באמצעות מסנן משולש.
-
להכין מלאי פתרונות.
- להכין 0.1 מ"ג/מ"ל דאפי פתרון מניות על ידי המסת 5 מ"ג של דאפי ב 50 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS). להכין 50 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C. לפני השימוש, לדלל את הפתרון מניות עם PBS ב 1:10 (הפתרון עובד; 10 µg/mL).
- להכין 1 מ"ג/מ"ל FITC – PSA פתרון מניות על ידי המסת 1 מ ג של FITC – PSA ב 1 מ"ל ל- PBS. להכין 50 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C. לפני השימוש, לדלל את הפתרון מניות עם PBS ב 1:10 (הפתרון עובד; µg 100/mL).
- להכין פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל JC-1 על ידי המסת 1 מ ג של JC-1 ב 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). להכין 10 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C. לפני השימוש, לדלל את הפתרון מניות עם דימתיל סולפוקסיד ב 1:10 (הפתרון עובד; 0.1 מ"ג/מ"ל).
- להכין את הפתרון PI מניות על ידי המסת 10 מ ג של PI ב µL 400 ל- PBS (ויתור 2.5 מ"ג/מ"ל). החנות + 4 ° C. לדלל מניות 1 עם PBS ב 1:20 (הפתרון עובד; 0.125 מ"ג/מ"ל). לאחסן ב +4 ° C כפתרון מניות.
התראה: פאי מוטגן פוטנציאליים, צריך להיות מטופל לטיפול. לצבוע יש להמית בבטחה ובהתאם ישימים תקנות מקומיות.
- העברה 133 µL של spermatozoa תאי (שלב 1.5) צינור 1.5 מ ל (25 x 106 זרע/mL).
הערה: אם מדגם ריכוז גבוהה, למהול אותו במאגר NKM כדי להשיג את הריכוז הנדרש; אם הריכוז מדגם של השחייה את הדגימה היא נמוכה יותר, centrifuge את תגובת שיקוע שהושג לאחר שחייה עד 1,000 x g עבור 5 דקות, להסיר 0.5 מיליליטר תגובת שיקוע, לספור את הזרע שוב. - להוסיף µL 17 של דאפי (הפתרון עובד), תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 º C.
- צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
- כדי בגדר, להוסיף 100 µL NKM מאגר.
- להוסיף 50 µL של FITC – PSA, 2 µL של JC-1 ו- 3 µL של PI (עובד פתרונות) ואת תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 º C.
- צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
- כדי בגדר, להוסיף 40 µL מאגר NKM, resuspend על ידי pipetting.
- להעביר 10 µL של המדגם שקופיות זכוכית, השמצות, coverslip.
-
לדמיין באופן מיידי על ידי מיקרוסקופ epifluorescence (שימוש 40 x המטרה) עם מסנן משולש, מצויד with a מצלמה דיגיטלית, ללכוד תמונה בנפרד עבור כל מסנן.
הערה: יש משמעות לסדר מסננים דמיינו.- דמיינו תחת דאפי ערוץ עם עירור ב 358 nm, פליטה-461 ננומטר.
- דמיינו תחת FITC ערוץ של מונומרים ירוק עם עירור ב 450 – 490 nm, פליטה-515-565 ננומטר.
- דמיינו תחת PI ערוץ למצרפי אדום עם עירור-488 ננומטר, פליטה-590 ננומטר.
- דמיינו תחת JC-1 אגרגטים אדום עם עירור 559 ננומטר, ואת פליטת בטווח של 574 – 627 ננומטר; JC-1 מונומרים ירוק עם עירור 488 ננומטר, פליטה בטווח של 500 – 535 nm.
- מיזוג תמונות שלוש קיבל את המסננים בפורמט JPG/JPEG, באמצעות האפשרות "מיזוג" של תוכנת המצלמה.
- לפתוח את התמונה הממוזגת בכלי "צבע", השתמש באפשרות ' מברשת ' כדי לסמן spermatozoa שנספרו.
-
לסווג את spermatozoa מבוסס על קרינה פלואורסצנטית הנפלטים כל בדיקה:
- להעריך באופן כללי את spermatozoa לפחות 200 לכל שקופית — כל התאים מופיעים כחול (דאפי).
- הערכת הכדאיות על ידי ספירת תאים מתים, אשר מופיעים סגול (PI [אדום] + [כחול] דאפי) ולחשב את האחוז של תאים מתים (מת תאים/סה כ לספור תאים x 100).
- הערכת מצב acrosome באמצעות דפוסי פלורסנט מכתים (FITC – PSA). לחשב את האחוזים של הדפוסים שונים (ללא פגע, פגום או יפעלו ויגיבו acrosome תאים/סה כ לספור תאים x 100).
הערה: קרום acrosomal פגום מופיע בתור כובע acrosome ירוקה, מוכתמים לחלוטין; קרום acrosomal יפעלו ויגיבו מראה שיורית ירוק המשוונית או העליון מכתימה; תאים המכילים ממברנה acrosomal שלם לא תערוכת כל מכתים הירוק של האזור acrosomal. - הערכת ΔΨm על ידי הבחנה spermatozoa עם ΔΨm גבוהה, אשר מוצג על midpiece המוכתמות באדום, spermatozoa עם ΔΨm נמוך, אשר מוצג midpiece מוכתם ירוק. סופר אדום ירוק midpieces בנפרד, לחשב את היחס (אדום/ירוק).
3. טכניקה #2: הערכה של ממברנות זרע עם ערכות מוכנות לשימוש, Cytometry זרימה
הערה: הערכה של קרום פלזמה שלמות, מיטוכונדריאלי הקרומיות קרום פוטנציאליים, acrosomal בוצעה עם ערכות cytometry זרימה מוכן לשימוש המכיל fluorochromes lyophilized כל היטב. ההליך בוצע על פי היצרנים עם מספר שינויים.
-
הערכת תקינות קרום פלזמה
- . קח את המספר הרצוי של בארות מהחבילה של ערכת הכדאיות וריכוז (PI ו- SYbr14), להעביר אותם בסיס עבודה ומכסים עם מכסה גמיש (להגן מפני אור).
- הוסף 199 µL של פתרון במאגר עבור cytometry לכל טוב.
- להוסיף 1 µL של זרע הומוגניות-57 x 106/mL (57,000 תאים לכל טוב), homogenize על ידי pipetting.
- מכסים את הצלחת עם מכסה שחור.
- תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
- תריצי את הדגימה דרך cytometer זרימה ההגדרה 'פנוי'.
-
מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית
- . קח את המספר הרצוי של בארות מהחבילה של ערכת פעילות מיטוכונדריאלי (JC-1), להעביר אותם בסיס עבודה ומכסים עם מכסה גמיש (להגן מפני אור).
- להוסיף 10 µL של כוהל מוחלט לכל טוב, פיפטה כדי resuspend את האבקה נוכח בתוך הבאר.
- הוסף µL 190 ל- PBS לכל טוב, homogenize על ידי pipetting.
- הוסף µL 0.75 של זרע הומוגניות-57 x 106/mL (50,000 תאים לכל טוב), homogenize על ידי pipetting.
- מכסים את הצלחת עם מכסה שחור.
- תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
- תריצי את הדגימה דרך cytometer זרימה עם הפעילות ʽmitochondrial ' הגדרה '.
-
הקרומיות acrosomal
הערה: FITC – PSA מכתים (ראה טכניקת #1) מאפשר הערכת 3 קטגוריות acrosome (acrosome ללא פגע, יפעלו ויגיבו acrosome ו- acrosome פגום). באמצעות זרימת cytometer ואת הכדאיות & ערכת שלמות acrosome (PI ו- FITC – הרשות הפלסטינית), spermatozoa מופרדים בקטגוריות אלה 3.- . קח את המספר הרצוי של בארות מהחבילה של ערכת שלמות הכדאיות & acrosome, להעביר אותם בסיס עבודה ומכסים עם מכסה גמיש (להגן מפני אור).
- להוסיף 200 µL של פתרון במאגר עבור cytometry לכל טוב.
- הוסף µL 0.7 של זרע הומוגנית-57 x 106/mL (40,000 תאים לכל טוב), homogenize על ידי pipetting.
- מכסים את הצלחת עם מכסה שחור.
- תקופת דגירה של 45 min ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
- תריצי את הדגימה דרך הזרימה cytometer עם ʽInCyte ההגדרה '.
- לנתח את תוצאות היסטוגרמה ידי gating בשלושה תחומים סמן לפי עוצמת קרינה פלואורסצנטית, המייצג זניח, נמוך-ואזוריט תאים עם שלם, מוכתם acrosome (R1), נמוך-ואזוריט תאים עם ממסר צבעונית חלק acrosome (R2) ו תאים מאוד ואזוריט עם שיבשו acrosome (R3).
הערה: השתמש במקטע "ניתוח קבצים שנרכשו באמצעות מודולים אחרים" במדריך למשתמש מכשיר על מנת ליצור את האזורים שלוש (R1, R2, R3).
4. טכניקה #3: הערכה של ממברנות הזרע באמצעות המחקרים פלורסנט וכל Cytometry זרימה
הערה: השימוש annexin V בשילוב עם PI fluorochromes מאפשר הערכת אפופטוזיס וחישוב שיעור אפופטוטיים להיפגע זרע (אפופטוטיים להיפגע אינדקס).
- להכין 1 x annexin V מאגר איגוד מ 20 x מניות פתרון (שתדללו µL 500 של annexin V איגוד מאגר 20 x פתרון מניות עם 9.5 מ ל מים מזוקקים סטריליים).
- מעריכים את ספירת הזרע באמצעות hemocytometer נויבאואר כמתואר בסעיף 1.7.
- רחץ 106 spermatozoa ב 1 מ"ל של 1 x annexin V איגוד מאגר, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.
- תשאף את תגובת שיקוע לחלוטין.
- Resuspend בגדר ב µL 100 1 x annexin V איגוד מאגר.
- להוסיף 10 µL של annexin V מצומדת כדי FITC.
- מערבבים היטב, תקופת דגירה של 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
- לשטוף spermatozoa על-ידי הוספת 1 מ"ל 1 x annexin V איגוד מאגר לכל 106 תאים ו צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 10 דקות.
- תשאף את תגובת שיקוע לחלוטין.
- Resuspend בגדר תא ב- 500 µL 1 x annexin V איגוד מאגר לכל 106 תאים הכולל.
- להוסיף 1 µg/mL PI מייד לפני ניתוח עם cytometer זרימה.
- תריצי את הדגימה דרך cytometer זרימה על ʽInCyte'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מראה fluorimetric בו זמנית הערכה של זרע ממברנות (פלזמה, acrosomal ו מיטוכונדריאלי) שימוש PI, דאפי, FITC-PSA, JC-1. הערכה של ממברנות הזרע באמצעות צביעת בו זמנית עם ארבעה מכשירי בדיקה פלורסנט מאפשר, לדוגמה, הערכת שיעור זרע בכל קטגוריה – חיים לעומת המלח; גבוה לעומת נמוך ΔΨm; שלם vs. נזק acrosome — בו-זמנית עבור כל תא זרע.
איור 2 מציג את התוצאות של הזרע ממברנה הערכה באמצעות fluorimetric הגששים. רק זרע שהכילה לפחות 80% spermatozoa תאי שימשו את הניסוי. לפחות 200 תאים נבחנו לכל בול. ניתן להעריך את ההבדלים באיכות זרע מדגם מבחינת הקרומיות היה. לדוגמה, בזירמה בול מס ' 7 היה אחוז נמוך יחסית של תאים מתים, שיעור נמוך של זרע עם פסאודו הגיב acrosome, גבוהה יותר מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית, לעומת בזירמה בול מס ' 1.
איור 3 מראה מדגמים מייצגים שחושבה עבור הכדאיות (איור 3 א–3 ג) ופעילות מיטוכונדריאלי (איור 3D–3F). עוצמות קרינה פלואורסצנטית הדגימות הוערכו על ידי microcapillary ייעודי cytometer זרימת הזרע תמונות, עם תוכנה ייעודית. Cytometer זרימה זו מכילה מוצק-שלב אחד לייזר כחול (448 ננומטר) ו- photodiodes שני: קדימה פיזור ופיזור בצד. זה במיוחד מודד מאפיינים פליטת זרע עם שלושה צינורות האופטיקה (ירוק: 525/30 ננומטר, צהוב: 583/26 ננומטר; אדום: 655/50 ננומטר) ואת מסתגלת מפצלי ומסננים אופטי16. היא מאפשרת הערכה של spermatozoa 5,000 לכל ניתוח.
ערכת הערכה הכדאיות מכיל בדיקה עם חדירות דיפרנציאלית קיימא (ללא פגע קרום פלזמה) ואת המלח (קרום פלזמה פגום) spermatozoa (איור 3C). ΔΨm זרע הוערכה באמצעות ערכת המבדילה בין מקוטב מיטוכונדריאלי ממברנה (זריחה המופיעים כתום), depolarized מיטוכונדריאלי ממברנה (זריחה המופיעים ירוק) (איור 3F).
איור 4 מציג הערכה של שלמות acrosome עם ערכת מוכנות לשימוש, לקרוא את cytometry זרימה (4A דמויות–4 C), חלוקת ההיסטוגרמה תוצאות של spermatozoa מגודרת בשלושה תחומים עיקריים, סמן המייצג התאים נמוך-ואזוריט זניח עם שלם, מוכתם acrosome (R1), התאים נמוך-ואזוריט עם ממסר צבעונית חלק acrosome (R2), תאים מאוד ואזוריט עם שיבשו acrosome (R3).
טבלה 1 מציגה השוואה של שני fluorimetric טכניקות הערכה של ממברנות זרע. דגימות זרע אותו מן שלושה פרים שונים הוערכו הכדאיות, מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (ΔΨm), acrosome תקינות באמצעות צביעת מרובע בו זמנית וכן cytometry זרימה. השוואה זו חשוב מאוד, זה מראה את התוצאות תואמות באמצעות כל אחת שתי הטכניקות. הנתונים נותחו על ידי ניתוח מבחן t של סטודנט. אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו.
איור 5 מציג מדגם מייצג עבור אפופטוזיס באמצעות annexin V (AV) ו- propidium יודיד (PI) fluorochromes. השימוש של שני אלה רגשים מאפשר הבחנה בין ארבעה דפוסים המציינת את התאים קיימא (AV-, PI-), בתאים אפופטוטיים להיפגע מוקדם (AV +, PI-.), מוות תאי (AV +, PI +.) ותאים נמק (AV-, PI +.).
איור 1: Epifluorescence photomicrography של spermatozoa צבעונית בו זמנית עם מספר הגששים פלורסנט. (א) Simultaneous מכתים עם ארבעה מכשירי בדיקה PI, דאפי, FITC-PSA, JC-1) (B) בשידור חי תא זרע עם דאפי מכתים של גרעין, גבוהה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (ΔΨm), מוכתם בדיקה JC-1. (ג) מת תא זרע עם קרום פלזמה פגום מוכתם בדיקה PI, פגומים acrosome מוכתמים FITC-PSA החללית ואת ΔΨm נמוכה. (ד) בשידור חי, הגיב acrosome תא זרע עם צביעת המשוונית שיורית, ΔΨm נמוכה. (E) בשידור חי, הגיב acrosome תא זרע עם צביעת העליון שיורית, ΔΨm גבוהה. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הערכה של ממברנות זרע בול באמצעות הגששים fluorimetric. (א) זרע הכדאיות נקבע עם הגששים פלורסנט 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), propidium יודיד (PI). Acrosome (B) המצב נקבע על-פי דפוסי מוכתמים FITC-PSA. הציגו הם חלקם של spermatozoa עם acrosome יפעלו ויגיבו. (ג) מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (ΔΨm) הוערך באמצעות עם בדיקה פלורסנט JC-1 ואת הציג כיחס בין רשע אחוז המוכתמות באדום (פוטנציאל גבוה) שהוכתמו ירוק זרע (פוטנציאל נמוך). הנתונים מוצגים אחוזים של תאים מחוץ לתאים הערכה מוחלט. לפחות 200 spermatozoa נותחו לכל בול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הכדאיות (A-C) והערכה פלורסצנטיות פעילות מיטוכונדריאלי (D-F) של מדגמים מייצגים נמדדת EasyCyte זרימה cytometer. היסטוגרמות מייצגים ungated spermatozoa ו spermatozoa פסולת (A, D), מגודרת (B, E), חלוקת spermatozoa קיימא (ירוק) ותאים מתים (אדום) (C), והפצה של spermatozoa מקוטב (צהוב) ו depolarized ( ממברנה מיטוכונדריאלי ירוק) (F). גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: זריחה הערכה של acrosome שלמות של מדגמים מייצגים נמדדת EasyCyte זרימה cytometer. (א) היסטוגרמה של ungated spermatozoa ופסולת. (B, C) היסטוגרמות של spermatozoa מגודרת עם הערכה של שלמות acrosome עם קיט מוכן לשימוש, לקרוא עם הגדרת מותאם 'InCyte', חלוקת ההיסטוגרמה תוצאות של מגודרת spermatozoa לאזורים סמן 3, המייצג זניח, התאים נמוך-ואזוריט עם acrosome ללא פגע, וללא רבב (R1), התאים נמוך-ואזוריט עם ממסר צבעונית חלק acrosome (R2) והתאים מאוד ואזוריט עם משובשות acrosome (R3). גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| לא ממוצע של תאים | Vialbility | פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי | Acrosome תקינות | ||||||
| קיימא | מת | Depolarized | מקוטב | יחס אדום/ירוק | Acrosome ללא פגע | Acrosome יפעלו ויגיבו | Acrosome קטועים | ||
| צביעת קוודרופל (לארבעה) | 253 | 32.7 ± 1.53% | 67.3 ± 1.53% | 65.7 ± 2.25% | 34.3 ± 2.52% | 0.5 ± 0.06 | 37.3 ± 7.2% | 38.0 ± 5.7% | 24.3 ± 3.0% |
| Cytomtery זרימה | 5,000 | 32.3 ± 2.08% | 67.7 ± 2.08% | 65.0 ± 1.00% | 35.0 ± 1.00% | 0.5 ± 0.02 | 39.5 ± 5.7% | 39.5 ± 6.5% | 21.0 ± 8.0% |
טבלה 1: השוואה בין שני fluorimetric טכניקות הערכה של ממברנות זרע. דגימות זרע באותו הוערכו על הכדאיות, מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית ושלמות acrosome באמצעות צביעת מרובע בו זמנית cytometry זרימה. הנתונים מוצגים אומר SD ± פרופורציה של תאי שנבדקו, מחושב עבור משכפל 3.
איור 5: Annexin V ו- PI זריחה של מדגם מייצג נמדדת זרימה cytometer. היסטוגרמות מייצגים (א) ungated spermatozoa, פסולת והפצה (B) של spermatozoa מגודרת כדי מוות מוקדם (AV +, PI-), מוות (AV +, PI +), בר קיימא (AV-, PI-) נמק (AV-, PI +) תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פוטנציאל הפריה זרע תלויה בגורמים מרובים המשקף את איכותם. ריכוז גבוה של spermatozoa, שיעור גבוה של spermatozoa מאוד בהדרגה תאי עשוי להיחשב זרע באיכות גבוהה. למרות זאת, כזה הערכה לא לקחת בחשבון פרמטרים אחרים התאית ופונקציונליים. השימוש microcapillary 'ספסל-top' זרימת cytometer ניתן להתאים בקלות להערכה של מבנים זרע שונים באמצעות הגששים פלורסנט, כפי שמוצג בעבר על-ידי אחרים17 והפגינו בזאת (טכניקה #3). לדוגמה, זרע acrosome תקינות חשוב במיוחד עבור המופע של דישון טבעי מוצלח, לכן, הערכה מדויקת של מצב acrosomal היא מוצדקת. הערכה כזה יכול להתבצע בקלות על ידי סיווג של מצב acrosome באמצעות דפוסי פלורסנט מכתים (FITC-PSA, FITC-הרשות הפלסטינית, קרי, טכניקה #1, כפי שתואר לעיל)1,3. בפרט, זה מאוד חשוב לקבוע את הפרופורציה של זרע עם שלם acrosome (קרי, תערוכות של acrosome וללא רבב) ביחס לאלה עם acrosome פגום. עם כל הכבוד ל הזרע האחרון, עם acrosome פגום יכול התערוכה קאפ acrosomal (i) מוכתם באופן מלא, המציין הקרום פגום, שמאפשר לצבוע לזרום דרך הקרום לתוך שלפוחית acrosome; (ii) זרע acrosome הגיב כי התערוכה בלבד acrosome שיורית תוכן, המציין כי AR כבר התרחשה (קרי, פסאודו AR). יצוין, הערכה כזה יכול להתבצע גם עם cytometer זרימת ייעודי.
הקיט שלמות מוכנות לשימוש הכדאיות & acrosome מגדיר שני הכדאיות זרע (קיימא או מת) acrosomal שלמות (שלמים או קטועים). כאן, אנו ממליצים להשתמש cytometer את זרימת ייעודי כדי להגדיר את שלושת המצבים acrosomal הנ ל (כלומר, ללא פגע, פגום, הגיב). שינינו הפלטפורמה cytometer microcapillary זרימה הערכה מדויקת יותר, אשר מזהה את הזרע הגיב acrosome (קרי, נמוך קרינה פלואורסצנטית) תוך כדי להוציא אותם מן אלה עם acrosome שיבשו (זריחה גבוהה), ולא כולל אותם עם אלה שיש להם acrosome ללא פגע. זה נותן על פרופורציה מדויקת של זרע עם acrosome תפקודית או מתפקד. זרע עם יפעלו ויגיבו acrosome, כמו גם שיבשו ממברנה acrosomal איבדו את היכולת שלהם לדשן את oocyte. יתר על כן, ניתוח מדויק עשוי לשפוך אור על המנגנון שבבסיס שינוי acrosome, דהיינו, פגומים acrosome ממברנה לעומת הפעלת acrosome מדומה.
אנחנו והשוו את התוצאות שהושגו עם טכניקה #1 ו- 2 # טכניקה, וניתן למצוא תאימות הגדול ביניהם, בפרט בהערכה של הכדאיות ואת ΔΨm (טבלה 1). אחד היתרונות העיקריים של שימוש cytometer זרימת ייעודי הוא המספר הגדול של spermatozoa הערכה ביחס המספר הקטן של spermatozoa זה מוערכות בפועל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ וזונדים (אלפי לעומת מאות, בהתאמה ). יתר על כן, הנוהל האחרון הוא סובייקטיבי, ועתירת אפילו כאשר מבוצעת על ידי משקיף מנוסה. כפי cytometry זרימה רק מזהה חלקיקים-הקשורים פלורסצנטיות, יש צורך לשטוף את החללית לא מאוגד מהפתרון, המהווה צעד גוזלת זמן17. מצד שני, ההערכה fluorimetric של ממברנות הזרע המתוארים טכניקה #1 מאפשר הערכה בו זמנית של ממברנות מרובים. הצלחנו להשתמש הגששים פלורסנט לארבע יחד1,3.
לבסוף, יצוין כי cytometer זרימה ייעודי פותחה מודול של assay פתוח, מתן כל הכלים הבסיסיים עבור רכישת המדגם וניתוח נתונים. הפונקציה רכישה מאפשר איסוף סוגים שונים של מידע מתוך דגימת תאים ושל ולכן מאפשר עיבוד להערכה מדויקת יותר, כפי שמוצג כאן עבור אינדקס ומעמד מוות acrosome.
לסיכום, למתודולוגיות המתוארים במסמך זה הם מאוד שימושי עבור הערכת איכות זרע. בחינת תא זרע ממברנות חשובה מאוד לקביעת כשירות הפריה זרע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי ישנם שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות "שיאון" חברה ישראלית עבור הזרעה והשבחה (חפץ-חיים, ישראל) על עזרתם שיתוף פעולה, ואת גברת Li Na (IMV טכנולוגיות, l ' aigle, צרפת) לקבלת סיוע עם כלי התקנה, הדרכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20x stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
