Summary
Her presenterer vi metoder for å evaluere spermatozoan membran integritet, en cellular funksjon knyttet sperm befruktning kompetanse. Vi beskriver tre teknikker for fluorimetric vurdering av sæd membraner: samtidige flekker med bestemte fluorescerende sonder, fluorescens mikroskopi og avanserte sæd-dedikert flowcytometri. Eksempler på kombinerte metodikkene er også presentert.
Abstract
Standard spermiograms som beskriver kvaliteten er stort sett basert på fysiologiske og visuelle parametere, for eksempel ejaculate volum og konsentrasjon, motilitet og progressiv motilitet, og sæden morfologi og levedyktighet. Men er ingen av disse vurderingene god nok til å forutsi sædkvalitet. Gitt at vedlikehold av sæd levedyktighet og gjødsling potensielle avhenger av membran integritet og intracellulær funksjonalitet, kan evaluering av disse parameterne gjøre en bedre forutsigelse av sæd befruktning kompetanse. Her beskriver vi tre mulige metoder for å vurdere kvaliteten med bestemte fluorescerende sonder kombinert med fluorescens mikroskopi eller flyt cytometri analyser. Analyser vurdert plasma membranen integritet med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium iodide (PI), acrosomal membran integritet ved hjelp av fluorescein isothiocyanate-konjugerte erter sativum agglutinin (FITC-PSA) og Mitokondrielt membran integritet bruker 5, 5', 6, 6'-tetra-klor-1, 1", 3, 3-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Kombinasjoner av disse metodene er også presentert. For eksempel bruk av annexin V kombinert med PI fluorochromes kan vurdere apoptose og beregne andelen apoptotisk sperm (apoptotisk indeks). Vi tror at disse metodene, som er basert på å undersøke spermatozoon membraner, veldig nyttig for vurdering av kvaliteten.
Introduction
Integritet og funksjonaliteten av sæd membraner er noen av faktorene som angir sperm levedyktighet og gjødsling potensielle. Plasma membranen fungerer som en barriere mellom intracellulær og ekstracellulære avdelinger, og dermed opprettholde det cellular osmotisk likevekt1. Noen stress som induserer skade integriteten plasma membranen kan svekke homeostase, redusere levedyktighet og gjødsling kapasitet og øke celledød. For eksempel reduserer kryonisk bevaring sperm levedyktighet skyldes skader på sin plasma membran, temperaturendringer og osmotisk stress2. Vi har tidligere rapportert at utsette bull sædcellene å lave konsentrasjoner av matbårne miljøgifter som plantevernmidler atrazine, sin hovedmetabolitten diaminochlorotriazine eller mycotoxin aflatoxin B1, reduserer sperm levedyktighet1,3 . Dette ble bestemt av merking double-strandet DNA med DAPI i kombinasjon med PI, som binder seg til DNA av celler med en skadet plasma membran.
Acrosome reaksjon (AR) innebærer blanding av ytre acrosome membranen og overliggende plasma membranen som resulterer i utgivelsen av acrosomal enzymer4,5. Dette er viktige hendelser for zona-pellucida gjennomtrenging og ytterligere sammenslåing av sæd med oocyte6. Evaluering av acrosomal membran integritet utgjør derfor en nyttig parameter for å evaluere sædkvalitet og mannlig fertilitet7,8,9. Flere fluorescerende teknikker er egnet for verifisering av acrosome integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I våre tidligere studier, bruke mønstre av FITC-PSA flekker1,3, vi følger nøyaktig definisjoner for (i) intakt acrosome, (ii) skadet acrosome membran og (iii) reagerte acrosome. Gjeldende rapporten vi evaluere acrosome status ved hjelp av sæd-dedikert flowcytometri og sammenligner resultatene til de som bruker fluorescens mikroskopi.
Mitokondrier er multifunksjonell organelles involvert, blant andre ting, ATP syntese, reaktive oksygen arter produksjon, kalsium signalering og apoptose. Fysiologiske dysfunksjoner, herunder mannlige og kvinnelige ufruktbarhet, knyttes endret mitokondrie funksjonen11. Sperm mitokondrier ordnes i midpiece og spille en avgjørende rolle i sperm motilitet12. Det er godt akseptert at høy mitokondrie membran potensial (ΔΨm) er tilknyttet normal motilitet og høy befruktning kapasitet13. I kontrast, lav ΔΨm er forbundet med et forhøyet nivå av frie radikaler og redusert befruktning rate14. Likevel, ulike miljømessige forbindelser, for eksempel endokrine disruptors, kan indusere mobilnettet stress og føre til en midlertidig økning i ΔΨm, hyperpolarization1,3, økt produksjon av frie radikaler og til slutt, apoptose15. Fluorescerende sonden 5, 5', 6, 6'-tetra-klor-1, 1", 3, 3-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1) kan for eksempel undersøke effektene av matbårne giftstoffer på sperm ΔΨm1,3.
Standard spermiograms, basert på fysiologiske og morfologiske parametere, er ikke god nok til å forutsi sædkvalitet. Mer nøyaktig metoder er nødvendig for å sikre kvaliteten. Her gir vi to mulige metoder for å fastslå kvaliteten basert på vurderinger av sæd membraner: samtidige firemannsrom farging med bestemte fluorescerende sonder og fluorescens mikroskopi, beskrevet i våre studier1,3 og avanserte sæd-dedikerte flowcytometri, nylig benyttet i vårt laboratorium, og allerede brukes av andre16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i 1994 israelske retningslinjer for dyrevelferd. Storfe sperm ble levert av kommersielle israelsk selskap for kunstig insemination og avl. Ejakulerer av 11 okser ble vurdert i denne studien.
1. sperm prøve forberedelse
Merk: Prosedyren er basert på Roth laboratoriet er protokollen1,3.
- Få ca 1 – 6 mL av bull sæd i en 15 mL tube ved romtemperatur.
- Hver 1 mL av sæd, legge til 6 mL av prewarmed (på 37 ° C) NKM buffer (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MOPPER [3-N-morphilino propanesulfonic syre; pH 7.4]) og sentrifuge for 8 min 600 x g, 1-2 ganger til nedbryting er tydelig.
Merk: Hvis sæd konsentrasjon eller første volumet er svært høy, delt i to rør på første vask. - Umiddelbart fjerne og forkaste klart nedbryting og la ca 1 cm av nedbryting over pellet.
- Forsiktig lene rør i 30° vinkel å øke arealet for sædcellene å svømme opp og vente 20-30 minutter å tillate spermatozoa å svømme opp på 37 ° C.
Merk: Turbiditet kan sees. - Bruk av brønnene nøye, fjerne den øverste 1 mL av nedbryting som inneholder motile spermatozoa slik nye 1,5 mL.
- Hold sperm på 37 ° C før bruk.
- Anslå sperm count bruker en Neubauer hemocytometer.
Merk: En annen telling kammer kan brukes i stedet, men telling er annerledes.- Spermatozoon bevegelse, fortynne 100 µL av motile spermatozoa med 10 mL dobbel destillert vann (DDW) (1: 100 fortynning) i en 15 mL tube og bland forsiktig.
- Legg 10 µL av utvalget i hver side av hemocytometer og dekkglassvæske. Sørg for å unngå boble dannes inne i kammeret som dette kan resultere i et unøyaktig sædkvalitet.
- Observere under sammensatte mikroskop med en 20 X-målet.
Merk: Hele rutenettet i en hemocytometer inneholder 9 store torg, hver 1 mm2, og coverglass hviler 0,1 mm over gulvet i kammeret. Dermed er volumet over sentrale telling området 0,1 mm3 eller 0,1 µL. Sentrum i hemocytometer inneholder 25 middels firkanter og hver middels square har 16 mindre ruter med enkle linjer. - Tell antall celler i 4 mellomstore hjørneruter og den sentrale plassen. Høyere presisjon, telle kinesere (begge sider av Neubauer hemocytometer) og bruk gjennomsnittet til å beregne celle konsentrasjon.
- Beregne sperm count ved betyr tallet oppnådd ved 5 (for å få antall celler per teller området) og 10.000 (for å få antall celler per 1 mL av utvannet utvalg). Deretter multiplisere innhentet greven av fortynningsfaktoren (1: 100).
Merk: For eksempel et gjennomsnitt av sæd telles i 5 av 25 middels rutene i to kamre telling sentrum er 150 ([152 + 148] / 2). Dermed er gjennomsnittlig antall sperms per kammer (eller per 0,1 µL) 150 x 5 = 750. Multiplisere 750 av 10 000 for å få antall celler per 1 mL av utvannet utvalg (7,500,000) og deretter multiplisere med 100 (fortynningsfaktoren) å få 75 x 107 celler per mL opprinnelige sædprøve.
2. teknikk #1: Samtidige vurdering av Sperm membraner bruker flere fluorescerende sonder
Merk: Sperm membraner (plasma, acrosomal og mitokondrie) ble vurdert som tidligere beskrevet av Celeghini et al.10, med noen modifikasjoner. Epifluorescent mikroskopi ble brukt, kombinert med et digitalt kamera med eksitasjon på 450-490 nm og utslipp på 515-565 nm bruke filtere trippel.
-
Klargjør lager løsninger.
- Klargjør 0,1 mg/mL DAPI lagerløsning ved oppløsning 5 mg DAPI i 50 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS). Forberede 50 µL dele og lagre på 20 ° C. Før bruk, fortynne lager løsningen med PBS på 1:10 (fungerende løsning, 10 µg/mL).
- Klargjør 1 mg/mL FITC-PSA lagerløsning ved oppløsning 1 mg FITC-PSA i 1 mL av PBS. Forberede 50 µL dele og lagre på 20 ° C. Før bruk, fortynne lager løsningen med PBS på 1:10 (fungerende løsning, 100 µg/mL).
- Klargjør 1 mg/mL JC-1 lagerløsning ved oppløsning 1 mg av JC-1 i 1 mL av dimethyl sulfoxide (DMSO). Forberede 10 µL dele og lagre på 20 ° C. Før bruk, fortynne lager løsningen med DMSO på 1:10 (fungerende løsning, 0,1 mg/mL).
- Forberede PI lager løsningen ved å løse opp 10 mg av PI i 400 µL av PBS (gir 2,5 mg/mL). Butikken på + 4 ° C. Fortynne lager 1 med PBS på 1:20 (fungerende løsning, 0.125 mg/mL). Lagre ved + 4 ° C som en lagerløsning.
Forsiktig: PI er en potensiell mutagen og bør behandles med forsiktighet. Fargestoff må avhendes trygt og lokale bestemmelsene.
- Overføre 133 µL av motile spermatozoa (trinn 1,5) til en ny 1,5 mL tube (25 x 106 sperm/mL).
Merk: Hvis prøven konsentrasjonen er høyere, fortynne den i NKM buffer for å oppnå nødvendig konsentrasjon. Hvis prøven konsentrasjonen av svømme opp eksempel er lavere, sentrifuge innhentet nedbryting etter bading opp på 1000 x g i 5 min, fjerne 0,5 mL nedbryting av og telle sperm igjen. - Legge til 17 µL av DAPI (fungerende løsning) og ruge i 10 min på 37 ° C.
- Sentrifuge 1000 x g i 5 min og kast nedbryting.
- Pellets, legge 100 µL NKM bufferen.
- Legge til 50 µL av FITC-PSA, 2 µL av JC-1 og 3 µL av PI (jobber løsninger) og ruge i 10 min på 37 ° C.
- Sentrifuge 1000 x g i 5 min og fjerne nedbryting.
- Pellets, legger 40 µL NKM bufferen og resuspend av pipettering.
- Overfør 10 µL av utvalget til objektglass, smøre og dekkglassvæske.
-
Visualisere umiddelbart ved epifluorescence mikroskopi (40 x mål) med en trippel filter, utstyrt med et digitalt kamera og ta et bilde separat for hvert filter.
Merk: Det er ingen betydning rekkefølgen filtre visualisert.- Visualisere under DAPI kanal med eksitasjon på 358 nm og utslipp på 461 nm.
- Visualisere under FITC kanal for grønne monomerer eksitasjon på 450-490 nm og utslipp på 515-565 nm.
- Visualisere under PI kanal for rød aggregat med eksitasjon på 488 nm og utslipp på 590 nm.
- Visualisere under JC-1 rød aggregat med eksitasjon 559 nm og utslipp i området 574-627 nm; JC-1 grønn monomerer med eksitasjon 488 nm og utslipp i området 500-535 nm.
- Flette de tre bildene mottatt av filtrene i JPG/JPEG-format alternativet "flette" kameraet programvaren.
- Åpne det sammenslåtte bildet med "Male" verktøyet og bruk alternativet pensel merke telt spermatozoa.
-
Klassifisere spermatozoa basert på fluorescens slippes ut fra hver probe:
- Generelt vurdere minst 200 spermatozoa per lysbilde-alle celler vises blå (DAPI).
- Evaluere gjennomførbarheten ved å telle døde celler, vises som lilla (PI [rød] + DAPI [blue]) og beregning av døde celler (død celler/totalt telles cellene x 100).
- Evaluere acrosome status ved hjelp av mønstre av fluorescerende flekker (FITC-PSA). Beregne prosentverdier forskjellige mønstre (intakt, skadet eller reagert acrosome celler/totalt telles cellene x 100).
Merk: Skadet acrosomal membran vises som en fullt farget, grønn acrosome cap; reagert acrosomal membran viser gjenværende grønne equatorial eller øvre flekker; celler som inneholder intakt acrosomal membran vil ikke ha noen grønne flekker i acrosomal regionen. - Vurdere ΔΨm av skille spermatozoa med høy ΔΨm, som viser en rød-farget midpiece og spermatozoa med lav ΔΨm som viser en grønn-farget midpiece. Telle røde og grønne midpieces separat og beregne sine ratio (rød/grønn).
3. teknikk #2: Vurdering av Sperm membraner med klar-å-bruk prosjektpakker og flowcytometri
Merk: Vurdering av plasma membranen integritet, mitokondrie membran potensial og acrosomal membran integritet ble utført med klar til bruk flyt cytometri kits som inneholder lyofilisert fluorochromes i hver brønn. Prosedyren ble utført i henhold til produsenter med noen modifikasjoner.
-
Plasma membranen integritet evaluering
- Ta ønsket antall brønner fra pakken levedyktighet og konsentrasjon Kit (PI og SYbr14), overføre dem til arbeider base og dekk med en fleksibel lokk (beskytte fra lys).
- Legge til 199 µL av bufferløsning for cytometri per brønn.
- Legger til 1 µL av homogen sæd 57 x 106/mL (57.000 celler per brønn) og homogenize av pipettering.
- Dekk platen med svart lokket.
- Inkuber i 10 min på 37 ° C beskyttet mot lyset.
- Kjøre utvalget gjennom flyt cytometer med innstillingen 'levedyktigheten'.
-
Mitokondrielt membran potensial
- Ta ønsket antall brønner fra pakken av mitokondrie aktivitet kit (JC-1), overføre dem til arbeider base og dekk med en fleksibel lokk (beskytte fra lys).
- Legg til 10 µL av absolutt etanol per brønn og Pipetter for å resuspend pulver stede i brønnen.
- Legg til 190 µL av PBS per brønn og homogenize av pipettering.
- Legger til 0,75 µL av homogen sæd 57 x 106/mL (50 000 celler per brønn) og homogenize av pipettering.
- Dekk platen med svart lokket.
- Inkuber i 30 min på 37 ° C beskyttet mot lyset.
- Kjøre utvalget gjennom flyt cytometer med innstillingen ʽmitochondrial aktivitet '.
-
Acrosomal membran integritet
Merk: FITC-PSA flekker (se teknikk #1) gjør evalueringen av 3 acrosome kategorier (intakt acrosome, reagert acrosome og skadet acrosome). Bruke flyt cytometer og levedyktighet & acrosome integritet kit (PI og FITC-PNA), er spermatozoa delt inn i disse 3 kategoriene.- Ta ønsket antall brønner fra pakken levedyktighet og acrosome integritet Kit, overføre dem til arbeider base og dekk med en fleksibel lokk (beskytte fra lys).
- Legge til 200 µL av bufferløsning for cytometri per brønn.
- Legger til 0,7 µL av homogen sæd 57 x 106/mL (40 000 celler per brønn) og homogenize av pipettering.
- Dekk platen med svart lokket.
- Inkuber for 45 min ved 37 ° C beskyttet mot lyset.
- Kjøre utvalget gjennom flyt cytometer med innstillingen ʽInCyte'.
- Analysere resulterende histogrammet av gating tre markør områdene etter fluorescens intensitet, representerer ubetydelig, lav-fluorescing celler med intakt, unstained kvinne acrosome (R1), lav-fluorescing celler med gjenværende farget del av acrosome (R2) og svært fluorescing celler med forstyrret acrosome (R3).
Merk: Bruk delen "analysere filer anskaffes ved hjelp av andre moduler" i brukerhåndboken instrument for å skape de tre regionene (R1, R2, R3).
4. teknikk #3: Vurdering av Sperm membraner fluorescerende sonder og flowcytometri
Merk: Bruk av annexin V kombinert med PI fluorochromes kan vurdere apoptose og beregne andelen apoptotisk sperm (apoptotisk indeks).
- Forberede 1 x annexin V bindende buffer fra 20 x lagerløsning (fortynne 500 µL av annexin V bindende buffer 20 x lagerløsning med 9,5 mL steril destillert vann).
- Anslå sperm count bruker en Neubauer hemocytometer som beskrevet i delen 1.7.
- Vask 106 spermatozoa i 1 mL 1 x annexin V bindende buffer og sentrifuge 300 x g for 10 min.
- Sug opp nedbryting helt.
- Resuspend pellet i 100 µL av 1 x annexin V bindende buffer.
- Legge til 10 µL annexin v konjugert til FITC.
- Bland godt og ruge i 15 min i mørket ved romtemperatur.
- Vask spermatozoa ved å legge 1 mL 1 x annexin V bindende buffer per 106 celler og sentrifuger på 300 x g i 10 min.
- Sug opp nedbryting helt.
- Resuspend celle pellet i 500 µL av 1 x annexin V bindende buffer per 106 totalt celler.
- Legg 1 µg/mL PI umiddelbart før analysen med en strøm cytometer.
- Kjøre utvalget gjennom flyt cytometer på ʽInCyte ".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser samtidige fluorimetric vurdering av sæd membraner (plasma, acrosomal og mitokondrie) bruker PI, DAPI, FITC-PSA og JC-1. Vurdering av sæd membraner bruker samtidige farging med fire fluorescerende sonder tillater, for eksempel vurdere andelen sperm i hver kategori-live vs døde. høy og lav ΔΨm; intakt vs. skadet acrosome-samtidig i hver spermatozoon.
Figur 2 viser resultatene av sæd membran evaluering bruker fluorimetric sonder. Bare sæd som inneholdt minst 80% motile spermatozoa ble brukt i forsøket. Minst 200 celler ble undersøkt per bull. Det var mulig å vurdere forskjellene i prøven kvaliteten i membranen integritet. For eksempel ejakulere av bull nr. 7 hadde en relativt lav andel av døde celler, en lav andel av spermier med pseudo reagerte acrosome og høyere mitokondrie membran potensial, sammenlignet med ejakulere av bull nr. 1.
Figur 3 viser representative utvalg vurdert for levedyktighet (figur 3A-3 C) og mitokondrie aktivitet (figur 3D-3F). Fluorescens intensiteter av prøvene ble vurdert av en dedikert microcapillary sperm flyt-cytometer, med dedikert programvare. Dette flow-cytometer inneholder en solid-fase blå laser (448 nm) og to photodiodes: videresende scatter og siden scatter. Den måler spesielt sperm utslipp egenskaper med tre photomultiplier rør (grønn: 525/30 nm, gul: 583/26 nm, red: 655/50 nm) og tilpasser optisk filtrene og splitters16. Det gjør evaluering av 5000 spermatozoa per analyse.
Levedyktighet bedømmelse utstyr behersker en sonde med differensial permeabilitet levedyktig (intakt plasma membran) og døde (skadet plasma membran) spermatozoa (Figur 3 c). Sæd ΔΨm ble vurdert ved hjelp av et kit som skiller mellom polarisert mitokondrie membran (fluorescens vises i oransje) og depolarized mitokondrie membran (fluorescens vises i grønt) (figur 3F).
Figur 4 presenterer en evaluering av acrosome integritet utført med klar-å-bruke kit, lese med flowcytometri (tall 4A--4 C), dele resulterende histogrammet gated spermatozoa i tre markør områder, representerer ubetydelig lav-fluorescing celler med intakt, unstained kvinne acrosome (R1), lav-fluorescing celler med gjenværende farget del av acrosome (R2), og svært fluorescing celler med forstyrret acrosome (R3).
Tabell 1 viser en sammenligning av to fluorimetric teknikker for vurdering av sæd membraner. Samme sperm prøvene fra tre forskjellige okser ble vurdert for levedyktighet, mitokondrie membran potensial (ΔΨm) og acrosome integritet med samtidige firemannsrom flekker, samt flowcytometri. Denne sammenligningen er svært viktig, som det viser samsvarende resultatene med hver av de to teknikkene. Dataene ble analysert av en analyse og Student t-test. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert.
Figur 5 viser et representativt utvalg vurdert for apoptose annexin V (AV) og propidium iodide (PI) fluorochromes. Bruk av disse to sonder kan skille mellom fire mønstre indikerer levedyktige cellers (AV-, PI-), tidlig apoptotisk celler (AV +, PI-), apoptotisk celler (AV +, PI +) og necrotic celler (AV-, PI +).
Figur 1: Epifluorescence photomicrography spermatozoa farget samtidig med flere fluorescerende sonder. (A) Simultaneous farging med fire sonder PI, DAPI, FITC-PSA og JC-1) (B) Live spermatozoon med DAPI farging av kjernen og høy mitokondrie membran potensial (ΔΨm), med JC-1 sonde. (C) døde spermatozoon med skadet plasma membranen beiset med PI sonde, skadet acrosome med FITC-PSA sonde og lav ΔΨm. (D) Live, acrosome-reagert spermatozoon med gjenværende equatorial flekker og lav ΔΨm. (E) Live, acrosome-reagert spermatozoon med gjenværende øvre flekker og høy ΔΨm. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: evaluering av bull sperm membraner bruker fluorimetric sonder. (A) Sperm levedyktighet identifiserte med fluorescerende sonder 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium iodide (PI). (B) Acrosome status ble fastsatt ifølge FITC-PSA flekker mønstre. Presenteres er andelen spermatozoa med reagert acrosome. (C) mitokondrie membran potensial (ΔΨm) ble evaluert benytter med JC-1 fluorescent sonde og presentert som forholdet mellom gjennomsnittlig andel av rød-farget (stort potensiale) og grønn-farget (lite potensiale) sperm. Dataene presenteres som prosent av cellene fra total evaluerte cellene. Minst 200 spermatozoa ble analysert per bull. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: levedyktighet (-vekselstrøm) og mitokondrie aktivitet (D-F) fluorescens vurdering av representative utvalg målt ved EasyCyte flyt cytometer. Histogrammer representerer ungated spermatozoa og rusk (A, D), gated spermatozoa (B, E), distribusjon av spermatozoa levedyktig (grønn) og døde (rød) celler (C) og distribusjon av spermatozoa polarisert (gul) og depolarized) grønn) mitokondrie membran (F). Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fluorescens vurdering av acrosome integritet representative utvalg målt ved EasyCyte flyt cytometer. (A) histogrammet ungated spermatozoa og rusk. (B, C) Histogrammer gated spermatozoa med evalueringen av acrosome integritet med klar-å-bruke kit, lese med tilpasset innstillingen 'InCyte', dele resulterende histogrammet av gated spermatozoa i tre markør områder, som representerer ubetydelig, lav-fluorescing celler med intakt, unstained kvinne acrosome (R1), lav-fluorescing celler med gjenværende farget del av acrosome (R2) og svært fluorescing celler med norsk acrosome (R3). Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gjennomsnittlig antall celler | Vialbility | Mitokondrielt membran potensialet | Acrosome integritet | ||||||
| Levedyktig | Døde | Depolarized | Polarisert | Rød/grønn forholdet | Behold Acrosome | Reagert Acrosome | Forstyrret Acrosome | ||
| Firemannsrom flekker | 253 | 32,7 ± 1,53% | 67.3 ± 1,53% | 65.7 ± 2,25% | 34.3 ± 2,52% | 0,5 ± 0,06 | 37.3 ± 7,2% | 38.0 ± 5,7% | 24.3 ± 3.0% |
| Flow Cytomtery | 5000 | 32.3 ± 2.08% | 67.7 ± 2.08% | 65.0 ± 1,00% | 35.0 ± 1,00% | 0,5 ± 0,02 | 39.5 ± 5,7% | 39.5 ± 6,5% | 21.0 ± 8.0% |
Tabell 1: sammenligning av to fluorimetric teknikker for vurdering av sæd membraner. Samme sperm prøvene evaluert for levedyktighet, mitokondrie membran potensial og acrosome integritet samtidige firemannsrom flekker og flowcytometri. Dataene presenteres som betyr andel ± SD undersøkt cellene, beregnet for 3 gjentak.
Figur 5: Annexin V og PI fluorescens hvor et representativt utvalg målt ved en flyt cytometer. Histogrammer representerer (A) ungated spermatozoa og rusk og (B) distribusjon av gated spermatozoa til tidlig apoptotisk (AV +, PI-), apoptotisk (AV +, PI +), levedyktig (AV-, PI-) og nekrose (AV-, PI +) celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sperm befruktning potensielle avhenger av flere faktorer som reflekterer kvaliteten. En høy konsentrasjon av spermatozoa og en høy andel av svært gradvis motile spermatozoa kan anses som høy kvalitet sæd. Likevel slike en evaluering tar ikke hensyn til andre cellulære og funksjonelle parametere. Bruk av "benk-topp" microcapillary flyt cytometer kan enkelt tilpasses til evaluering av ulike sperm strukturer med fluorescerende sonder, som tidligere vist av andre17 og demonstrert her (teknikk #3). For eksempel sperm acrosome integritet er svært viktig for forekomsten av vellykket naturlig befruktning og derfor nøyaktig evaluering av acrosomal status garanteres. Slike en evaluering kan utføres enkelt ved klassifisering av acrosome status ved hjelp av mønstre av fluorescerende flekker (FITC-PSA, FITC-PNA, dvs. teknikk #1, som beskrevet tidligere)1,3. Spesielt er det svært viktig å bestemme andelen spermier med intakt acrosome (dvs. har en unstained kvinne acrosome) i forhold til de med skadet acrosome. Med hensyn til sistnevnte, sperm med skadet acrosome kan vise (i) en fullt farget acrosomal cap, som angir at membranen er skadet, aktivere fargestoff å strømme gjennom membranen til acrosome vesicle; (ii) acrosome-reagert sædceller som viser bare gjenværende acrosome innhold, som angir at det allerede har oppstått AR (dvs pseudo AR). Det bør bemerkes at slike en evaluering kan også utføres med dedikert flyt-cytometer.
Klar til bruk levedyktighet og acrosome integritet kit definerer både sperm levedyktighet (levedyktig eller død) og acrosomal integritet (intakt eller forstyrret). Her foreslår vi bruker dedikerte flyt-cytometer til å definere de tre nevnte acrosomal statusene (dvs, intakt, skadet, reagerte). Vi tilpasset microcapillary flyt cytometer plattform for mer nøyaktig vurdering, som identifiserer acrosome-reagert sperm (dvs. lav fluorescens) mens ekskludere dem fra de som har forstyrret acrosome (høy fluorescens), i stedet inkludert dem med de som har en intakt acrosome. Dette gir en nøyaktig andelen spermier med funksjonelle eller fungerer ikke acrosome. Spermier med reagert acrosome samt forstyrret acrosomal membran har mistet sin evne til å befrukte oocyte. Videre nøyaktig analyse kan belyse mekanismen underliggende acrosome endring, dvs, skadet acrosome membran vs pseudo acrosome aktivisering.
Vi sammenlignet resultatene med teknikken #1 og #2 teknikk, og finner stor kompatibilitet mellom dem, spesielt i evalueringen av levedyktighet og ΔΨm (tabell 1). En av fordelene ved å bruke den dedikerte flyt-cytometer er det store antallet evaluerte spermatozoa i forhold til lite antall spermatozoa som er evaluert i praksis av fluorescens mikroskopi og sonder (tusenvis vs hundrevis, henholdsvis ). Videre er sistnevnte prosedyren tidkrevende og subjektive, selv når utført av en erfaren observatør. Som flowcytometri oppdager bare partikkel-assosiert fluorescens, er det ikke nødvendig å vaske ubundet sonden fra løsningen, som er en tidkrevende trinn17. På den annen side, kan fluorimetric vurdering av sæd membraner beskrevet i teknikken #1 samtidig vurdering av flere membraner. Vi kunne bruke fire fluorescerende sonder sammen1,3.
Til slutt, bør det bemerkes at dedikert flyt cytometer ble utviklet som en åpen analysen modul, som gir alle de grunnleggende verktøyene for eksempel anskaffelse og dataanalyse. Funksjonen oppkjøpet kan samle forskjellige typer informasjon fra en celle utvalg og derfor gjør tilpasning for mer nøyaktig vurdering, som vist her acrosome status og apoptotisk indeksen.
Avslutningsvis er metodikkene som er beskrevet i denne hvitboken svært nyttig for vurdering av sædkvalitet. Undersøke spermatozoon membraner er svært viktig for å bestemme sperm befruktning kompetanse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke "SION" israelsk selskap for kunstig insemination og avl (Hafetz-Haim, Israel) for deres hjelp og samarbeid og Ms. Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Frankrike) for hjelp med instrumentet oppsett og trening.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20x stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
