Summary
Här presenterar vi metoder för att utvärdera spermatozoan membran integritet, en cellulär funktion som är associerad med spermier befruktning kompetens. Vi beskriver tre tekniker för fluorimetriskt bedömning av spermier membran: samtidiga färgning med specifika fluorescerande sonder, fluorescensmikroskopi och avancerade spermier-dedikerad flödescytometri. Exempel att kombinera metoderna presenteras också.
Abstract
Standard spermiograms som beskriver spermiekvalitet är mestadels baserade på fysiologiska och visuella parametrar, såsom ejakulat volym och koncentration, motilitet och progressiv motilitet, och spermiernas morfologi och. Ingen av dessa bedömningar är dock tillräckligt bra för att förutsäga sperma kvaliteten. Med tanke på att underhållet av spermier livskraft och befruktning potentiella beror på membran integritet och intracellulära funktionalitet, kan utvärdering av dessa parametrar aktivera en bättre Prediktion av spermier befruktning kompetens. Vi beskriver här, tre möjliga metoder för att utvärdera spermiernas kvalitet använder specifika fluorescerande sonder kombinerat med fluorescence mikroskopi eller flöde flödescytometri analyser. Analyser bedöms plasmamembranet integritet använder 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och propidium jodid (PI), acrosomal membran integritet med fluorescein isotiocyanat-konjugerad Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) och mitokondriella membranet integritet använder 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodid (JC-1). Kombinationer av dessa metoder presenteras också. Exempelvis användning av annexin V kombinerat med PI fluorokromer gör bedömningen av apoptos och beräkning av andelen apoptotiska spermier (apoptotiska index). Vi anser att dessa metoder, som bygger på att undersöka spermie membran, är mycket användbart för utvärdering av spermiernas kvalitet.
Introduction
Integritet och funktionalitet av spermier membran är några av de faktorer som indikerar spermier livskraft och befruktning potentiella. Plasmamembranet fungerar som en barriär mellan intracellulär och extracellulär fack, därigenom bibehålla den cellulära osmotiska balans1. Stress som inducerar skador på plasmamembranet integritet kan försämra homeostas, minska livskraft och befruktning kapacitet och öka celldöd. Exempelvis minskar frysförvaring spermier lönsamhet på grund av skada till dess plasmamembran, till följd av temperaturväxlingar och osmotisk stress2. Tidigare rapporterade vi att utsätta bull spermier till låga koncentrationer av livsmedelsburna föroreningar såsom de bekämpningsmedel atrazin, dess huvudmetabolit diaminochlorotriazine eller den mykotoxin aflatoxin B1, minskar spermier livskraft1,3 . Detta bestämdes av märkning dubbelsträngat DNA med DAPI i kombination med PI, som binder till DNA celler med skadat plasma membran.
Akrosomen reaktion (AR) innebär fusion av yttre akrosomen membranet och överliggande plasmamembranet vilket resulterar i utsläpp av acrosomal enzymer4,5. Dessa är väsentliga händelser zona pellucida penetration och ytterligare sammanslagning av spermier med äggcellen6. Utvärdering av acrosomal membran integritet utgör därför en användbar parameter för att utvärdera sperma kvalitet och manlig fertilitet7,8,9. Flera fluorescerande tekniker är lämpliga för verifiering av akrosomen integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I våra tidigare studier, med mönster av FITC-PSA färgning1,3, vi förutsatt korrekt definitioner för (i) intakt akrosomen, (ii) skadats akrosomen membran och (iii) reagerade akrosomen. I det aktuella betänkandet vi utvärdera akrosomen status med hjälp av spermier-dedikerad flödescytometri och jämföra resultaten till de som använder fluorescensmikroskopi.
Mitokondrierna är multifunktionella organeller involverad i, bland annat ATP syntes, reaktivt syre arter produktion, Kalciumsignalering och apoptos. Fysiologiska störningar, inklusive manlig och kvinnlig infertilitet, är associerade med förändrad mitokondriefunktion11. Spermier mitokondrier är ordnade i midpiece och spelar en avgörande roll i spermier motilitet12. Det är väl accepterat att hög mitokondriella membranpotential (ΔΨm) är förknippad med normala motilitet och hög befruktning kapacitet13. Däremot låg ΔΨm är associerade med en förhöjd nivå av reaktiva syreradikaler och minskad gödsling ränta14. Ändå kan olika miljömässiga föreningar, till exempel hormonstörande ämnen, inducera cellulär stress och leda till en övergående förhöjning av ΔΨm, hyperpolarisering1,3, ökad produktion av fria radikaler och så småningom apoptos15. Fluorescerande sonden 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodid (JC-1) möjliggör till exempel att undersöka effekterna av livsmedelsburna gifter på spermier ΔΨm1,3.
Standard spermiograms, utifrån fysiologiska och morfologiska parametrar, är inte tillräckligt bra för att förutsäga sperma kvalitet. Noggrannare metoder måste säkerställa spermiekvalitet. Här, vi ger två möjliga metoder för att bestämma spermiernas kvalitet baserat på utvärderingar av spermier membran: samtidiga Fyrbäddsrum färgning med specifika fluorescerande sonder och fluorescensmikroskopi, beskrivs i våra studier1,3 och avancerade spermier-dedikerad flödescytometri, nyligen används i vårt laboratorium, och redan används av andra16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimenten utfördes enligt 1994 israeliska riktlinjer för djurens välbefinnande. Bovin spermier levererades av kommersiella israeliska företaget för artificiell insemination och avel. Får utlösning av 11 tjurar utvärderades i denna studie.
1. sperma provberedning
Obs: Förfarandet bygger på Roth laboratoriets protokoll1,3.
- Erhålla cirka 1 – 6 mL av bull sperma i en 15 mL tub vid rumstemperatur.
- Varje 1 ml av sperma, tillsätt 6 mL förvärmd (vid 37 ° C) NKM buffert (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM moppar [3-N-morphilino propanesulfonic syra; pH 7,4]) och centrifugera för 8 min vid 600 x g, 1 – 2 gånger tills supernatanten är klart.
Obs: Om spermiekoncentration eller den ursprungliga volymen är mycket höga, uppdelad i två rör vid första tvätten. - Omedelbart ta bort och kassera klara supernatanten och lämna ca 1 cm av supernatanten ovan pelleten.
- Försiktigt luta rören i en 30° vinkel för att öka yta för spermier att simma upp och vänta 20 – 30 min så att spermier simma upp vid 37 ° C.
Obs: Grumlighet kan ses. - Använd en mikropipett noggrant och ta bort den övre 1 mL av supernatanten innehållande de motila spermier till en ny 1,5 mL tub.
- Hålla spermierna vid 37 ° C fram till användning.
- Uppskatta de spermier som använder en Neubauer hemocytometer.
Obs: En annan räknande kammare kan användas i stället, men räkna är annorlunda.- För att förhindra spermie rörelse, späd 100 µL av de motila spermier med dubbel destillerat vatten (DDW) (1: 100 utspädning) i en 15 mL tub 10 mL och blanda försiktigt.
- Ladda 10 µL av provet i varje sida av hemocytometer och täckglas. Se till att undvika bubbla bildas inne i kammaren, eftersom detta kan resultera i en felaktig spermieantal.
- Observera i förening Mikroskop med ett 20 X-objektiv.
Obs: Rutnätet full på en hemocytometer innehåller 9 stora rutor, varje 1 mm2, och täckglas vilar 0,1 mm ovanför golvet i kammaren. Således är volymen över centrala räknande området 0,1 mm3 eller 0.1 µL. Centralområdet av hemocytometer innehåller 25 medelstora rutor och varje medium square har 16 mindre rutor med enstaka rader. - Räknas det totala antalet celler som finns i 4 medelstora hörn rutor och det centrala torget. För högre precision, räkna två kammare (båda sidor av den Neubauer hemocytometer) och Använd genomsnittet för att beräkna cellkoncentrationen.
- Beräkna spermieantalet genom att multiplicera det barnantalet som erhållits genom 5 (för att få antalet celler per räknar område) och 10 000 (för att få antalet celler per 1 mL av utspädda provet). Sedan multiplicera antalet erhållna med utspädningsfaktorn (1: 100).
Obs: Exempelvis ett genomsnittligt antal spermier räknas i 5 av 25 medelstora torg inom centrala räkna två kammare är 150 ([152 + 148] / 2). Således är det genomsnittliga antalet spermier per kammare (eller per 0.1 µL) 150 x 5 = 750. Multiplicera 750 av 10.000 för att få antalet celler per 1 mL av utspädda provet (7,500,000) och sedan multiplicera med 100 (utspädningsfaktor) att få 75 x 107 celler per mL av ursprungliga spermaprov.
2. teknik #1: Samtidig bedömning av spermier membran med flera fluorescerande sonder
Obs: Spermier membran (plasma, acrosomal och mitokondrie) bedömdes som tidigare beskrivs av Celeghini et al.10, med några ändringar. Epifluorescerande mikroskopi användes, kombinerat med en digitalkamera med excitation vid 450-490 nm och utsläpp vid 515-565 nm med en trippel filter.
-
Förbereda stamlösningar.
- Förbereda 0,1 mg/mL DAPI stamlösning av upplösning 5 mg av DAPI i 50 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förbereda 50 µL portioner och förvaras vid-20 ° C. Spädes stamlösningen med PBS på 1:10 (fungerande lösning; 10 µg/mL) före användning.
- Laga 1 mg/mL stamlösning av FITC-PSA genom upplösning 1 mg av FITC-PSA i 1 mL PBS. Förbereda 50 µL portioner och förvaras vid-20 ° C. Spädes stamlösningen med PBS på 1:10 (fungerande lösning, 100 µg/mL) före användning.
- Laga 1 mg/mL JC-1 stamlösning av upplösning 1 mg av JC-1 i 1 mL av dimetyl sulfoxid (DMSO). Förbereda 10 µL portioner och förvaras vid-20 ° C. Spädes stamlösningen med DMSO på 1:10 (fungerande lösning, 0,1 mg/mL) före användning.
- Förbereda PI stamlösning av upplösning 10 mg PI i 400 µL PBS (ger 2,5 mg/mL). Förvaras vid + 4 ° C. Späd 1 lager med PBS på 1:20 (fungerande lösning; 0,125 mg/mL). Förvaras vid + 4 ° C som en stamlösning.
Försiktighet: PI är en potentiell mutagen och bör hanteras med försiktighet. Färgen måste bortskaffas på ett säkert sätt och enligt tillämpliga lokala föreskrifter.
- Överföra 133 µL av de motila spermier (steg 1,5) till en ny 1,5 mL tub (25 x 106 spermier/mL).
Obs: Om provet koncentrationen är högre, späd det i NKM buffert för att uppnå önskad koncentration; Om provet koncentrationen av simningen upp prov är lägre, Centrifugera erhållna supernatanten efter bad upp vid 1 000 x g i 5 min, ta bort 0,5 mL av supernatanten och räkna sperman igen. - Tillsätt 17 µL av DAPI (fungerande lösning) och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
- Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Att pelleten, tillsätt 100 µL av NKM buffert.
- Tillsätt 50 µL av FITC-PSA, 2 µL av JC-1 och 3 µL av PI (arbetar lösningar) och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
- Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min och avlägsna supernatanten.
- Pelleten, tillsätt 40 µL NKM buffert och resuspendera genom pipettering.
- Över 10 µL av provet till en glasskiva, smear och täckglas.
-
Visualisera omedelbart genom epifluorescence mikroskopi (användning 40 x-objektiv) med en trippel filter, utrustad med en digital kamera och ta bilder separat för varje filter.
Obs: Det finns ingen betydelse ordningen filter visualiseras.- Visualisera under DAPI kanal med excitation vid 358 nm och utsläpp på 461 nm.
- Visualisera under FITC kanal för gröna monomerer med excitation vid 450 – 490 nm och utsläpp vid 515 – 565 nm.
- Visualisera under PI kanal för röda aggregat med excitation vid 488 nm och utsläpp vid 590 nm.
- Visualisera under JC-1 röd aggregat med magnetiseringen på 559 nm och utsläpp i spänna av 574 – 627 nm. JC-1 grön monomerer med magnetiseringen på 488 nm och utsläpp i storleksordningen 500 – 535 nm.
- Sammanfoga tre bilder emot från filtren i JPG/JPEG format, med hjälp av alternativet ”Koppla” av kameraprogramvaran.
- Öppna den sammanslagna bilden med ”Paint” verktyg och använda alternativet borste för att markera räknade spermier.
-
Klassificera spermier baserat på fluorescensen som avges från varje sond:
- I allmänhet utvärdera minst 200 spermier per bild — alla celler visas blå (DAPI).
- Utvärdera lönsamhet genom att räkna döda celler, visas som lila (PI [red] + DAPI [blå]) och beräkna procentandelen av döda celler (döda celler/totalt räknade celler x 100).
- Utvärdera akrosomen status med hjälp av mönster av fluorescerande färgning (FITC-PSA). Beräkna procentsatserna av de olika mönstren (intakt, skadade eller reagerade akrosomen celler/totalt räknade celler x 100).
Obs: Skadade acrosomal membran visas som ett fullt färgade, grön akrosomen tak; reagerade acrosomal membran visar resterande gröna ekvatoriella eller övre färgning; celler som innehåller intakt acrosomal membran kommer inte uppvisar någon grön färgning av regionen acrosomal. - Utvärdera ΔΨm genom att särskilja spermier med hög ΔΨm, som ställer ut en röd-färgade midpiece och spermier med låg ΔΨm som ställer ut en grön-färgade midpiece. Räkna röda och gröna midpieces separat och beräkna deras förhållandet (röd/grön).
3. teknik #2: Bedömning av spermier membran med färdiga att använda kit och flödescytometri
Obs: Bedömning av plasmamembranet integritet, mitokondriella membranet potential och acrosomal membran integritet utfördes med ready-to-use flöde flödescytometri kit innehållande frystorkat fluorokromer i varje brunn. Förfarandet var utförs enligt tillverkarna med några ändringar.
-
Plasmamembranet integritet utvärdering
- Ta önskat antal brunnar från paketet med livskraft och koncentration kit (PI och SYbr14), överföra dem till den arbetande bas och täck med en flexibel lock (ljuskänsligt).
- Tillsätt 199 µL av buffrad lösning för flödescytometri per brunn.
- Tillsätt 1 µL av homogena sperma på 57 x 106/ml (57.000 celler per brunn) och homogenisera genom pipettering.
- Täcka plattan med svart lock.
- Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C skyddas från ljus.
- Kör provet genom en flödescytometer med inställningen ”livskraft”.
-
Mitokondriella membranpotential
- Ta önskat antal brunnar från paketet med mitokondriell aktivitet kit (JC-1), överföra dem till den arbetande bas och täck med en flexibel lock (ljuskänsligt).
- Tillsätt 10 µL av absolut etanol per brunn och pipett för att resuspendera pulvret närvarande inom brunnen.
- Tillsätt PBS 190 µL per brunn och homogenisera genom pipettering.
- Lägg till 0,75 µL av homogena sperma på 57 x 106/ml (50 000 celler per brunn) och homogenisera genom pipettering.
- Täcka plattan med svart lock.
- Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C skyddas från ljus.
- Kör provet genom en flödescytometer med inställningen ʽmitochondrial aktiviteten '.
-
Acrosomal membran integritet
Obs: FITC-PSA färgning (se teknik #1) möjliggör utvärdering av 3 akrosomen kategorier (intakt akrosomen, reagerade akrosomen och skadade akrosomen). Med hjälp av flödescytometer och livskraft & akrosomen integritet kit (PI och FITC-PNA), är spermier separerade i dessa 3 kategorier.- Ta önskat antal brunnar från paketet med livskraft & akrosomen integritet kit, överföra dem till den arbetande bas och täck med en flexibel lock (ljuskänsligt).
- Tillsätt 200 µL av buffrad lösning för flödescytometri per brunn.
- Lägg till 0.7 µL av homogena sperma på 57 x 106/ml (40 000 celler per brunn) och homogenisera genom pipettering.
- Täcka plattan med svart lock.
- Inkubera i 45 min vid 37 ° C skyddas från ljus.
- Kör provet genom en flödescytometer med den inställningen ʽInCyte'.
- Analysera det resulterande histogrammet av gating tre Märkningsytorna enligt fluorescensintensiteten, som representerar försumbar, låg fluorescerande celler med intakt, ofärgade akrosomen (R1), låg fluorescerande celler med resterande färgas en del av akrosomen (R2) och starkt fluorescerande celler med störd akrosomen (R3).
Obs: Använd avsnittet ”analysera filer förvärvade använder andra moduler” i Användarhandbok för instrument för att skapa de tre regionerna (R1, R2, R3).
4. teknik #3: Bedömning av spermier membran med hjälp av fluorescerande sonder och flödescytometri
Obs: Användning av annexin V kombinerat med PI fluorokromer gör bedömningen av apoptos och beräkning av andelen apoptotiska spermier (apoptotiska index).
- Bered 1 x annexin V bindande buffert från 20 x stamlösning (utspädd 500 µL av annexin V bindande buffert 20 x stamlösning med 9,5 mL sterilt destillerat vatten).
- Uppskatta spermieantalet med en Neubauer hemocytometer som beskrivs i avsnitt 1.7.
- Tvätta 106 spermier i 1 mL 1 x annexin V bindande buffert och centrifugera vid 300 x g under 10 minuter.
- Aspirera supernatanten helt.
- Återsuspendera pelleten i 100 µL av 1 x annexin V bindande buffert.
- Tillsätt 10 µL av annexin V konjugerat med FITC.
- Blanda väl och inkubera i 15 min i mörker vid rumstemperatur.
- Tvätta spermier genom att tillsätta 1 mL 1 x annexin V bindande buffert per 106 celler och centrifugera vid 300 x g i 10 min.
- Aspirera supernatanten helt.
- Återsuspendera cellpelleten i 500 µL av 1 x annexin V bindande buffert per 106 totala celler.
- Tillsätt 1 µg/mL PI omedelbart före analys med en flödescytometer.
- Kör provet genom en flödescytometer på ʽInCyte'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar samtidiga fluorimetriskt bedömning av spermier membran (plasma, acrosomal och mitokondrie) använda PI, DAPI, FITC-PSA och JC-1. Bedömning av spermier membran med samtidiga färgning med fyra fluorescerande sonder tillåter, till exempel utvärdera andelen spermier i varje kategori – live vs döda; hög vs. låg ΔΨm; intakt vs. skadad akrosomen — samtidigt för varje spermie.
Figur 2 presenterar resultaten av spermier membran utvärdering med fluorimetriskt sonder. Endast sperma som innehöll minst 80% motila spermier användes i försöket. Minst 200 celler undersöktes per tjur. Det var möjligt att bedöma skillnader i sperma prov kvalitet vad gäller membran integritet. Till exempel ejakulat Bull nr 7 hade en relativt låg andel av döda celler, en låg andel spermier med pseudo reagerade akrosomen och högre mitokondriella membranpotential, jämfört med ejakulat Bull nr 1.
Figur 3 visar representativa prover utvärderas för livskraft (figur 3A–3 C) och mitokondriell aktivitet (figur 3D–3F). Fluorescens intensiteter av proven utvärderades av en flödescytometer för dedikerade microcapillary spermier, för med särskild programvara. Detta flödescytometer innehåller en fasta fasen blå laser (448 nm) och två fotodioder: vidarebefordra scatter och side scatter. Den mäter specifikt spermier utsläpp boenden med tre Fotomultiplikatorrör (grön: 525/30 nm, gul: 583/26 nm; red: 655/50 nm) och rymmer optiska filter och splitters16. Det möjliggör utvärdering av 5.000 spermier per analys.
Livskraft utvärdering satsen innehåller en sond med differentiell genomtränglighet av livskraftiga (intakt plasmamembran) och döda (skadade plasmamembran) spermier (figur 3 c). Spermier ΔΨm bedömdes med hjälp av ett kit som skiljer mellan polariserade mitokondriella membranet (fluorescens visas i orange) och Aricebo mitokondriella membranet (fluorescens som visas i grönt) (figur 3F).
Figur 4 presenterar en utvärdering av akrosomen integritet utförs med färdiga att använda kit, läsa med flödescytometri (figurerna 4A–4 C), dividera det resulterande histogrammet över gated spermier i tre områden: markör, som representerar försumbar låg fluorescerande celler med intakt, ofärgade akrosomen (R1), låg fluorescerande celler med resterande färgas en del av akrosomen (R2), och starkt fluorescerande celler med störd akrosomen (R3).
I tabell 1 redovisas en jämförelse av de två fluorimetriskt teknikerna för bedömning av spermier membran. De samma spermier proverna från tre olika tjurar utvärderades livskraft, mitokondriella membranpotential (ΔΨm) och akrosomen integritet använder samtidiga Fyrbäddsrum färgning samt flödescytometri. Denna jämförelse är mycket viktigt, eftersom det visar matchande resultat med de två teknikerna. Data analyserades av en analys och Students t-test. Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades.
Figur 5 visar ett representativt urval utvärderas för apoptos med hjälp av annexin V (AV) och propidium jodid (PI) fluorokromer. Användning av dessa två sonder kan skilja mellan fyra mönster som indikerar viabla celler (AV-, PI-), tidig apoptotiska celler (AV +, PI-), apoptotiska celler (AV +, PI +) och nekrotiska celler (AV-, PI +).
Figur 1: Epifluorescence fotomikrografi av spermatozoa målat samtidigt med flera fluorescerande sonder. (A) samtidig färgning med fyra sonder PI, DAPI, FITC-PSA och JC-1) (B) Live spermie med DAPI färgning av kärnan och hög mitokondriella membranpotential (ΔΨm), målat med JC-1 sond. (C) döda spermie med skadade plasmamembranet färgas med PI sond, skadade akrosomen färgas med FITC-PSA sond och låg ΔΨm. (D) Live, akrosomen-reagerade spermie med kvarstående ekvatoriella färgning och låg ΔΨm. (E) Live, akrosomen-reagerade spermie med kvarvarande övre färgning och hög ΔΨm. Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: utvärdering av bull spermier membran med fluorimetriskt sonder. (A) sperma livskraft bestämdes med fluorescerande sonder 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och propidium jodid (PI). (B) akrosomen status bestämdes enligt FITC-PSA färgning mönster. Presenteras är andelen spermier med reagerade akrosomen. (C) mitokondriella membranpotential (ΔΨm) utvärderades använda med JC-1 fluorescerande sond och presenteras som förhållandet mellan genomsnittliga andelen röd-färgade (hög potential) och grön-färgade (låg potential) spermier. Data presenteras som procent av celler av totala utvärderas celler. Minst 200 spermier analyseras per tjur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: livskraft (A-C) och mitokondriell aktivitet (D-F) fluorescens bedömning av representativa prover mätt med EasyCyte flödescytometer. Histogram representera ungated spermier och skräp (A, D), gated spermier (B, E), distribution av spermier till livskraftiga (grön) och döda (röd) celler (C) och distribution av spermier att polariserade (gul) och Aricebo) grön) mitokondriella membranet (F). Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: fluorescens bedömning av representativa prover integritet på akrosomen mätt med EasyCyte flödescytometer. (A) Histogram ungated spermier och skräp. (B, C) Histogrammen för gated spermier med utvärdering av akrosomen integritet utförs med färdiga att använda kit, läsa med anpassad inställning 'InCyte', dividera resulterande histogrammet gated spermier i tre områden: markör, som representerar försumbar, låg-fluorescerande celler med intakt, ofärgade akrosomen (R1), låg fluorescerande celler med resterande målat del av akrosomen (R2) och starkt fluorescerande celler med stört akrosomen (R3). Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Genomsnittligt antal celler | Vialbility | Mitokondriella membranet potential | Akrosomen integritet | ||||||
| Livskraftig | Döda | Aricebo | Polariserade | Baserat på röd/grön | Intakt akrosomen | Reagerade akrosomen | Störd akrosomen | ||
| Fyrbäddsrum färgning | 253 | 32,7 ± 1,53% | 67,3 ± 1,53% | 65,7 ± 2,25% | 34,3 ± 2,52% | 0,5 ± 0,06 | 37,3 ± 7,2% | 38,0 ± 5,7% | 24,3 ± 3,0% |
| Flöde Cytomtery | 5 000 | 32,3 ± 2,08% | 67,7 ± 2,08% | 65,0 ± 1,00% | 35,0 ± 1,00% | 0,5 ± 0,02 | 39,5 ± 5,7% | 39,5 ± 6,5% | 21,0 ± 8,0% |
Tabell 1: jämförelse av de två fluorimetriskt teknikerna för bedömning av spermier membran. Samma spermier proven utvärderades livskraft, mitokondriella membranpotential och akrosomen integritet med hjälp av samtidiga Fyrbäddsrum färgning och flödescytometri. Data presenteras som genomsnitt andel ± SD av de undersökta celler, beräknas för 3 replikat.
Figur 5: Annexin V och PI fluorescens av ett representativt prov mäts av en flödescytometer. Histogram representerar (A) ungated spermier och skräp och (B) fördelningen av de gated spermier till tidig apoptotiska (AV +, PI-), apoptotiska (AV +, PI +), livskraftig (AV-, PI-) och nekrotisk (AV-, PI +) celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spermier befruktning potentiella beror på flera faktorer avspeglar dess kvalitet. En hög koncentration av spermier och en hög andel mycket progressivt motila spermier kan anses hög kvalitet sperma. Dock sådan utvärdering tar inte hänsyn till andra cellulära och funktionella parametrar. Användningen av 'bänk' microcapillary flödescytometer kan lätt anpassas till utvärdering av olika spermier strukturer med fluorescerande sonder, som tidigare visat av andra17 och visade häri (teknik #3). Exempelvis spermier akrosomen integritet är mycket viktig för förekomst av framgångsrika naturliga befruktningen och därför noggrann utvärdering av acrosomal status är befogad. En sådan utvärdering kan utföras enkelt för klassificering av akrosomen status med hjälp av mönster av fluorescerande färgning (FITC-PSA, FITC-PNA, dvs teknik nr 1, som tidigare beskrivits)1,3. I synnerhet är det mycket viktigt att bestämma andelen spermier med intakt akrosomen (dvs. uppvisar en ofärgade akrosomen) i förhållande till dem med skadade akrosomen. Med avseende på den sistnämnda, spermien med skadade akrosomen kan ställa ut (i) en fullt färgade acrosomal cap, vilket indikerar att membranet är skadad, aktivera färgämnet att strömma genom membranet till den akrosomen vesikler; (ii) akrosomen-reagerade spermier som uppvisar endast återstående akrosomen innehåll, vilket indikerar att AR redan har inträffat (dvs pseudo AR). Det bör noteras att en sådan utvärdering kan också utföras med den dedikerade flödescytometer.
Ready-to-use livskraft & akrosomen integritet kit definierar både spermier livskraft (viabla eller döda) och acrosomal integritet (intakt eller störd). Här, vi föreslår att du använder en dedikerad flödescytometer för att definiera de tre ovannämnda acrosomal statusvärdena (dvs, intakt, skadad, reagerade). Vi anpassade microcapillary flöde cytometer plattformen för noggrannare utvärdering, som identifierar akrosomen-reagerade spermier (dvs låg fluorescens) samtidigt utesluta dem från de med störd akrosomen (hög fluorescens), snarare än inklusive dem med dem som har en intakt akrosomen. Detta ger en exakt andel spermier med funktionella eller icke-funktionella akrosomen. Spermier med reagerade akrosomen samt störd acrosomal membran har förlorat sin förmåga att befrukta en äggcell. Dessutom korrekt analys kan kasta ljus över mekanismen bakom akrosomen ändring, dvs., skadad akrosomen membran vs. pseudo akrosomen aktivering.
Vi jämförde resultaten med teknik #1 och teknik nr 2, och hittade stor kompatibilitet mellan dem, särskilt i utvärderingen av livskraft och ΔΨm (tabell 1). En av de främsta fördelarna med att använda den den dedikerade flödescytometer är det stora antalet utvärderade spermier i förhållande till det lilla antalet spermier som utvärderas i praktiken av fluorescensmikroskopi och sonder (tusentals vs. hundratals, respektive ). Det sistnämnda förfarandet är dessutom tidskrävande och subjektiva, även när de utförs av en erfaren observatör. Som flödescytometri upptäcker bara partikel-associerade fluorescens, finns det ingen anledning att tvätta obundna sonden från den lösning som är en tidskrävande steg17. Å andra möjliggör fluorimetriskt bedömningen av spermier membran beskrivs i teknik #1 samtidig bedömning av flera hinnor. Vi kunde använda så många som fyra fluorescerande sonder grupp1,3.
Det bör slutligen noteras att den dedikerade flödescytometer utvecklades som en öppen analys modul, som ger alla grundläggande verktyg för provet förvärv och dataanalys. Förvärv funktionen möjliggör att samla olika typer av information från en cell prov och därför tillåter anpassning för noggrannare utvärdering, som visas här för akrosomen status och apoptotiska index.
Sammanfattningsvis, är de metoder som beskrivs i detta dokument mycket användbara för utvärdering av sperma kvalitet. Att undersöka spermie membran är mycket viktigt för att bestämma spermier befruktning kompetens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka ”SION” israeliska företaget för artificiell insemination och avel (Hafetz-Haim, Israel) för deras hjälp och samarbete och Ms. Li Na (IMV teknik, L'Aigle, Frankrike) för hjälp med instrumentet installation och utbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20x stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
