Summary
Burada, metodolojileri spermatozoan membran bütünlüğü, sperm fertilizasyon yetki ile ilişkili bir hücresel özellik değerlendirmek için mevcut. Biz sperm membran fluorimetric değerlendirilmesi için üç teknikler tarif: eşzamanlı belirli floresan problar, floresans mikroskobu ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi ile boyama. Örnek yöntemleri birleştirerek da sunulmaktadır.
Abstract
Standart spermiograms sperm kalitesini açıklayan çoğunlukla ejakülat hacmi ve konsantrasyonu, hareketliliği ve ilerici hareketliliği ve sperm morfolojisi ve canlılık gibi fizyolojik ve görsel parametreleri temel alır. Ancak, bu değerlendirmeler sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değil. Sperm canlılığı ve döllenme potansiyel bakım membran bütünlüğü ve hücre içi işlevine bağlıdır göz önüne alındığında, bu parametrelerin değerlendirilmesi daha iyi bir tahmin sperm fertilizasyon yeterlilik etkinleştirmek. Burada, floresan mikroskopi veya akış sitometresi analizleri ile birlikte belirli floresan problar kullanarak sperm kalitesini değerlendirmek için üç uygun yöntemleri açıklanmaktadır. Analizleri değerlendirildi plazma membran bütünlüğü (DAPI) 4', 6-diamidino-2-phenylindole kullanarak ve propidium iyodür (PI), acrosomal membran bütünlüğü floresein isothiocyanate Birleşik kullanarak Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) ve Mitokondrial membran bütünlüğü kullanarak 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1). Bu yöntemler kombinasyonları da sunulmaktadır. Örneğin, V annexin kullanım apoptosis değerlendirilmesi ve apoptotik sperm (apoptotik dizin) oranı hesaplama PI fluorochromes sağlar ile birlikte. Spermatozoon membranlar inceleyerek üzerinde temel alır, bu metodolojileri sperm kalitesinin değerlendirilmesi için çok yararlı olduğuna inanıyoruz.
Introduction
Bütünlük ve sperm membran işlevselliğini sperm canlılığı ve fertilizasyon potansiyeli gösteren faktörlerden birkaçıdır. Plazma zarı böylece hücresel ozmotik denge1bakımı, hücre içi ve hücre dışı bölmeleri arasında bir bariyer görevi görür. Plazma membran bütünlüğü zarar indükler herhangi bir stres homeostazı bozabilir, canlılık ve döllenme kapasite azaltmak ve hücre ölümü artırmak. Örneğin, dondurma sperm canlılığı nedeniyle sıcaklık değişiklikleri ve ozmotik stres2bir sonucu olarak onun plazma zarı zarar azaltır. Biz daha önce gıda kaynaklı kirleticiler pestisit atrazine, onun büyük metaboliti diaminochlorotriazine veya mikotoksin Aflatoksin B1, gibi düşük konsantrasyonlarda boğa sperm açığa sperm canlılığı1,3 azaltır rapor . Bu PI, hasarlı bir plazma zarı içeren hücrelerin DNA bağlar ile birlikte çift iplikçikli DNA DAPI ile etiketleme tarafından tespit edilmiştir.
Füzyon acrosomal enzimler4,5sürümde kaynaklanan örten plazma zarı ve dış acrosome membran acrosome reaksiyon (AR) içerir. Zona pelusida penetrasyon ve daha fazla sperm yumurta6ile birleştirilmesi için önemli olaylar bunlar. Bu nedenle, acrosomal membran bütünlüğü değerlendirilmesi erkek üreme7,8,9ve sperm kalitesini değerlendirmek için yararlı bir parametre kabul ettiğiniz anlamına gelir. Çeşitli floresan teknikler acrosome bütünlüğü, FITC-PNA uygulamasına ait veya FITC-PSA8,10doğrulaması için uygundur. FITC-PSA boyama1,3, kalıpları kullanarak bizim önceki çalışmalarda biz sağlam acrosome doğru tanımları (ı) için sağlanan (II) zarar acrosome membran ve (iii) acrosome tepki gösterdi. Geçerli rapordaki sperm adanmış akış sitometresi kullanarak acrosome durumunu değerlendirmek ve bu floresans mikroskobu kullanarak sonuçları karşılaştırın.
Mitokondri çok fonksiyonlu organelleri, diğer şeyler, ATP sentezi, reaktif oksijen türleri üretim, kalsiyum sinyal ve Apoptozis arasında yer vardır. Fizyolojik işlev bozuklukları, kısırlık, erkek ve kadın da dahil olmak üzere değiştirilmiş mitokondriyal işlev11ile ilişkilidir. Sperm mitokondri midpiece içinde düzenlenir ve sperm hareketliliği12' çok önemli bir rol oynamaktadır. İyi yüksek mitokondri zar potansiyel (ΔΨm) yüksek fertilizasyon kapasitesi13ve normal hareket ile ilişkili olduğunu kabul edilir. Buna ek olarak, düşük ΔΨm reaktif oksijen türleri yükseltilmiş bir düzeyiyle ilişkilidir ve döllenme oranı14düşük. Yine de, çeşitli çevresel bileşenleri, örneğin Endokrin bozucular, hücresel stres teşvik ve ΔΨm, hyperpolarization1,3, artan üretim serbest radikallerin ve sonunda geçici bir artış yol, Apoptozis15. Floresan sonda 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1) sağlar örneğin, sperm ΔΨm1,3gıda kaynaklı toksinler etkilerini inceleyerek.
Standart spermiograms fizyolojik ve morfolojik parametreleri temel alınarak, sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değildir. Daha doğru yöntemleri sperm kalitesini sağlamak için gereklidir. Burada, sperm membran değerlendirme üzerinde dayalı sperm kalitesini belirlemek için kullanabileceğiniz iki uygun yöntem sağlamak: aynı anda dört kişilik belirli floresan problar ve bizim çalışmalar1,3 ' te açıklanan floresans mikroskobu ile boyama ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi, son zamanlarda kullanılan bizim laboratuvar ve başkaları tarafından zaten kullanılmakta16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler için hayvan refah 1994 İsrail yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sığır sperm Suni tohumlama ve ıslahı için ticari İsrail şirketi tarafından sağlandı. Cinsel ilißki 11 boğa bu çalışmada değerlendirildi.
1. sperm hazırlama örnek
Not: Yordamı Roth Laboratuvarı protokol1,3temel alır.
- Yaklaşık 1-6 mL, Boğa Meni oda sıcaklığında 15 mL tüp içinde elde edilir.
- Her 1 ml sperm, prewarmed (37 ° C'de) NKM arabellek (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM süpürgeyi [3-N-morphilino propanesulfonic asit; pH 7.4]) 6 mL ekleyin ve süpernatant kadar 1-2 kez 8 dk 600 x g, az temizleyin için santrifüj kapasitesi.
Not: Sperm konsantrasyonu veya ilk iki tüp ilk yıkama bölünmüş çok yüksek ise. - Çıkarmak ve temiz süpernatant atmak ve yaklaşık 1 cm süpernatant Pelet yukarıda bırakılır.
- Dikkatlice yukarı yüzmek ve 37 ° C'de yüzmeyi sperm elde izin vermek için 20-30 dakika bekleyin sperm için yüzey alanını artırmak için bir 30 ° açıyla tüpler yalın
Not: Bulanıklık görülebilir. - Bir micropipette dikkatli bir şekilde kullanarak, yeni bir 1,5 mL tüp hareketli sperm hücreleri içeren süpernatant üst 1 mL kaldırın.
- Sperm 37 ° C'de kullanımda kadar devam.
- Neubauer hemasitometre kullanan sperm sayısı tahmini.
Not: Farklı bir sayım odası bunun yerine kullanılabilir, ancak sayma farklıdır.- Spermatozoon hareket önlemek için hareketli sperm hücreleri 100 µL ile Çift Kişilik distile su (DDW) (1: 100 seyreltme) 15 mL tüp 10 mL seyreltik ve karışımı yavaşça.
- Örnek 10 µL hemasitometre ve coverslip her iki tarafında yükleyin. Bu bir yanlış sperm sayısı neden olabileceğinden kabarcık oluşumu odası içinde önlemek emin olun.
- 20 X amacı ile bileşik mikroskopla gözlemlemek.
Not: Bir hemasitometre üzerinde tam bir kılavuz görüntüler 9 büyük kareler, her 1 mm2ve coverglass 0,1 mm odası kat duruyor. Böylece, Merkez sayım alanı üzerinde 0,1 mm3 veya 0,1 µL birimdir. Hemasitometre merkez alan 25 orta kareler içerir ve her bir orta boy kare tek satırları ile 16 küçük kareler vardır. - Toplam 4 Orta köşe kareler ve merkezi kare bulunan hücreleri sayar. Daha yüksek kesinlik iki odaları (Neubauer hemasitometre her iki tarafında) saymak ve ortalama hücre toplama hesaplamak için kullanın.
- Sperm sayısını 5 (alan sayma başına hücre sayısı elde etmek için) ve 10.000 (seyreltilmiş örnek 1 mL başına hücre sayısı elde etmek için) tarafından elde edilen ortalama sayıyı çarparak hesaplayabilirsiniz. Sonra elde edilen sayısı seyreltme faktörü (1: 100) tarafından çarpın.
Not: Örneğin, bir ortalama 5 25 orta kareler iki odaları merkezi sayım alanı içinde sayılan sperm 150 sayısıdır ([152 + 148] / 2). Böylece, ortalama spermlerinin odası (veya başına 0.1 µL) 150 x 5 = 750 sayısıdır. 750 seyreltilmiş örnek (7.500.000) 1 mL başına hücre sayısı elde edilir ve sonra 100 mL orijinal meni örneği başına 75 x 107 hücre elde etmek için (seyreltme faktörü) ile çarpın 10.000 çarpın.
2. Teknik #1: Aynı anda birden çok floresan kullanarak Sperm membran değerlendirilmesi probları
Not: Sperm membran (plazma, acrosomal ve mitokondrial) daha önce Celeghini ve ark.10, bazı değişikliklerle tarafından açıklandığı gibi değerlendirildi. Epifluorescent mikroskobu ile 450-490 nm, uyarma ve emisyon 515-565 nm çift kişilik bir filtre kullanarak, bir dijital fotoğraf makinesi ile birlikte kullanılmıştır.
-
Hisse senedi çözümleri hazırlayın.
- 0.1 mg/mL, DAPI 5 mg fosfat tamponlu tuz (PBS) 50 ml çözülerek DAPI hisse senedi çözüm hazırlamak. 50 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın Önce kullanma, PBS ile hisse senedi çözüm 1:10 at (çalışma çözüm; 10 µg/mL) oranında seyreltin.
- 1 mg/mL FITC-PSA 1 mg 1 ml PBS çözülerek FITC-PSA hisse senedi çözüm hazırlamak. 50 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın Önce kullanma, PBS ile hisse senedi çözüm 1:10 at (çalışma çözüm; 100 µg/mL) oranında seyreltin.
- 1 mg/mL JC-1 hisse senedi çözüm JC-1 1 mg dimetil sülfoksit (DMSO) 1 ml çözülerek hazırlayın. 10 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın Önce kullanma, DMSO ile hisse senedi çözüm 1:10 at (çalışma çözüm; 0.1 mg/mL) oranında seyreltin.
- PI hisse senedi çözüm PI 10 mg (veren 2.5 mg/mL) PBS 400 µL içinde çözülerek hazırlayın. Mağaza, + 4 ° c PBS ile stok 1 1:20 at (çalışma çözüm; 0,125 mg/mL) oranında seyreltin. 4 ° C'de bir hisse senedi çözüm olarak depolar.
Dikkat: PI potansiyel bir alkil ve dikkatle ele alınmalıdır. Boya güvenli bir şekilde ve geçerli yerel düzenlemeler uyarınca bertaraf gerekir.
- Hareketli sperm (adım 1.5) 133 µL yeni bir 1,5 mL tüp (25 x 106 sperm/mL) aktarın.
Not: Örnek konsantrasyonu yüksek ise, gerekli toplama ulaşmak için NKM arabellekte seyreltik; yüzmek kadar örnek örnek konsantrasyon düşükse, 1000 x g 5 min için de yüzmeyi sonra elde edilen süpernatant santrifüj kapasitesi, 0.5 mL süpernatant kaldırmak ve tekrar sperm Sayın. - 17 µL DAPI (çalışma çözüm) ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- 1000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- Pelet için 100 µL NKM arabelleği ekleyin.
- 50 µL FITC-PSA, JC-1'in 2 µL ve Pi (çözümleri çalışma) 3 µL ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- 1000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- Pelet için 40 µL NKM arabelleği ekleyin ve pipetting tarafından resuspend.
- Örnek 10 µL transfer için bir cam slayt, smear ve coverslip.
-
Hemen bir dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış bir çift filtreli epifluorescence mikroskobu (kullanım 40 x amaç) tarafından görselleştirmek ve her filtre için ayrı ayrı fotoğraf çekme.
Not: Görselleştirildiği filtreleri açısından önemi vardır.- 358 nm, uyarma ve emisyon 461, DAPI kanalın altında görsel nm.
- 450 – 490 nm, uyarma ve emisyon 515 – 565 nm, yeşil monomer için FITC kanal altında görselleştirin.
- 488 nm, uyarma ve emisyon 590, kırmızı toplamalar için PI kanalın altında görsel nm.
- JC-1 altında görselleştirmek uyarma 559 nm ve emisyon 574-627 nm; yelpazesi ile kırmızı toplamları JC-1 yeşil monomerleri ile 488 nm ve emisyon 500-535 nm aralığında uyarma.
- Kamera yazılımı "Birleştir" seçeneğini kullanarak, JPG/JPEG formatında filtrelerden alınan üç görüntüleri birleştirme.
- "Boya" aracı ile birleştirilen görüntüyü açın ve sınırlı sayıda sperm hücreleri işaretlemek için fırça seçeneğini kullanın.
-
Sperm hücreleri her sonda yayılan floresans temel sınıflandırmak:
- Genel olarak değerlendirmek slayt başına en az 200 sperm hücreleri — tüm hücreleri mavi görünür (DAPI).
- Canlılığı değerlendirmek ölü hücreleri sayarak, görünme mor (PI [kırmızı] + [Mavi] DAPI) ve ölü hücreleri (ölü hücreler/toplam sayılan hücreleri x 100) yüzdesini hesaplamak.
- Floresan (FITC-PSA) boyama desenleri kullanarak acrosome durumunu değerlendirmek. Farklı desenler (sağlam, bozuk veya tepki acrosome hücreler/toplam sayılan x 100 hücreleri) yüzdeleri hesaplamak.
Not: Hasarlı acrosomal membran tamamen lekeli, yeşil acrosome kap olarak görünür; tepki acrosomal membran kalan yeşil Ekvator veya üst boyama gösterir; sağlam acrosomal membran içeren hücreleri herhangi bir yeşil acrosomal bölgesinin boyama sergileyecek değil. - ΔΨm kırmızı lekeli midpiece sergi ile yüksek ΔΨm, Sperm hücreleri ve yeşil lekeli midpiece sergi düşük ΔΨm ile sperm elde ayrım tarafından değerlendirmek. Kırmızı saymak ve midpieces ayrı olarak yeşil ve onların oranı (kırmızı/yeşil) hesaplar.
3. Teknik #2: Kullanıma hazır kitleri ve akış sitometresi ile Sperm membran değerlendirilmesi
Not: Plazma membran bütünlüğü, mitokondrial membran potansiyeli ve acrosomal membran bütünlüğü değerlendirilmesi liyofilize fluorochromes her iyi içeren kullanıma hazır akış sitometresi kitleri ile gerçekleştirildi. Müdahalede üreticileri bazı değişikliklerle göre.
-
Plazma membran bütünlüğü değerlendirme
- Canlılık ve konsantrasyon seti (PI ve SYbr14) paket kuyulardan istenen sayıda alabilir, onları çalışma taban ve kapağı esnek bir kapak ile transfer (ışıktan korumak).
- 199 µL sitometresi iyi ücret için arabelleğe alınan çözümü ekleyin.
- Homojen meni 1 µL 57 x 106/mL (iyi başına 57,000 hücreleri) ekleyin ve pipetting tarafından homojenize.
- Plakayı siyah kapaklı kapağı.
- Işıktan korunan 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya.
- Örnek ayar 'canlılığı ile' akış sitometresi çalıştırın.
-
Mitokondrial membran potansiyeli
- Mitokondrial aktivite seti (JC-1) paket kuyulardan istenen sayıda alabilir, onları çalışma taban ve kapağı esnek bir kapak ile transfer (ışıktan korumak).
- Mutlak etanol iyi başına 10 µL ekleyin ve pipet mevcut toz içinde iyi resuspend.
- Pipetting tarafından homojenize ve PBS 190 µL iyi başına ekleyin.
- Homojen meni 0,75 µL 57 x 106/mL (iyi başına 50.000 hücreleri) ekleyin ve pipetting tarafından lunaparkçı.
- Plakayı siyah kapaklı kapağı.
- Işıktan korunan 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
- Üzerinden ayar ʽmitochondrial aktivite ile akış sitometresi örneği çalıştırmak '.
-
Acrosomal membran bütünlüğü
Not: (Bkz: tekniği #1) FITC-PSA boyama 3 acrosome Kategoriler (sağlam acrosome, tepki acrosome ve hasarlı acrosome) değerlendirilmesi sağlar. Akış Sitometresi ve canlılığı ve acrosome bütünlük kiti (PI ve FITC-PNA) kullanarak, Sperm hücreleri bu 3 kategoriye ayrılır.- Canlılığı & acrosome bütünlük kiti paket kuyulardan istenen sayıda alabilir, onları çalışma taban ve kapağı esnek bir kapak ile transfer (ışıktan korumak).
- Sitometresi iyi ücret için tampon çözeltinin 200 µL ekleyin.
- Homojen meni 0.7 µL 57 x 106/mL (iyi başına 40.000 hücreleri) ekleyin ve pipetting tarafından lunaparkçı.
- Plakayı siyah kapaklı kapağı.
- Işıktan korunan 37 ° C'de 45 dk için kuluçkaya.
- Ayar ʽInCyte ile akış sitometresi örneği çalıştırın '.
- Üç işaret alanda floresan yoğunluğu göre çoğunluğuna göre sonuç çubuk grafik analiz, önemsiz, düşük Floresanda hücreleri ile bozulmamış, günahı acrosome (R1) temsil eden, düşük Floresanda ile acrosome (R2) parçası lekeli kalan hücreleri ve Son derece Floresanda hücreleri ile kesintiye acrosome (R3).
Not: Araç kullanım kılavuzu "diğer modüller kullanılarak elde dosyalarını çözümleme" bölümünde üç bölgeler (R1, R2, R3) oluşturmak için kullanın.
4. Teknik #3: Floresan problar ve akış sitometresi kullanarak Sperm membran değerlendirilmesi
Not: V annexin kullanım apoptosis değerlendirilmesi ve apoptotik sperm (apoptotik dizin) oranı hesaplama PI fluorochromes sağlar ile birlikte.
- 1 V bağlama arabellek 20 hisse senedi çözüm (V bağlama arabellek 20 x 9.5 mL steril distile su ile hisse senedi çözüm annexin seyreltik 500 µL) x annexin x hazırlamak.
- Neubauer hemasitometre 1.7 bölümünde açıklandığı gibi kullanarak sperm sayısı tahmini.
- 106 sperm 1 mL 1 x V bağlama arabellek ve 10 min için 300 x g , santrifüj annexin yıkayın.
- Süpernatant tamamen Aspire edin.
- Pelet 100 µL V bağlama arabellek annexin x 1 resuspend.
- Annexin v FITC için Birleşik 10 µL ekleyin.
- Mix iyi ve 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Sperm hücreleri 300 x g 10 min için de 106 hücreler ve santrifüj başına 1 x V annexin bağlama arabellek 1 mL ekleyerek yıkayın.
- Süpernatant tamamen Aspire edin.
- Hücre Pelet 106 toplam hücre başına 1 x V annexin bağlama arabellek 500 µL resuspend.
- 1 µg/mL PI ile bir Akış Sitometresi Analizi hemen önce ekleyin.
- ʽInCyte ayarla akış sitometresi örneği çalıştırın '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 gösterir aynı anda fluorimetric sperm membran (plazma, acrosomal ve mitokondrial) değerlendirilmesi PI, DAPI, FITC-PSA ve JC-1 kullanarak. Aynı anda dört floresan problar ile boyama kullanarak sperm membran değerlendirmesini sağlar, örneğin, her kategoride sperm oranı değerlendirilmesi — canlı ölü vs ; yüksek ve düşük ΔΨm; sağlam vs. acrosome zarar — aynı anda her spermatozoon için.
Şekil 2 membran değerlendirme fluorimetric sondalar kullanma sperm sonuçlarını sunar. En az %80 hareketli sperm elde bulunan sperm denemede kullanılmıştır. En az 200 hücre boğa incelenmiş. Sperm örnek kalite membran bütünlüğü açısından farklılıkları değerlendirmek mümkündü. Örneğin, boğa No 7 boşalmak nispeten düşük bir yüzde vardı ölü hücrelerden, sperm ile sözde düşük bir oranda tepki acrosome ve mitokondrial membran potansiyeli, boğa No 1 boşalmak ile karşılaştırıldığında daha yüksek.
Şekil 3 canlılık (Şekil 3A-3 C) ve mitokondrial etkinliği (şekil 3D-3F) değerlendirilen temsilcisi örnekleri gösterir. Floresans yoğunluklarda örneklerin özel yazılımı ile bir özel microcapillary sperm akış sitometresi tarafından değerlendirildi. Bu akış sitometresi bir katı fazlı mavi lazer içerir (448 nm) ve iki photodiodes: ileri dağılım ve yan dağılım. Özellikle sperm emisyon özellikleri üç photomultiplier tüp ile ölçer (yeşil: 525/30 nm, sarı: 583/26 nm; kırmızı: 655/50 nm) ve optik filtreler ve ayırıcılar16barındırır. Analiz başına 5000 sperm değerlendirme sağlar.
Canlılığı değer biçmek teçhizat bir sonda uygun (sağlam plazma zarı) ve ölü (hasarlı plazma zarı) sperm hücreleri (Şekil 3 c) fark geçirgenliği ile içerir. Sperm ΔΨm değerlendirildi ayırt eder bir seti kullanarak polarize mitokondri zar (floresan turuncu renkte görünen) ve depolarized mitokondri zar (floresan yeşil görünen) (Şekil 3F).
Şekil 4 kapı sperm çıkan histogram üç işaretçisi alana bölen akış sitometresi (rakamlar 4A-4 C), ile okumak kullanıma hazır kiti ile gerçekleştirilen acrosome bütünlük değerlendirilmesi sunar, ihmal edilebilir düşük Floresanda hücreleri temsil eden sağlam, günahı acrosome (R1), düşük Floresanda ile acrosome (R2) parçası lekeli kalan hücreleri ile kesintiye acrosome (R3) ile yüksek Floresanda hücreleri.
Tablo 1 sperm membran değerlendirilmesi için iki fluorimetric teknik bir karşılaştırmasını sunar. Üç farklı boğa aynı sperm örnekleri canlılığı, mitokondrial membran potansiyeli (ΔΨm) ve aynı anda dört kişilik boyama yanı sıra akış sitometresi kullanarak acrosome bütünlüğü için değerlendirildi. Her iki teknikleri kullanarak eşleşen sonuç gösterildiği gibi bu karşılaştırma son derece önemlidir. Veri analizi ve öğrenci t-testi tarafından analiz edildi. İstatistiksel olarak anlamlı fark tespit edildi.
Şekil 5 annexin V (AV) ve propidium iyodür (PI) fluorochromes kullanarak apoptosis için değerlendirilen temsil edici bir örnek gösterir. Bu iki kullanım erken apoptotik hücreler (AV +, PI-), apoptotik hücreler (AV +, PI +) ve nekrotik hücre (AV-, PI +) (AV-, PI-), hücrelerin gösteren dört desenleri arasında ayrım sağlar sondalar.
Şekil 1: Epifluorescence photomicrography sperm lekeli aynı anda birkaç floresan problar ile. (A)eşzamanlı) ile dört probları PI, DAPI, FITC-PSA ve JC-1 boyama JC-1 sonda ile lekeli bir çekirdeği ve yüksek mitokondri zar potansiyel (ΔΨm), DAPI boyama ile (B) canlı spermatozoon. (C) ölü spermatozoon hasarlı plazma zarı ile PI sonda ile lekeli, lekeli FITC-PSA sonda ve düşük ΔΨm ile acrosome hasar. (D) Live, spermatozoon kalan Ekvator boyama ve düşük ΔΨm ile acrosome tepki gösterdi. (E) Live, spermatozoon kalan üst boyama ve yüksek ΔΨm ile acrosome tepki gösterdi. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: boğa sperm membran fluorimetric sonda kullanarak değerlendirilmesi. (A)Sperm canlılığı floresan problar 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve propidium iyodür (PI) ile kararlıydım. (B) Acrosome durumu FITC-PSA boyama desenleri göre kararlıydım. Sperm hücreleri ile tepki acrosome oranda sunulur. (C) mitokondri zar potansiyel (ΔΨm) kullanarak Dizayn Merkezi-1 floresan sonda ile ve kırmızı lekeli (yüksek potansiyel) ortalama oranı arasındaki oran olarak sunulan veya yeşil lekeli değerlendirmeye (düşük potansiyel) sperm. Veri hücreleri toplam değerlendirilmiş hücrelere yüzde olarak sunulmaktadır. En az 200 sperm boğa analiz edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: canlılık (A-C) ve mitokondrial etkinlik (D-F) Floresan değerlendirme temsilcisi örneklerinin EasyCyte akış sitometresi tarafından ölçülen. Çubuk grafikler ungated sperm elde ve geçişli enkaz (A, D), Sperm hücreleri (B, E), sperm uygun (yeşil) ve ölü (kırmızı) hücreleri (C) dağıtım ve dağıtım için polarize (sarı) ve depolarized (sperm temsil eder yeşil) mitokondri zar (F). Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: floresan değerlendirme temsilcisi örnekleri acrosome bütünlüğünü EasyCyte akış sitometresi tarafından ölçülen. (A)Histogram ungated sperm hücreleri ve enkaz. (B, C) Kullanıma hazır kit, adapte ayarıyla 'InCyte' sonuç histogramını bölen, okumak ile gerçekleştirilen acrosome bütünlük değerlendirilmesi ile geçişli sperm histogramlar sperm hücreleri ihmal edilebilir temsil eden üç işaretçisi alana, geçişli, düşük Floresanda olduğu gibi günahı acrosome (R1), düşük Floresanda hücreleri ile acrosome (R2) ve son derece Floresanda hücrelerle parçası lekeli kalan hücrelerle acrosome (R3) bozulur. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hücrelerin ortalama No | Vialbility | Mitokondrial membran potansiyeli | Acrosome bütünlüğü | ||||||
| Uygun | Ölü | Depolarized | Polarize | Kırmızı/yeşil oranı | Sağlam Acrosome | Tepki Acrosome | Kesintiye Acrosome | ||
| Dört Kişilik boyama | 253 | %1.53 32.7 ± | 67.3 ± %1.53 | 65,7 ± %2.25 | 34,3 ± %2.52 | 0.5 ± 0,06 | %7.2 37,3 ± | 38,0 ± % 5.7 | 24.3 ± %3,0 |
| Akış Cytomtery | 5000 | 32,3 ± %2.08 | 67.7 ± %2.08 | 65,0 ± %1.00 | %1.00 35,0 ± | 0.5 ± 0,02 | 39,5 ± % 5.7 | % 39,5 ± 6,5 | 21,0 ± %8.0 |
Tablo 1: sperm membran değerlendirilmesi için iki fluorimetric teknik karşılaştırılması. Aynı sperm örnekleri canlılığı, mitokondrial membran potansiyeli ve aynı anda dört kişilik boyama ve akış sitometresi kullanarak acrosome bütünlüğü için değerlendirildi. Veri oranı ± SD için 3 çoğaltır hesaplanan muayene hücrelerinin demek gibi sunulmaktadır.
Şekil 5: ölçülen bir akış sitometresi tarafından temsil edici bir örnek V ve PI floresan Annexin. Çubuk grafikler temsil(a)ungated sperm hücreleri ve enkaz ve (B) dağıtım için erken apoptotik (AV +, PI-), apoptotik (AV +, PI +), geçişli sperm uygun (AV-, PI-) ve nekrotik (AV-, PI +) hücreleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sperm fertilizasyon potansiyel çoklu kalitesini yansıtan faktöre bağlıdır. Sperm hücreleri yüksek konsantrasyon ve çok kademeli hareketli sperm hücreleri yüksek oranda yüksek kaliteli sperm kabul olabilir. Yine de, böyle bir değerlendirme dikkate almaz diğer hücresel ve fonksiyonel parametreler. 'Tezgah üstü' microcapillary akış sitometresi kullanımı floresan problar, daha önce başkaları tarafından17 gösterilen ve burada (tekniği #3) gösterildiği gibi kullanarak çeşitli sperm yapıları değerlendirilmesi için kolayca adapte edilebilir. Örneğin, sperm acrosome bütünlüğü son derece başarılı doğal gübreleme oluşumu için önemlidir ve bu nedenle, kesin acrosomal durum değerlendirilmesi garanti kapsamındadır. Böyle bir değerlendirme sınıflamasına göre (FITC PSA, FITC-PNA uygulamasına ait, yani, tekniği 1, daha önce açıklandığı gibi) boyama floresan kalıpları kullanarak acrosome durumunu kolayca gerçekleştirilebilir1,3. Özellikle, sperm ile bozulmamış acrosome oranını belirlemek son derece önemlidir (yani, bir günahı acrosome sergileyen) göre bu hasarlı acrosome ile. İkincisi, sperm ile hasarlı acrosome saygı ile membran, membran ile acrosome vezikül akmaya boya etkinleştirme bozuk olduğunu gösterir (i) tamamen lekeli acrosomal kap sergilemek; (II) AR zaten gerçekleştiğini sadece kalan acrosome içerik, (yani, sözde AR) sergi acrosome tepki sperm. Böyle bir değerlendirme de özel akış sitometresi ile yapılması gerekmektedir.
Kullanıma hazır canlılığı & acrosome bütünlük seti her iki sperm canlılığı (canlı veya ölü) tanımlar ve acrosomal bütünlüğü (sağlam veya kesintiye). Burada, biz üç söz konusu acrosomal durumları tanımlamak için ayrılmış akış sitometresi kullanmanızı öneririz (örneğin, sağlam, zarar, tepki). Biz microcapillary akış sitometresi platformu acrosome tepki sperm (yani, düşük floresan) tanımlayan daha doğru değerlendirme için bu kesintiye acrosome (yüksek floresan), ile ise hariç onları dahil olmak üzere yerine uyarlanmış Bu sağlam bir acrosome olan. Bu işlev veya işlevsiz acrosome sperm doğru bir oranda verir. Sperm tepki acrosome yanı sıra kesintiye acrosomal membran ile oosit döllemek için yeteneklerini kaybetmiş. Ayrıca, doğru analiz acrosome değiştirme, yani altta yatan mekanizma ışık, acrosome membran sözde acrosome harekete geçirmek vs zarar görmüş.
Biz teknik #1 ve #2 tekniği ile elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında ve aralarında, büyük uyumluluk özellikle canlılık ve ΔΨm (Tablo 1) değerlendirme içinde buldum. Kullanarak ana avantajlarından biri özel akış sitometresi değerlendirilmiş sperm pratikte floresans mikroskobu ve sondalar tarafından değerlendirilir sperm hücreleri küçük sayısına oranla büyük bir sayıdır (vs yüzlerce, binlerce sırasıyla ). Ayrıca, zaman alıcı ve öznel, ikinci yordamı bile deneyimli bir gözlemci tarafından gerçekleştirildiğinde. Akış Sitometresi parçacık ilişkili floresans sadece algılarken, zaman alıcı adım17yaşında çözümden ilişkisiz sonda yıkamak için gerek yoktur. Öte yandan, sperm membran tekniği # 1'de açıklanan fluorimetric değerlendirilmesi aynı anda birden fazla membranlar değerlendirmesini sağlar. En çok dört floresan problar birlikte1,3kullanmak başardık.
Son olarak, özel akış sitometresi örneği toplama ve veri analizi için tüm temel araçları sağlayan bir açık tahlil modülü olarak geliştirilmiştir unutulmamalıdır. Toplama işlevi çeşitli türde bilgilere bir hücre örnek toplama sağlar ve uyum için daha doğru değerlendirme, acrosome durum ve apoptotik dizin için aşağıda gösterildiği gibi izin verir.
Sonuç olarak, bu makalede açıklanan yöntemleri çok sperm kalitesi değerlendirme için yararlıdır. Spermatozoon membranlar inceleyerek sperm fertilizasyon yetkinlik belirlemek için önem arz etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması vardır bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar "SION" İsrail şirketi Suni tohumlama ve üreme (Hafetz-Haim, İsrail) için onların yardım ve işbirliği ve Bayan Li Na (te teknolojileri, L'Aigle, Fransa) araç kurulum ve eğitim ile ilgili yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20x stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
