Antimikrobielle synergi testing brukes til å evaluere effekten av to eller flere antibiotika som brukes i kombinasjon og utføres vanligvis av en av to metoder: sjakkbrett matrisen eller tid-kill analysen. Her presenterer vi en automatisert, inkjet-skriver-assistert sjakkbrett matrise synergi teknikk og en klassisk tid-kill synergi studie.
Som priser multidrug-resistente (MDR) patogener fortsetter å stige, outpacing utviklingen av nye hemmestoffer, blir stadig mer romanen tilnærminger til behandling av MDR bakterier en nødvendighet. En slik tilnærming er Kombinasjonsbehandling, i som to eller flere antibiotika brukes sammen til å behandle en infeksjon mot en eller begge av narkotika kan være ineffektiv alene. Når to stoffer, i kombinasjon, utøve større enn additiv effekt, de anses synergistisk. In vitro undersøkelse av samvirkningen er et viktig første skritt i å vurdere mulige effekten av rusmiddelkombinasjoner. To viktigste i vitro synergi testmetoder er utviklet: sjakkbrett matrisen og tid-kill studien. I dette papiret, vi presentere en automatisert sjakkbrett matrisemetode som gjør bruk av blekk trykking teknologien for å øke effektivitet og nøyaktighet av denne teknikken, i tillegg til standard manuell tid-kill synergi metode. Automatiske sjakkbrett matrisen kan tjene som en høy gjennomstrømming screening analysen, mens manuelle tid-kill studien gir ekstra, utfyllende data om samvirkningen og drap.
Sjakkbrett matrisen er en modifikasjon av standard minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testing, hvor bakterier inkubert med antibiotika på ulike konsentrasjon kombinasjoner og vurdert for vekst hemming etter overnatting inkubasjon. Manuell ytelse i sjakkbrett matrisen krever en arbeidskrevende og feilutsatte rekke beregninger og fortynninger. I det automatiserte metoden presenteres her, beregning og utlevering av nødvendige antibiotika lagerløsning volumer er automatisert gjennom bruk av inkjet-skriverteknologi. I tid-kill synergi analysen, er bakterier inkubert med antibiotika interesse, både sammen og individuelt og samplet i intervaller i løpet av 24 timer for kvantitative kultur. Resultatene kan avgjøre om en kombinasjon er synergistiske og om det er bakteriedrepende og gi data på hemming og drap av bakterier over tid.
Spredning av multidrug-resistente (MDR) bakteriell patogener, spesielt MDR Gram-negative bakterier som carbapenem-resistente Enterobacteriaceae (Grobunn), har forlatt klinikere med stadig mer begrensede muligheter for vellykket anti-infective terapi 1, et problem forverret av treg tempoet roman antibakterielle stoff oppdagelsen2,3. Antimikrobielle synergi, der to stoffene i kombinasjon øve en større-enn-additiv effekt, gir mulighet for hevingen eksisterende antibiotika for bruk i behandling av MDR bakterier, selv når disse bakteriene er motstandsdyktig mot en eller begge av de antibiotika individuelt. Teknikkene som beskrives i denne artikkelen gir utfyllende metodene i vitro synergi tester som, når de brukes sammen, spesialopplæring for etterforskere slik effektivt skjermen antimikrobielle kombinasjoner av interesse for bevis på samvirkningen (den automatiserte Sjakkbrett matrisemetode) og så videre evaluere the kinetics av hemming og drap demonstrert av lovende kombinasjoner i screening scenen (manuell tid-kill-metoden).
En av de mest brukte metodene i vitro synergi testing er sjakkbrett array analysen, en endring av minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testing som hemmende aktiviteten til to forskjellige antibiotika mot en bakteriell isolere testes over en rekke konsentrasjon kombinasjoner4,5. Hvis de to stoffene utøve større enn additiv aktivitet når de brukes sammen, regnes kombinasjonen synergistisk6. Imidlertid innebærer sette opp et sjakkbrett utvalg manuelt en rekke beregninger og utvannende og pipettering trinnene som er arbeidskrevende og sårbare for menneskelige feil. Disse betingelsene har hatt effekt av å begrense bruken av synergi testing hovedsakelig til retrospektiv evalueringen av liten numrene av antibiotika kombinasjoner og bakteriell isolerer og resultatene har ikke alltid vært konsekvente blant studier7, 8,9,10,11. Videre har kompleksiteten i synergi testing bidratt til sin utilgjengelighet i klinisk mikrobiologi og i fravær av i vitro synergi tester data fra kliniske studier kombinasjon terapi12, 13.
For å øke effektiviteten og gjennomstrømningen av metoden sjakkbrett matrise, gjort vi bruk av et automatisert MIC tester teknikk utviklet i vårt laboratorium som bruker blekk trykking teknologien å nøyaktig og konsekvent dispensere små volumer plate14av antibiotika lagerløsning i brønner i en microtiter. Plattformen obviates behovet for komplekse beregninger og flere pipettering trinn. Den tilknyttede programvaren beregner og dispenses passende mengder antibiotika for å opprette en todimensjonal sjakkbrett matrise hvis brukeren bare innganger området ønsket konsentrasjon og lagerløsning konsentrasjon av antibiotika. Vi testet først denne metoden mot en samling av Grobunn isolerer15 og senere har fokusert på testing colistin inneholder kombinasjoner for aktivitet mot colistin-resistente isolerer16. Colistin er et stoff som siste utvei vanligvis reservert for bruk i behandlingen av MDR Gram-negative patogener17,18, og colistin gjør allerede MDR bakterier nesten pan-resistente19, noe som gjør dem ideelle kandidater til utviklingen av romanen strategier bruker narkotika som de er ufølsomme individuelt. Vi fant at kombinasjonen av colistin og protein syntese hemmer antibiotika minocycline hadde en meget høy rate av synergi, selv mot stammer som var resistente mot hver av disse stoffene, antagelig fordi colistin har en subinhibitory permeabilizing effekt på selv colistin-resistente bakterier. Vi har valgt denne kombinasjonen å bruke som et eksempel i denne artikkelen. Av notatet, kan synergi testing også brukes til å vurdere for forbedret effekten av to stoffene som begge effektiv individuelt.
Automatiske sjakkbrett matrise metoden muliggjør rask, høy gjennomstrømming synergi testing. Men har metoden sjakkbrett matrise begrensninger. Som en modifisert MIC analysen, det gir data bare på hemming av bakterievekst og ikke drepe, og det gir ikke data på antibiotika effekter over tid. Derimot manuell ytelsen til tid-kill synergi analyser er mer arbeidsintensiv, men gir informasjon om både hemming og drap over 24 h klokkeslett kurs20,21. Vi brukte tid-kill analyse på et mindre antall isolerer å bekrefte vår sjakkbrett matrise resultater og å finne ut om synergistisk kombinasjonene vi identifisert var også bakteriedrepende.
Både sjakkbrett matrise og tid-kill synergi metoder gir verdifull informasjon om aktiviteten på rusmiddelkombinasjoner, og er spesielt nyttige i å vurdere potensielle romanen behandlingsalternativer for svært motstandsdyktig bakteriell patogener. Metodene har iboende begrensninger. Standard microbroth fortynning MIC metoden har mange kjente forventet feil 1 todelt fortynning22, som øker når to stoffer er testet sammen i et sjakkbrett array. Standard definisjon av synergi, som vurderer en kombinasjon synergistisk hvis narkotika er aktive sammen på en fjerdedel deres respektive mikrofoner6, tar hensyn til dette forventet variasjon, men slike variasjoner (som antas å resultere fra en kombinasjon av biologiske og tekniske svingninger23) uunngåelig genererer usikkert om påliteligheten til synergi resultater. Mangel på etablerte kvalitetskontroll standarder for synergi testing er også en gjeldende begrensning. Kanskje er den viktigste begrensningen av alle synergi testmetoder mangel på etablerte sammenhenger mellom i vitro resultater og kliniske utfall når kombinasjoner brukes til å behandle pasienter24. Enklere og raskere synergi testing metoder, for eksempel automatisert sjakkbrett matrise metoden beskrevet her, kan lette integrasjon i vitro synergi testing i kliniske studier eller andre vurderinger av pasientens utfall for å bedre beskrive forholdet mellom i vitro og in vivo effekter i fremtiden.
Automatiske sjakkbrett matrise metoden som vi presenterer her tilbyr et alternativ for høy gjennomstrømming screening av en rekke kombinasjoner og gir mulighet for rask vurdering av uvanlig, “høy risiko-høy belønning” kombinasjoner uten en større investering av tid og ressurser. Metoden tid-kill, som vi senere viser, kan gi støttende tilleggsinformasjon om samvirkningen av kombinasjonen og kan bidra til å karakterisere den bakteriedrepende aktivitet og antibakterielle kinetics.
De to metodene beskrevet her gir begge informasjon om aktiviteten av poesi aksent i kombinasjon i forhold til deres individuelle aktivitet. Automatisert inkjet-skriver-assistert digitale dispensing metoden er en tilpasning av metoden beskrevet i klinisk mikrobiologi prosedyrer Handbook33, mens metoden tid-kill følger nærmere tilsvarende protokollen fra samme referere til34.
I metoden sjakkbrett matrise beregninger for å fastslå den nødvendige mengden antimikrobielle lager til hver brønn og utlevering av disse volumene er automatisert, dermed eliminere noen av de store potensielle kildene til feil i en manual Sjakkbrett matrise. Det er fortsatt viktig, men at etterforskeren bestemmer at opprinnelige aksjer er gjort på den tiltenkte konsentrasjonen og at målet siste konsentrasjoner er angitt i D300 programvaren riktig. Legge til antimikrobielle suspensjon brønner i en 384-vel plate kan være utfordrende først og krever omsorg for å sikre at pipette tips angir passende brønnene og at væske splash opp ikke kantene av brønnene. En automatisert flytende behandling kan brukes i stedet for en håndholdt flerkanals pipette for å øke hastigheten og nøyaktigheten som bakteriell suspensjon legges til brønner. Som beskrevet i protokollen, må D300 surfactant, polysorbat 20 (P-20), for riktig flytende håndtering. En annen surfactant, polysorbat 80, i en konsentrasjon av 0,002%, har vært nevnt for å senke colistin mikrofoner for organismer med colistin mikrofoner av < 2 µg/mL i standard kjøttkraft microdilution analyser. 35 , 36 vårt laboratorium tidligere viste at P-20 i konsentrasjoner til 0.0015% hadde ingen effekt på D300-assistert MIC resultater i sammenligning med referanse BMD14. I eksemplet analysen presenteres her, er den maksimale P-20 konsentrasjon er 0.0014%.
Et problem vi møtte med noen sjakkbrett matrise analyser var et stort antall hoppet over brønner. Dette skjedde på en uforholdsmessig hastighet med enkelte antibiotika. Spesielt i skjermen kombinasjoner mot en samling av carbapenem-motstandsdyktig Enterobacteriaceaefant vi at mens 49 521 forsøk (9,4%) ble ødelagt på grunn av flere hoppet over brønner, 2 av 12 antibiotika testet (fosfomycin og cefepime) sto for 46 av disse rettssaker (94%). Slike økte priser kan være mer sannsynlig i medisiner som er spesielt utsatt for inoculum effekt31,32,37. Av notatet anbefaler ikke CLSI testing fosfomycin i kjøttkraft fortynning25 bekymringer om pålitelighet resultatene med denne metoden, som kan forklare upålitelige resultatene sett med dette stoffet. Noen endringer kan gjøres til automatiske sjakkbrett metoden i henhold til etterforsker preferanser. Poesi aksent kan bli utlevert til plater allerede inneholder bakteriell suspensjon, og ikke i tomme brønner, hvis dette er å foretrekke av arbeidsflyten laboratoriet. Mens 384-vel platene ble brukt her, kan metoden også bæres i 96-brønnen plate analyser med riktig endring av godt volum. Bruk av en 96-brønns plate format kan hjelpe redusere hoppet over brønner for antibiotika som er spesielt følsomme for små endringer i inoculum. Når du beregner FICjeg, kan det være situasjoner der MIC av skala (dvs., høyere enn testet), inkludert situasjoner hvor stoffet blir testet har ingen aktivitet individuelt mot av organismen testes. I disse tilfellene kan FIC beregnes basert på antar MIC er en fortynning høyere enn den høyeste konsentrasjonen testet. Dette er den mest konservative strategien, som det antas at maksimal mulig FIC verdien for alle fortynning der hemming er observert under synergi testing. For eksempel hvis faktiske MIC var to dobling fortynninger over den høyeste konsentrasjonen testet, og de tilsvarende FICs ville være to ganger lavere enn konservative tildelinger og så videre.
For å nøyaktig vurdere bakteriedrepende aktiviteten av stoffer i en tid-kill analysen, er det viktig at kulturer være i logaritmisk-fase vekst, spesielt når celleveggen aktive antibiotika blir testet28. For raskt voksende bakterier brukes i dette eksemplet (K. pneumoniae), 3 timers inkubasjon med skjelvende var riktig å nå denne vekstfase, men forskjellige mengder tid kan være nødvendig for ulike organismer. Generelt, skal kultur vises tydelig, men ikke tungt grumset. Riktig mengde tid kan bestemmes ved å opprette en vekstkurve med kolonien teller tatt på seriell tid poeng (f.eks enhver 30 min 4-6 h)38. Den tiltenkte starter inoculum i tid-kill studien er også viktig. Målet konsentrasjonen av den første inoculum er ca 5 x 105 til 1 x 106 CFU/mL. Fortynning beskrevet her (100 μL av en 1,0 McFarland suspensjon i 10 mL av media) genererer denne inoculum for Klebsiella pneumoniae og andre Enterobacteriaceae arter som vi har testet den. Hvis tettheten av de første inocula i et eksperiment ved hjelp av ulike organismer er betydelig høyere eller lavere enn dette, kanskje så en annen fortynning behøves. (Riktig fortynning kreves for artene kan bestemmes ved å utføre plate antall en 0,5 eller 1.0 McFarland suspensjon å bestemme hvor mange organismer denne turbiditet representerer, deretter beløpet som første suspensjon må være utvannet for å nå riktig siste konsentrasjonen.) Hvis, på gjennomgang av platen teller fra synergi studien, den første inoculum av antibiotika inneholder rør er funnet å ha vært betydelig lavere enn de første inoculum i kontrollen vekst, kan det tyde begge antibiotika carryover eller svært rask drepe bakterier i kort tid mellom tillegg bakterier mot antibiotika inneholder røret og fjerning av aliquot for plating. Hvis det faktiske antallet koloniene i ufortynnet fall i en serie er lavere enn koloniene i påfølgende fortynninger, foreslår dette antibiotika carryover effekt. Ulike alternativer er beskrevet for å hindre denne effekten, inkludert sprer en enkelt aliquot over en hel tallerken38 eller spinne ned prøven, fjerne nedbryting og å suspendere i sterilt saltvann før plating39. På hvert punkt i metoden tid-kill er det også avgjørende for etterforsker effektivt men nøyaktig fjerne en aliquot fra hver kultur rør og utføre føljetong fortynninger. Forsinkelser under denne prosessen, spesielt i løpet av tidlig tidspunkt som oppstår i nær hverandre, kan føre til lengre perioder der kulturer ikke er er ruges og ristet, mens uforsiktig dispensing og føljetong fortynninger kan føre til unøyaktige plate teller. Slipp plate metoden beskrevet i forhold til spredning plate metoden for plate teller, der 100 μL av hver fortynning er spredt over en hel agar plate, er langt mer rask, krever en mye mindre antall agar plater, og gir raskere teller, som maksimum countable antall koloniene for hver dråpe er 30, mens opp til 300 kolonier kan vanligvis regnes fra en spredning plate. Men er metoden spredning plate også et alternativ hvis etterforskere er mer komfortabel med denne teknikken. Hvis dråper spredt i hverandre etter dispensing med en flerkanals pipette, utføres personlige anvendelsen av mer avstand dråper med en enkanals pipette i stedet. I vår erfaring syntes kjøling plater på 4 ° C før utlevering drops å redusere overdreven spre.
En begrensning teknikkene som beskrives her er at resultatene av de to typene synergi analysen (sjakkbrett matrise og tid-kill) er ikke alltid overensstemmende, og siden mest publiserte synergi artikler bruker en metode eller andre stedet begge sammen, kan det være vanskelig å vite hvor å integrere data fra to typer analyser. Fordi metoden for automatiske sjakkbrett-matrise vi utviklet er enkel og høy gjennomstrømming, vi har brukt det i praksis som en slags skjermen å teste kombinasjoner mot et større antall isolerer og avgjøre hvilke konsentrasjon kombinasjoner var synergistisk. Vi har utført et mindre antall tid-kill studier, velge kombinasjoner og konsentrasjoner som hadde vært effektiv i sjakkbrett matrisen. Av notatet, fordi sjakkbrett analysen utføres vanligvis i microbroth fortynning skala, mens tid-kill analysen bruker større volumer (ligner på en macrobroth fortynning), fant vi at FICs var noen ganger annerledes mellom de to metodene, med høyere konsentrasjoner vanligvis nødvendig i tid-kill analysen å demonstrere aktivitet. Dette fenomenet har vært nevnt tidligere når macrobroth og microbroth fortynning MIC analyseresultatene sammenlignes for Gram-negative bakterier26 og når større inocula (som brukes i tid-kill studier) sammenlignes med den standard inoculum som brukes i microbroth fortynning og sjakkbrett utvalg søk32. En bestemt begrensning av sjakkbrett matrisen er iboende variasjon i microbroth fortynning MIC tester22. Mens FICjeg konsentrasjon synergi konto for denne variasjonen matematisk6 slik variasjon uunngåelig reiser bekymring pålitelighet og konsekvens av sjakkbrett matrise resultater.
Resultatene av disse metodene må bekreftes på grunn av begrensninger knyttet til alle i vitro synergi testmetoder (inkludert dyrking av bakterier i en kunstig vekst medium, statisk antibiotikumet konsentrasjonene og en begrenset tid selvfølgelig), og Videre evalueres ved hjelp av flere teknikker. Slike metoder omfatter i vitro farmakokinetiske/Farmakodynamiske (PK/PD) studier (f.eks, hul fiber infeksjon modell40), dyr modeller, og til slutt, menneskelige PK/PD og effekt studier. Automatiske sjakkbrett matrise metoden beskrevet her, ved å gi en rask metode som skjermen kombinasjoner for potensielle samvirkningen, gjør det mer målrettet utnyttelse av disse teknikkene. Videre automatisering av alle disse metodene, som vel som mer systematisk undersøkelse av forholdet mellom i vitro parametere og kliniske utfall, vil være viktig å skalere opp bruk av synergi testing og øke brukbarheten klinisk.
The authors have nothing to disclose.
Thea Brennan-Krohn ble støttet av en Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og menneskelig utvikling pediatric smittsomme sykdommer forskning trening grant (T32HD055148), National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer trening grant ( T32AI007061), en Boston Children’s Hospital Office av fakultetet utvikling fakultetet karriereutvikling fellesskap, og en National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer karriere development award (1K08AI132716). J.E.K. ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer i National Institutes of Health prisen nummer R33 AI119114. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Escherichia coli strain ATCC 25922 | ATCC | 25922 | QC strain |
0.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
1 L 0.22 µm bottle-top filter | Thermo Scientific Nalgene | 597-4520 | |
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Fisherbrand | 14-961-26 | |
15 mL conical tubes | Phenix | SS-PH15 | |
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates | Thermo Scientific | R01620 or R04050 | |
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes | Bellco | 2005-02512 | |
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Bellco | 2011-25150 | |
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids | Greiner Bio-One | 781186 | |
50 mL conical tubes | Phenix | SS-PH50 | |
50 mL sterile reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells | Fisherbrand | 12-566-612 | |
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids | Evergreen | 222-8032-01R | |
Cation adjusted Mueller Hinton broth | BD Diagnostics | 212322 | |
Colistin sulfate | Alfa Aesar | J60915 | |
D300e Control Software | HP/Tecan | ||
DensiCHEK Plus McFarland reader | bioMérieux | 21250 | |
Excel spreadsheet software | Microsoft | ||
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
HP D300 digital dispenser | HP/Tecan | ||
HP D300 T8+ cassettes | HP/Tecan | 30097370 | |
Minocycline hydrochloride | Chem-Impex | 14302 | |
Picus 12-channel 10-300 µL pipette | Sartorius | 735461 | |
Polysorbate 20 | Fisher Bioreagents | BP-337 | Brand name: Tween 20 |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 PRO | |
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette | Eppendorf | 2231000328 |