Summary
抗菌协同试验用于评估两种或两种以上联合使用的抗生素的效果, 通常由两种方法之一进行: 棋盘阵列或时间终止检测。在这里, 我们提出了一个自动化, 喷墨打印机辅助棋盘阵列协同技术和一个经典的时间终止协同研究。
Abstract
随着耐多药 (MDR) 病原体发病率的不断上升, 超过了新抗菌素的发展速度, 治疗 MDR 细菌的新方法正日益成为必要。其中一种方法是联合疗法, 在这种疗法中, 两种或两种以上的抗生素被一起用于治疗一种或两种药物可能单独无效的感染。当两种药物结合在一起, 发挥大于添加剂的效果, 他们被认为是协同作用。体外研究协同活性是评价药物组合可能的疗效的重要第一步。开发了两种主要的体外协同试验方法: 棋盘阵列和时杀研究。本文提出了一种利用喷墨打印技术提高该技术的效率和准确性的自动棋盘阵列方法, 以及一种标准的手动时杀协同方法。自动棋盘阵列可作为高通量筛选分析, 而手动时间终止研究则提供有关协同活动和杀灭的额外补充数据。
棋盘阵列是对标准最低抑制浓度 (MIC) 检测的修正, 在该测试中, 细菌在不同浓度组合下使用抗生素孵育, 并在隔夜孵育后评估生长抑制。棋盘阵列的手动性能需要一系列费力且容易出错的计算和稀释。在这里介绍的自动化方法中, 通过使用喷墨打印机技术, 可以实现所需抗生素库存解决方案量的计算和分配。在时间杀灭协同作用检测中, 细菌与感兴趣的抗生素一起和单独孵育, 并在24小时内每隔24小时取样进行定量培养。研究结果可以确定组合是否协同作用, 是否具有杀菌作用, 并提供一段时间内细菌抑制和杀灭的数据。
Introduction
耐多药细菌病原体的传播, 特别是耐碳素肠杆菌 (CRE) 等 MDR 革兰氏阴性菌的传播, 使临床医生成功接受抗感染疗法的选择越来越有限1、一个问题加剧了缓慢的步伐, 新的抗菌药物发现2,3。抗菌协同作用, 其中两种药物结合使用发挥了大于添加剂的作用, 提供了挽救现有抗生素用于治疗 MDR 细菌的可能性, 即使这些细菌对一个或两个单独使用抗生素。本文描述的技术提供了两种互补的体外协同试验方法, 当一起使用时, 使研究人员能够有效地筛选感兴趣的抗菌组合, 以获得协同活动的证据 (自动棋盘阵列法), 然后进一步评估在筛选阶段确定的有希望的组合 (手动时间杀伤法) 所显示的抑制和杀伤动力学。
体外协同试验最常用的方法之一是棋盘阵列检测, 这是一种最小抑制浓度 (MIC) 测试的改进, 在这种测试中, 测试两种不同抗生素对细菌分离物的抑制活性在一系列的浓度组合4,5。如果这两种药物在一起使用时发挥大于添加剂活性, 则该组合被认为是协同作用6。但是, 手动设置棋盘阵列涉及一系列计算以及稀释和移液步骤, 这些步骤非常费力且容易受到人为错误的影响。这些制约因素的效果是将协同试验的使用主要限于对少量抗生素组合和细菌分离株进行追溯性评估, 结果在研究中并不总是一致的7, 8、9、10、11。此外, 协同试验的复杂性导致临床微生物学实验室无法使用协同试验, 以及几乎没有联合疗法临床研究中的体外协同试验数据,13岁
为了提高棋盘阵列方法的效率和吞吐量, 我们利用了以前在实验室开发的自动化 MIC 测试技术, 该技术使用喷墨打印技术精确、一致地分配小批量。抗生素库存溶液进入井在微滴板 14.该平台无需复杂的计算和多个移液步骤。相关软件计算和分配适当数量的抗生素, 以创建一个二维棋盘阵列, 如果用户只是输入所需的浓度范围和库存溶液浓度的抗生素。我们最初对一系列 CRE 分离株15进行了测试, 随后重点测试了含有大肠菌素的组合对抗大肠菌群的活性16。大肠菌素是一种最后手段的药物, 通常用于治疗 mdr 革兰氏阴性病原体17,18, 大肠菌素的耐药性使已经 mdr 细菌几乎具有抗性19, 使它们成为理想的候选人开发新的治疗策略使用药物, 他们是不敏感的单独。我们发现, 大肠菌素和蛋白质合成抑制剂抗生素米诺环素的组合具有很高的协同作用率, 即使对这些药物中的每一种单独产生耐药性的菌株也是如此, 大概是因为大肠菌素产生了亚抑制作用对甚至抗结肠炎细菌的渗透性作用。我们选择了这个组合作为本文的一个例子。值得注意的是, 协同试验也可用于评估两种单独有效的药物的疗效。
自动棋盘阵列方法有助于快速、高吞吐量的协同测试。但是, 棋盘数组方法确实有限制。作为一种改进的 MIC 检测方法, 它只提供关于抑制细菌生长的数据, 而不提供关于杀死的数据, 而不提供关于随着时间的推移抗生素影响的数据。相比之下, 人工性能的时间杀人协同检测是更多的劳动密集型, 但提供了在24小时时间路线20,21的抑制和杀死的信息。我们在数量较少的分离物上使用了时间杀伤分析来确认我们的棋盘阵列结果, 并确定我们确定的协同组合是否也是杀菌的。
棋盘阵列和时间杀伤协同方法都提供了关于药物组合活性的宝贵信息, 对于评估高耐药细菌病原体的潜在新治疗方案特别有用。这些方法也有其固有的局限性。标准的微肉汤稀释 MIC 方法具有已知的预期误差范围为1二倍稀释22, 当两种药物一起在棋盘阵列中测试时, 误差范围就会增加。协同作用的标准定义认为, 只有在药物在各自中等收入中等收入国家6倍的情况下共同活跃, 才会考虑到这种预期的变异性, 但也考虑到这种变异性 (这被认为是结果)从生物和技术波动的结合中不可避免地产生了对协同结果可靠性的不确定。缺乏既定的协同测试质量控制标准也是目前的一个限制。也许所有协同试验方法最重要的局限性是, 当使用组合治疗24患者时, 体外结果与临床结果之间缺乏既定的相关性。更简单、更快速的协同测试方法, 如此处描述的自动棋盘阵列方法, 可促进在临床试验或对患者结果的其他评估中整合体外协同测试, 以便更好地描述了未来体外效应与体内效应的关系。
我们在这里介绍的自动棋盘阵列方法为各种组合的高通量筛选提供了一个选项, 并允许快速评估不寻常的、"高风险的高回报" 组合, 而无需投入大量时间和资源。时间杀伤法, 我们随后证明, 可以提供额外的支持信息的协同作用的组合, 并可以帮助表征其杀菌活性和抗菌动力学。
Protocol
注意事项:使用细菌时, 请使用适当的安全程序。任何时候都要戴上手套和实验室外套。如果会产生气溶胶或使用高风险病原体, 请在生物安全柜中工作。
请注意:在开始实验之前, 将要测试的细菌分离物 (从经过殖民净化的、在-80°c 冷冻在-80°c 的色质大豆肉汤中冷冻的最低限度的过只库存, 并有50% 的甘油) 活出到血琼脂板上。在环境空气中35°c 时将板材孵化。
1. 喷墨打印机辅助自动棋盘阵列协同
- 制作抗菌库存解决方案 (大肠菌素和米诺环素)。
- 根据抗生素的溶解度和棋盘阵列中所需的最终浓度确定抗生素库存溶液浓度。在此例子中, 制作 10 mgl 库存的大肠菌素和米诺环素。使用 CLSI M100 文档为每种抗生素确定适当的溶剂25。大肠菌素和米诺环素都是水溶性的;由于 D300 喷墨打印机需要添加表面活性剂进行适当的水液处理, 将抗生素溶解在超纯去离子水中, 其中含有0.3% 的聚山梨酸酯20。
- 使用分析天平称量抗生素粉末, 并计算获得目标库存浓度所需的溶剂体积。
- 如果抗生素是以盐 (如硫酸大肠菌素、盐酸米诺环素) 或水合形式 (如三水合物美罗培南) 提供的, 或者制造商报告其纯度低于 100%, 则进行效力计算26至确定所需溶剂的数量。
- 以此例子的盐酸米诺环素, 规定纯度为 900 mg/mg:
测定纯度: 900 毫克
含水量: 无
活性分数: 0.926 (通过将米诺环素 (457.48 Da) 的分子量除以盐酸米诺环素的分子量 (493.94 Da) 获得)。
潜力 = (测定纯度) * (1–含水量) * (活性分数)
= (900 mg/mg) * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg 或833。4
然后确定所需溶剂的体积, 如下所示:
体积 (mL) = [重量 (毫克) * 效力 (mg/mg)]-[浓度 (Mg/ml)]
因此, 例如, 如果对34.7 毫克盐酸米诺环素粉末进行称重, 请使用以下计算来确定制造 10 mg/mL 溶液所需的溶剂体积:
体积 = (34.7 毫克) * (833.4 米/毫克) = 2.89 毫升
10, 000 mgml
- 将抗生素粉末倒进15毫升的锥形管中, 加入适当体积的水加上0.3% 的聚山梨酸酯20。涡旋直到溶解。
- 将抗生素库存溶液放入 0.5 mL 微离心管中, 并在-80°c 下储存, 直至投入使用。
- 至少在协同测试前一天对用于棋盘阵列实验的抗菌素库存进行质量控制 (QC), 以便在使用库存进行协同测试之前对 QC 结果进行评估。
注意：这里描述的 QC 技术与用于单个药物的最小抑制浓度 (MIC) 检测的技术相同, 可以与调查人员感兴趣的菌株一起使用。- 准备细菌悬浮液。
- 在准备细菌悬浮液的同时, 从-80°c 的冰柜中取出每个抗生素库存的一个标签, 开始解冻。涡旋一旦解冻, 以确保抗生素在溶液中。
- 根据 CLSIM100 25中的表 5a-1 , 选择合适的 qc 应变, 并确定正在测试的药物的可接受 mic 范围。对于这里的药物,使用大肠杆菌atcc 25922;该菌株的 MIC 范围为米诺环素的 0.25-1 mg/mL, 大肠杆菌的 mic 范围为 0.25-2 Mg/ml。
- 选择一系列抗生素浓度进行测试, 其中将包括整个 QC 范围。使用 0.0156 Mg/ml 至 8 mgml 范围的米诺环素和大肠菌素进行 atcc 25922。
- 在12毫米 x75 毫米圆形底部玻璃培养管中加入1毫升0.9% 氯化钠。从 ATCC 25922 的隔夜板中选择一个或两个菌落, 并轻轻旋涡暂停。
- 使用麦克法兰读取器检查细菌的浓度。根据需要进行调整, 添加更多0.9% 氯化钠或更多细菌, 以实现0.5 麦克法兰浊度读数。
- 按照 CLSI 27 的建议, 在50毫升锥形管中, 将悬浮液添加到 ct 调整的 Mueller-Hinton broth (CAMHB) 的30毫升中, 使其稀释 1:300, 以达到 5x10 5 cation-adjustedml的最终细胞密度.
- 使用无菌接种回路, 隔离条纹的启动接种滴到血琼脂板上, 以确认接种的纯度, 并在35°c 的环境空气中孵育。
- 使用 D300 将抗菌剂添加到平底、方井、透明、未经处理的384孔板中。在准备细菌悬浮液后立即执行此步骤, 以便在准备后15分钟内将悬浮液添加到板材中26。
- 打开 D300 喷墨打印机和相关计算机。打开软件程序。
- 启动一个新文件。在印版网格的图像上方, 右键单击板 1并选择"编辑板"。选择合适的板型 (384 孔) 和额外的体积 (50 毫升)。
- 通过单击左侧面板上流体旁边的加号, 将流体 (即抗生素库存) 添加到协议中。加入两种液体 (大肠菌素和米诺环素)。
- 将鼠标悬停在 "流体 1" 显示的面板上, 然后单击铅笔进行编辑。将液体命名为 "Colistin", 将类改为 "水 + tween 20", 将浓度更改为 10, 000, 并将浓度单位更改为 mg/ml (请注意, 库存浓度为 10 mgml, 即 10, 000 mg/ml)。将"分配 b y" 保留在"集中" 处, 并将其余字段保留为默认设置。单击"确定"。
- 对流体 2 (米诺环素) 重复上述步骤。
- 单击屏幕顶部的 "当前协议" 选项卡, 并将"浓度 (质量) " 更改为 m g/ml,以确定用于最终油井抗生素浓度的单位。
- 通过单击并拖动, 选择网格中的10口井, 然后单击屏幕顶部的"滴定" 。对于使用选择最高浓度指定滴定, 为流体选择大肠菌素, 为最高浓度输入8 (确保单位为 mg/ml), 并用于分配选择1: 2 (50%)。保留窗口其余部分的默认值, 然后单击 "确定"。
- 对米诺环素重复上述步骤, 生成米诺环素滴定法。
- 保存协议, 然后单击左上角的"运行"按钮。
- 单击"开始"按钮。将384孔板 (取下盖子) 装入板支架, 然后按 "负载板1–协同" 提示下的 "加载" 。
请注意:此提示由软件选择, 并不表示正在执行协同测试。将 T8+ 盒式磁带放入盒式磁带插槽中, 然后按"加载 t8 + 盒式"提示下的 "加载"。 - 出现提示时, 将抗生素库存溶液添加到盒式磁带上的指示储层中。按照屏幕上的说明进行正确的加载, 并小心分配, 以避免在解决方案中获得任何气泡。添加每个解决方案后, 按"填充"按钮。
- 一旦喷墨打印机在每个井中添加了适当卷的抗生素库存, 并出现 "运行完成"框, 请单击 "关闭", 取出印版, 然后关闭 d300。
- 在384孔板和孵化板上添加细菌悬浮液。
- 将先前制备的细菌悬浮液放入无菌试剂库中。
- 使用多通道移液器在所有含抗生素井中添加50毫升细菌悬浮液。在空井中加入50毫升的 CAMHB, 没有细菌;这将是负控制很好地确认媒体的不育性。
- 将板放置在35°c 的环境空气孵化器中, 孵育 16-20h 26。
请注意:如果正在测试肠杆菌科以外的生物, 可能需要不同的孵化时间;有关组织特定的建议, 请查阅 CLSIM100 25 。
- 以 600 (OD600) 的光学密度在微板读取器上读取板并分析结果。
- 使用电子表格程序, OD600值为≥0.07 绿色的树荫单元格, 表示生长, 而 lt;0.07 红色的单元格表示没有生长。
注: 这些值是根据对生长与没有生长的视觉检查以及与这些实验的 OD 读数的相关性确定的;仅含有介质的井的 od 600读数就一直低于0.07。不同的板读取器和细菌可能会有适当的截止时间。 - 确定每种药物的 MIC。MIC 是抑制细菌生长的最低浓度药物。如果 MIC 根据 CLSI M100 文档25在预期的 qc 范围内, 则库存解决方案适合使用。
- 使用电子表格程序, OD600值为≥0.07 绿色的树荫单元格, 表示生长, 而 lt;0.07 红色的单元格表示没有生长。
- 准备细菌悬浮液。
- 准备细菌悬浮液的棋盘阵列。
- 在准备细菌悬浮液的同时, 从-80°c 的冰柜中取出每个抗生素库存的一个标签, 开始解冻。涡旋一旦解冻, 以确保抗生素在溶液中。
- 在12毫米 x75 毫米圆底玻璃培养管中加入 ~ 1 毫升的0.9% 氯化钠。从一夜细菌板 (在这种情况下,大肠杆菌菌株 FDA-CDC 0494) 中选择一个或两个菌落, 并在0.9% 氯化钠中轻轻旋涡悬浮这些菌落。
- 使用麦克法兰读取器检查细菌的浓度。根据需要进行调整, 添加更多0.9% 氯化钠或更多细菌, 以实现0.5 麦克法兰浊度读数。
- 在50毫升锥形管中, 将悬浮液的100毫升添加到 CAMHB 的30毫升, 以达到 5 x 10 5 chu/ml27的最终细胞密度, 从而使 0.5 mcfarland 悬浮液的悬浮液减少1:300。
- 使用 D300 将抗菌剂添加到平底、方井、透明、未经处理的384孔板中。
注:在准备细菌悬浮液后立即执行此步骤, 以便在准备后15分钟内将悬浮液添加到板材中26。- 打开喷墨打印机, 启动一个新文件, 并按照步骤 1.2.2.1-1.2.2.3 向协议添加液体。
- 生成协同网格。
- 单击屏幕顶部的"协同"图标, 然后继续执行这些步骤。对于"类型 ", 请选择两个或两个以上的流体因子一起分解。对于板材, 不需要排除任何井;在此步骤上单击"下一步" , 而不进行更改。
- 在"滴定" 选项卡上, 输入抗生素浓度和位置。
- 为了在减少两倍稀释从32到 0.031 Mg/ml, 除了一个没有抗生素的负井, 下 y 轴, 在左侧面板上输入12滴定水平。对于指定滴定使用, 请选择 "最高浓度";对于流体,选择米诺环素;对于最高浓度, 请输入 32 (确保将设备设置为 mg/ml; 如果设置为 mg/ml, 请关闭 "协同" 对话框, 然后在 "当前协议" 选项卡下进行更改)。确保选中了 "包括 0" 值框。将分布更改为 1: 2 (50%)。
- 对右侧面板上的大肠菌素重复这些步骤, 使用12个滴定水平和最高浓度为16。单击"下一步"。
- 在 "布局" 选项卡上, 选择前2个流体的滴定级别, 确定布局网格中的行数和列数。单击"下一步"。如果网格按预期方式显示, 请单击"完成"。
- 保存协议, 然后单击左上角的"运行"按钮。
- 单击"开始"按钮。将384孔板 (取下盖子) 装入板支架, 然后按 "负载板1–协同提示" 下的 "加载" 。将 T8+ 盒式磁带放入盒式磁带插槽中, 然后按"加载 t8 + 盒式"提示下的 "加载"。
- 出现提示时, 将抗生素库存溶液添加到盒式磁带上的指示储层中。按照屏幕上的说明进行正确的加载, 并小心分配, 以避免在解决方案中获得任何气泡。添加每个解决方案后, 按"填充"按钮。
- 一旦 D300 分配器在每个井中添加了适当卷的抗生素库存, 并出现 "运行完成"框, 请单击 "退出", 取出板, 然后关闭 d300。
- 在384孔板和孵化板上添加细菌悬浮液。
- 将先前制备的细菌悬浮液放入无菌试剂库中。
- 使用多通道移液器将悬架的50毫升添加到棋盘阵列中的所有井。在空井中加入50毫升的 CAMHB, 没有细菌;这将是负控制很好地确认媒体的不育性。在35°c 环境空气孵化器中孵育 16-20h 26.
- 在 OD600的微板读取器上读取板, 并分析棋盘阵列结果。
- 首先, 检查纯度板, 并确保分离的菌落是一个单一的形态, 符合所测试的生物体的预期形态。
- 使用电子表格程序, 遮阳单元格以指示生长和没有生长, 就像1.2.4.1 的步骤一样。
- 确定每种药物的 MIC。对于在测试的最高浓度下不抑制细菌生长的药物, MIC 被认为是不大规模的。
- 对于每口井的生长被抑制, 根据该抗生素的 MIC 确定每种抗生素的分数抑制浓度 (fic) (见图 1 b和图 2b)。
请注意:FIC 是抗生素在其 mic 生长受到抑制的井中的浓度之比;因此, 对于 MIC 为 8 mgml 的药物, 含有该药物的 8 mgml 的井的 fic 为 1, 而含有 4 mgml 的井的 fic 为0.5。 - 计算每个被抑制生长的井的分数抑制浓度指数 (fic i) 值, 作为该井中每种药物的 fic 之和。
- 确定抑制生长的最低 fic i (最低 fic i).如果最低 FIC i 为 0.5 英镑, 请考虑组合协同;如果 0.5-4, 认为组合冷漠;如果 gt;4, 则考虑组合对立。如果组合在一些浓度组合上是协同的, 但在另一些浓度组合上是对立的, 请注意这一结果, 但要考虑组合的整体拮抗。
2. 时间终止协同测试
- 制定抗菌库存解决方案。如果在实验之前执行此步骤, 请将库存冻结在-80°c, 直到可以使用。
- 根据抗生素的溶解度和时间杀灭研究中所需的最终浓度确定抗生素库存溶液浓度。在本例中, 使大肠菌素和米诺环素库存的浓度为 1 mg/mL。使用 CLSI M100 文档为每种抗生素确定适当的溶剂25。建议对大肠菌素和米诺环素都用水。
- 利用分析天平称量抗生素粉, 计算获得目标库存浓度所需的溶剂体积。如有必要, 请在确定所需溶剂数量之前进行效力计算, 如上文步骤1.1.2.1 所述。
- 将抗生素粉末倒进15毫升的锥形管中, 加入适当的水量。涡旋直到溶解。
- 利用 CLSI M0726中描述的人工肉汤微稀释方法, 对及时使用的抗菌剂库存进行 qc, 消除协同作用实验。至少在协同测试前一天执行此步骤, 以便在使用库存之前对 QC 结果进行审查。
- 根据 CLSIM100 25中的表 5a-1 , 选择合适的 qc 应变, 并确定正在测试的药物的可接受 mic 范围。对于这里的药物,使用大肠杆菌atcc 25922;该菌株的 MIC 范围为米诺环素的 0.25-1 mg/mL, 大肠杆菌的 mic 范围为 0.25-2 Mg/ml。
- 准备含抗生素的肉汤微稀释板。
- 选择要测试的抗生素的最高浓度, 以便将整个 QC 范围包括在内。使用0.016 至 8 Mg/ml 范围的米诺环素和大肠菌素进行 ATCC 25922。
- 将抗生素库存稀释到 CAMHB 中的工作溶液中, 浓度是所需浓度最高的两倍 (因为它将随着细菌的悬浮而稀释 1:1)。在本例中, 将这两个股票从 10 mgml 稀释到 16 mgl。
- 使用多通道移液器, 将2倍抗生素悬浮液中的每一个添加100毫升, 加入一个清晰的圆底、未经处理的96孔板的第一列中的井中, 并在随后的柱的每口井中添加50毫升的普通肉汤 (即不含抗生素)。
- 从第一列中的每口井中取出50毫升含抗生素的肉汤, 并添加到第二列中的井中。移液器上下多次混合内容物, 产生抗生素浓度的一半, 在第一列中。
- 对每一列重复步骤 2.2.2.4, 以便准备一系列系列的双倍稀释, 每个稀释剂的体积为50毫升。如果需要, 请在每个稀释步骤之间更换移液器吸头, 以消除抗生素携带的可能性。请注意, 由此产生的浓度仍然是最终浓度的 2倍, 因为它们随后将被细菌悬浮液稀释为1:1。
- 不要在最后两列中添加任何抗生素, 因为这些将是负和生长控制列。
- 准备细菌悬浮液。
- 准备 0.5 McFarland 悬浮液从一个隔夜板的大肠杆菌 atcc 25922 在0.9% 氯化钠在 1.2.1.5-1.2.1.6 的步骤中描述。
- 通过将悬浮液增加50毫升至7.5 毫升 camhb, 对 0.5 mcfarland 悬浮液进行1:150 稀释。
请注意:最终的细菌悬浮液将稀释 1:300, 一旦它与抗生素溶液混合 1:300, 达到 clsi 建议的细胞密度为 5 x 10 5 Cmu\ ml27).
- 在微板上添加细菌并孵育。
- 除第11列外, 每口井加入50毫升的细菌悬浮液.在第11列 (负控制列) 中添加 50毫升 CAMHB。
- 在35°c 时将板孵化16-20。
请注意:如果正在测试肠杆菌科以外的生物, 可能需要不同的孵化时间;有关组织特定的建议, 请查阅 CLSIM100 25 。 - 使用透射光直观地读板生长, 并为每一种抗生素确定没有生长的最低浓度;这是 MIC。有关 MIC26可视化解释的更多详细信息, 请参阅 Clsi m07 文档。如果 MIC 在预期的 QC 范围内, 则库存解决方案适合使用。
- 开始初始区域性。
- 如上所述, 在无菌0.9% 的氯化钠中对试验生物进行 0.5 McFarland 悬浮液。
- 添加100毫升的0.5 麦克法兰悬浮液, 以5毫升的 CAMHB 在一个25毫米 x 150 毫米玻璃圆底培养管与不锈钢封闭和漩涡轻轻混合。
- 使用无菌接种回路, 隔离条纹一滴稀释悬浮液到血琼脂板上, 以确认接种纯度, 并在35°c 的环境空气中孵育。
- 在环境空气中, 在35°c 的振动台上, 在振动台上的试管架上更换闭合, 并在试管架上孵育至少 3小时, 直到达到对数相生长 (见步骤 2.6.1)。当培养物在孵化器中时, 继续执行步骤2.4。
- 在25毫米 x 150 毫米玻璃培养管中准备抗菌解决方案。
- 从-80°c 的冷冻机取出抗菌剂, 以解冻。涡旋一旦解冻, 以确保抗生素在溶液中。
- 在初始培养过程中, 在5个高压灭菌的25毫米 x150 mm 玻璃培养管中加入10毫升 CAMHB, 并添加抗菌库存解决方案, 如下所示。
请注意:对于协同作用研究, 至少有一种药物的浓度不应单独影响生长曲线28;这可以通过在协同研究之前评估个别药物浓度的影响来确定。- 管 1: 添加适当数量的抗生素 #1, 以获得目标最终抗生素浓度。在这种情况下, 添加 10 ml 的 1 Mgl 大肠菌素库存, 以获得 1 mg/mL 的最终大肠菌素浓度, 因为这是对本例中使用的菌株无效的浓度。
- 管 2: 添加适当数量的抗生素 #2, 以获得最终的抗生素浓度进行测试。在这种情况下, 添加10毫升的 1 mgl 米诺环素库存, 以获得 1 mg/mL 的最终浓度, 这种浓度对本例中使用的应变无效。
- 管 3: 添加与1号管和2号管相同数量的抗生素 #1和抗生素 #2。在这种情况下, 加入 1 mgl 米诺环素库存的10毫升和 1 mgml 大肠菌群的10毫升。
- 管 4: 不添加抗生素;这将是生长控制管。
- 管 5: 不添加抗生素;这将是负控制管。
- 用多通道移液器在1-5 列的 B-H 中加入900μl 的无菌0.9% 氯化钠, 制备96根带有2毫升井的深井聚丙烯板进行系列稀释。
- 准备启动接种器并添加到管中。
- 一旦初始培养达到对数生长阶段 (本例中使用的生物为肺炎克雷伯菌约 3小时), 将培养管从振动台中取出, 轻轻涡流, 将 ~ 1 毫升的悬浮液转移到12毫米 x75 mm 的玻璃培养管中,和麦克法兰的读者核实密度
- 如果小于1.0 麦克法兰, 将试管返回到振动台并孵育更长的时间。如果它大于1.0 麦克法兰, 添加 CAMHB 的管, 轻轻涡旋, 并重新采样, 重复该过程, 直到暂停是在1.0 麦克法兰。
- 添加100毫升的1.0 麦克法兰悬浮液管1-4 和旋涡轻轻。
- 一旦初始培养达到对数生长阶段 (本例中使用的生物为肺炎克雷伯菌约 3小时), 将培养管从振动台中取出, 轻轻涡流, 将 ~ 1 毫升的悬浮液转移到12毫米 x75 mm 的玻璃培养管中,和麦克法兰的读者核实密度
- 从每个培养物中取样, 并进行连续的十倍稀释。
- 在时间 0 时 ( 在向试管中添加细菌后立即 ) , 在 1 、 2 、 4 、 6 和 24 小时时 , 通过倾斜培养管从每个培养管中取出 150 毫升的 , 以便只有无菌的移液尖端进入试管 , 而不是在撤回时的未无菌移液器轴。分别在前准备的96根深井板的第一排连续井中添加。在每个时间点取出等价物后, 立即将管子返回到35°c 环境空气孵化器中振动台上的试管架上。
- 使用多通道移液器, 从 A 行中取出100毫升, 添加到 B 行 (含有900毫升的氯化钠 0.9%), 并向上和向下移动液器向上和向下4-5 次混合, 产生1:10 稀释。丢弃每个稀释步骤后的提示, 以防止细菌的携带, 这可能会导致错误地升高菌落计数。
- 对行 B-H 重复步骤 2.7.2, 每行都有新的移液器提示。
- 板稀释样品为菌落计数使用落板方法29,30。
- 标签 Mueller-Hinton 琼脂板材与抗生素情况和稀释要电镀。
- 使用多通道移液器和超长吸头 (以确保吸头到达悬挂), 从第一列中的每口井中取出10毫升, 并在一排小心地分配到适当标记的板上。如果使用小 (直径100毫米) 板, 则在每个板上分配3行 (每行由单列 A-H 行的落差组成);在大 (直径150毫米) 板上, 每个板分配8行。
- 允许滴完全干燥 (~ 15分钟)。
- 在 24小时, 将直接从负控制管中提取的10毫升滴放在其中一个板材的指示区域进行无菌测试。在35°c 的环境空气中反转板并孵育一夜。
- 计算菌落和计算细胞密度。标记菌落与细尖永久标记在板材的背面, 以避免重复计算或丢失菌落。
- 首先, 检查纯度板, 并确保分离的菌落是一个单一的形态, 符合所测试的生物体的预期形态。
- 对于每个稀释系列, 识别含有3-30 个菌落的滴落 (通常为每稀释系列1滴)。数数这些水滴中的菌落, 并记录计数以及稀释因子。
- 如果在含有3-30 个菌落的稀释序列中没有滴落, 则将最后一滴中的菌落数与 & gt;30 菌落数和与 & lt;3 菌落的第一滴数 (这些应该是相邻的滴落)。
- 对于每个稀释序列, 根据滴中的菌落数计算样品中每毫升菌落形成单位数, 使用以下公式: Ccu/ml = n(1/d) (100), 其中n是菌落数,d是稀释系数 (未稀释样品 (a 行) 为 1, 第1:10 稀释 (b 行) 为0.1 或10-1 , 第二为1:10 稀释 (c 行) 为0.01 或 10-2等, 而常量100则说明了下降 i 的总体积s 10 mL, 而最终值表示为 chuml, 即 cfu 1, 000 mL。使用包含从菌落计数计算 Chu/ml 的公式的电子表格来简化此过程。
- 对于稀释系列, 如果一个以上的下降是可数的 (或两个下降必须计数, 因为没有下降在范围内), 平均最终 chuml 计数的所有计数下降。
- 由于检测的下限为 300 Cfu/ml (未稀释液滴中的3个菌落), 因此记录和积物菌落计为300英镑, 用于稀释系列, 其中未稀释的液滴中有 & lt;3 菌落。
- 检查无菌控制从时间24下降;如果在这一下降中观察到任何生长, 实验结果就不应该使用。
- 绘制和分析结果。
- 绘制三种含抗生素培养物的生长曲线和同一图上的生长控制。在x轴和 Cpu/ml 上绘制时间, 使用对数刻度,在 y轴上。
- 计算了24时间组合管与24时间最活跃的单剂在 cfuml 中的差异。如果差异为≥2 log10, 请考虑组合协同作用。然后计算了24时间和0时组合管之间的 cfuml 差异。如果差异为≥3 log10, 请考虑组合杀菌。
Representative Results
图 1 a 显示了一个棋盘阵列协同实验的网格, 在该实验中, 浓度为0-32Μg/ml 的米诺环素与浓度为0-16Μgl 的大肠菌素结合, 并针对大肠杆菌株 fda-cdc 0494 进行了测试。这些值表示光学密度600纳米 (OD600) 时的分光光度法读数。OD600值低于 0.07 (对应于没有增长由视觉检查) 的井是阴影红色的, 而井与 od 600值 0.07 (对应于成长由视觉检查) 是着色绿色。对于每种药物, 最低抑制浓度 (MIC; 螺栓) 是抑制细菌生长的最低浓度的药物。对于米诺环素, 这是 32μgml, 对于大肠菌素, 它是8μgml。阴影保留在图 1 b 中, 但在抑制生长的井内的值被分数抑制浓度指数 (fic i) 值所取代.这些方法的确定如下: 在每口井中, 每种药物的分数抑制浓度指数 (FIC) 是通过将该井中的抗生素浓度除以该药物的 MIC 来计算的, 而 FIC i 是通过将两个 fic 求和来计算的。FIC i 值为 0.5的井, 被认为是协同作用的截止点, 用断线边框表示, 并且用最低的 fic i 值 (0.094) 的井加粗。由于最小 FIC i 值在协同范围内, 因此该组合被认为是协同作用的。
图 2 a 和图 2A显示了类似于图 1 a 和图 1 b 中的网格, 但在这种情况下, 该组合并不显示与试验过的分离物 (k.肺炎分离体 bidmc 4) 的协同作用, 因为抑制生长的最小 fic i 为 1, 这是 & gt;0.5。
图 3说明了检查板协同网格中的光学密度读数, 其中发生了几口跳井 (阴沟肠杆菌复合物分离 bidmc 27)。跳过的井是指细菌生长受到抑制的井, 尽管相邻的井中存在细菌生长和较高浓度的抗生素。这种现象在标准的 MIC 测试中也有发生, 很可能是由于细菌生长特性从井到井的生物变异性, 以及一些抗生素对细菌接种的小差异的敏感性,31,32. 如果在棋盘阵列中发生了不止一个跳过的事件, 我们就放弃了结果, 重复了分析。
图 4给出了针对肺炎 k.分离器 bidmc 32 测试的三种组合的时间-杀协同结果的例子。殖民地计数以y轴上的对数刻度表示, 时间 (以小时为个时间) 以 x 轴为标的. 用红棒和数说明了含有药物组合的管内的启动接种与该管中细菌浓度的差异, 而管间 2 4小时的细菌浓度差异包含组合和单独包含最活跃的单剂的管用蓝条和数字来说明。图 4a显示了大肠菌素和米诺环素联合使用的结果;这种组合是协同的 (暴露在组合中的细菌浓度与大多数活性物质单独的细菌浓度之间的差异≥2 log 10 ccu/ml 在 24小时) 和杀菌 (从开始接种到浓度在24h≥3日志10下降)。图 4B显示了大肠菌素和克林霉素的组合结果, 这种组合是协同的, 但不是杀菌的。这种组合抑制了细菌的生长, 这两种药物都不是单独的, 但并没有杀死它们。图 4C显示了大肠菌素和红霉素的结合结果, 它们既不是杀菌的, 也不是协同作用的。
图 1: 棋盘阵列结果显示协同作用 (min环 cline + 大肠菌素测试为大肠杆菌菌株 FDA-CDC 0494)。(A) 棋盘阵列的分光光度读数和生长解释。细胞中的值是600纳米 (OD600) 的光学密度读数。OD600值低于 0.07 (对应于通过目视检查没有生长) 的单元被着色为红色, 而 od600值为0.07 的单元格为绿色。(B) 分数抑制浓度指数 (fic i) 计算。显示增长或没有增长的阴影已保留下来。沿x轴和y轴的大肠菌素和米诺环素的值现在分别表示分数抑制浓度 (fic), 或该柱或行中药物浓度与最小抑制浓度的比率 (MIC) 仅该药物。每个细胞的值是 FICi, 也就是该井中两种药物的 fic 之和。这个大的断线边框用0.5 的 FIC i 包围了水井 。厚边细胞表示 FICi在其中抑制生长的最低水平的井, 或最小 fic i.由于最小 FIC i 为 0.5, 因此该组合被认为是协同作用的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 棋盘阵列结果的组合, 不显示协同作用 (米诺环素 + 大肠菌素测试对k.肺炎分离 bidmc 4)。(A) 光学密度值为600纳米, 棋盘阵列结果的增长解释如图 1 a所示。(B) 部分抑制浓度指数 (fic i) 计算, 如图 1a所示。因为最小 FICi是 & & gt;0.5, 所以这种组合不被认为是协同的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 由于跳过井而无法解释的棋盘阵列结果 (min环 cline + 大肠菌素针对阴沟肠杆菌复合物的分离剂 BIDMC 27 进行了测试)。光学密度值为600纳米, 棋盘阵列的生长解释结果如图 1 a所示。几个跳过的井, 其中细菌生长被抑制, 尽管在相邻的井与较高浓度的抗生素的生长, 被证明。结果是不可解释的, 实验需要重复。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 针对肺炎 k.分离器 bidmc 32 测试的三种组合的时间-杀灭协同作用结果。殖民地计数以y轴上的对数刻度表示, 时间 (以小时为个时间) 以 x 轴为标的. 用红条和数说明了24小时组合中细菌浓度与试管中的起始接种剂的差异。如果从开始接种到浓度在24小时下降≥3 log 10 Ccu\ ml, 则认为该组合是杀菌的。用蓝条和数说明了含有组合的管与仅含有最活跃单剂的管在24小时时的细菌浓度的差异;如果有≥2日志10 Ccu/ml 还原, 组合被认为是协同作用。(A) 大肠菌素 (cst) + 米诺环素 (min), 一种既是协同作用的组合, 也是杀菌作用的组合。(B) 大肠菌素 + 克林霉素 (cli), 一种协同但不杀菌的组合。(C) 大肠菌素 + 红霉素 (ery), 这种组合既不是协同作用的, 也不是杀菌作用的。这些结果最初是作为含有大肠动剂的组合对抗大肠菌群的肠杆菌科的协同活性研究的一部分发表的, 在这项研究中, 我们证明了大肠菌素与许多仅单独活性的抗生素 (如克林霉素) 或主要 (如红霉素) 对革兰氏阳性菌16。(请注意, 红霉素是协同作用的棋盘阵列对所显示的应变, 但不是通过时间杀死, 所以它已在这里被选定作为一个非协同组合的例子。我们假设大肠菌素, 已知的通过革兰氏阴性膜的渗透性作用, 对抗大肠杆菌阴性菌产生亚抑制渗透作用, 允许药物进入, 如克林霉素,通常不能进入革兰氏阴性细胞。这一数字的小组 (A) 已从 Brennan-Krohn、Pironti 和 Kirby 201816、版权©美国微生物学、抗菌剂和化疗协会 (62 (10)、2018、pii: e00873-18、doi:10.1087/aac.0087-18。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
这里描述的两种方法都提供了与个体活动相比, 结合使用的抗菌素的活性信息。自动喷墨打印机辅助数字点胶方法是对《临床微生物学程序手册》 33中描述的方法的一种改编, 而时间终止法则更紧密地遵循相应的协议。参考34。
在棋盘阵列方法中, 确定要添加到每个数量以及这些数量的必要数量的计算是自动化的, 从而消除了手册中遇到的一些潜在错误来源棋盘数组。然而, 调查员仍然必须确定, 原始库存是按预期浓度生产的, 目标最终浓度应正确输入 D300 软件。在384井板中的油井中添加抗菌悬浮液在一开始可能具有挑战性, 需要小心, 以确保移液器吸头进入适当的井, 并且液体不会溅到井的边缘。自动液体处理程序可以用来代替手持多通道移液器, 以提高细菌悬浮液添加到油井中的速度和准确性。如协议所述, D300 要求添加表面活性剂聚山梨酸酯 20 (P-20), 以便进行适当的液体处理。一种不同的表面活性剂, 聚山梨酸酯 80, 浓度为 0.002%, 已被注意到降低大肠菌素 Mic 的生物与 lt;2 μgml 在标准的肉汤微稀释法中的低大肠菌素 Mic。35,36我们的实验室先前证明, 与参考 bmd14相比, 浓度高达0.0015% 的 P-20 对 d300 辅助 mic 结果没有影响。在这里介绍的检测实例中, 最大 P-20 是浓度为0.0014%。
我们在一些棋盘阵列检测中遇到的一个问题是大量的跳井。这发生在与某些抗生素不成比例的比率。具体而言, 在针对一系列抗碳肠杆菌科的组合筛选中, 我们发现521项试验中有49项 (9.4%)由于多次跳井无法使用, 在这些试验中, 12 种抗生素 (fosfomycin 和头孢哌啶) 中有2种占46种 (94%)。这种增加的比率在特别容易受到接种效果31、32、37的药物中可能更有可能。值得注意的是, CLSI 不建议检测 fosfomycin 在肉汤稀释 25 , 由于担心这种方法的结果的可靠性, 这可能解释了不可靠的结果看到这种药物。可以根据调查人员的喜好对自动棋盘方法进行一些修改。如果出于实验室工作流程的原因, 最好将抗菌素分配到已经含有细菌悬浮液的板材中, 而不是空井中。虽然这里使用了384个井板, 但该方法也可以在96孔板检测中进行, 并对井体进行适当的修改。使用96孔板格式可能有助于减少对接种的小变化特别敏感的抗生素的跳过井。在计算 FICi时, 可能会出现 mic 不大规模 (即高于测试) 的情况, 包括被检测的药物与被测试的生物体类型单独没有活动的情况。在这些情况下, FIC 可以根据假设 MIC 比测试的最高浓度高出一稀释。这是最保守的策略, 因为它假定在协同测试中观察到抑制的任何稀释都是可能的 FIC 值。例如, 如果实际的 MIC 是两个加倍稀释高于最高浓度测试, 那么相应的 Fic 将比保守分配低两倍, 依此类推。
为了准确评估药物在时间杀伤试验中的杀菌活性, 培养物必须处于对数阶段的生长状态, 特别是在对细胞壁活性抗生素进行测试时 28。对于本例中使用的快速生长的细菌 (肺炎 k), 3小时的晃动孵育适合于达到这个生长阶段, 但不同的生物可能需要不同的时间。一般来说, 这种文化应该显得明显, 但不应该严重浑浊。通过在连续时间点 (例如, 4-6 每 30分钟) 构建一个生长曲线来确定适当的时间量.意欲的开始接种在时间杀害研究也是重要的。起始接种的目标浓度约为 5 x 10 5 至 1 x 10 6 chu/ml.这里描述的稀释 (100μl 的 1.0 Mfarland 悬浮液在10毫升的介质) 产生这种接种肺炎克雷伯菌和其他肠杆菌科物种,我们已经在其上进行了测试。如果在使用不同生物的实验中开始接种的密度明显高于或低于这一点, 则可能需要不同的稀释。(特定物种所需的适当稀释可以通过执行0.5 或 1.0 McFarland 悬浮液的板块计数来确定, 以确定这种浊度代表多少生物, 然后计算初始悬浮液必须为多少生物稀释以达到适当的最终浓度。如果在对协同作用研究中的板块计数进行回顾时, 发现任何含抗生素管的起始接种都明显低于生长控制的起始接种量, 这可能表明抗生素的结转或非常在短时间内迅速杀灭细菌, 从将细菌添加到含抗生素的试管和取出电镀用的脂肪。如果未稀释的滴落中的实际菌落数量低于随后稀释中的菌落数量,这表明抗生素的结转效应。为防止这种影响, 已经描述了不同的选择, 包括将一个单一的子分散在整个板38上或纺下样品, 去除上清液, 并在电镀39之前在无菌盐水中重新悬浮。在时间终止法的每个时间点, 调查人员也必须有效但准确地从每个培养管中取出一个子, 并执行串行稀释。在这一过程中的延迟, 特别是在连续发生的早期时间点, 可能会导致长时间的培养过程, 在这段时间内, 培养物不会被孵化和动摇, 而不小心分配和连续稀释可能会导致板材不准确计数。与板计数的扩散板方法相比, 每个稀释的100Μl 分布在整个琼脂板上, 所描述的落板方法要快得多, 需要的琼脂板数量要少得多, 并且允许更快的计数, 作为最大值每滴的殖民地数可数为 30, 而通常可以从扩散板计算多达300个菌落。然而, 如果调查人员对这种技术更适应, 扩散板方法也是一种选择。如果滴剂在与多通道移液器一起分配后扩散到对方, 则可以使用单通道移液器进行更宽间距的滴液的单独应用。根据我们的经验, 在分配滴之前在4°C 下冷却板似乎可以减少过度扩散。
这里描述的技术的一个局限性是, 两种类型的协同分析 (棋盘阵列和时间终止) 的结果并不总是一致的, 而且由于大多数发表的协同分析文章使用一种或另一种方法, 而不是两者兼而有之, 它可以很难知道如何集成这两种类型的检测数据。由于我们开发的自动棋盘阵列方法简单且吞吐量高, 因此我们实际上已将其作为一种屏幕来测试对更多分离物的组合, 并确定哪些浓度组合是协同作用的。然后, 我们执行了较少数量的时间终止研究, 选择了在棋盘阵列中有效的组合和浓度。值得注意的是, 由于棋盘检测通常是在微液稀释量表上进行的, 而时间杀伤性检测使用的体积较大 (类似于宏观稀释), 我们发现, 这两种方法有时不同, 而且更高时间测定中通常需要的浓度, 以证明其活性。这种现象已经注意到, 当宏观肉汤和微肉汤稀释 MIC 检测结果比较革兰氏阴性杆菌26和较大的接种 (用于时间终止研究) 与标准接种使用微肉汤稀释和棋盘阵列检测32。棋盘阵列的一个具体局限性是微液稀释 mic 测试22的内在变异性。虽然 FIC i用于协同作用的截断在数学上考虑到了这种可变性, 但这种可变性不可避免地引起了对棋盘阵列结果的可靠性和一致性的关注。
由于所有体外协同试验方法固有的局限性 (包括在人工生长介质中培养细菌、静态抗生素浓度和有限的时间过程), 这些方法获得的结果必须得到确认, 并且使用补充技术进行进一步评估。这些方法包括体外药代动力学/药效学 (pk/pd) 研究 (例如中空纤维感染模型40)、动物模型, 以及最终的人 PK/PD 和疗效研究。此处描述的自动棋盘阵列方法通过提供一种快速方法来筛选组合以获得潜在的协同活动, 从而可以更有针对性地利用这些技术。所有这些方法的进一步自动化, 以及更系统地调查体外参数与临床结果之间的关系, 对于扩大协同试验的使用和提高其临床适用性将是重要的。
Disclosures
D300 数字分配器和相关耗材由 Tecan (北卡罗来纳州 Morrisville) 提供。Tecan 在研究设计、数据收集/解释、手稿准备或出版决定方面没有任何作用。
Acknowledgments
Thea Brennan-Krohn 得到了国家过敏和传染病研究所儿科传染病研究赠款 (T32HD055148) 的支持。T32AI007061), 波士顿儿童医院学院职业发展研究金和国家过敏和传染病研究所职业发展奖 (1K08AI132716)。J. e. k. 得到了国家卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持, 该研究所的奖项号为 R33 AI11114。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli strain ATCC 25922 | ATCC | 25922 | QC strain |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
| 1 L 0.22 µm bottle-top filter | Thermo Scientific Nalgene | 597-4520 | |
| 12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Fisherbrand | 14-961-26 | |
| 15 mL conical tubes | Phenix | SS-PH15 | |
| 15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates | Thermo Scientific | R01620 or R04050 | |
| 25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes | Bellco | 2005-02512 | |
| 25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Bellco | 2011-25150 | |
| 348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids | Greiner Bio-One | 781186 | |
| 50 mL conical tubes | Phenix | SS-PH50 | |
| 50 mL sterile reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells | Fisherbrand | 12-566-612 | |
| 96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids | Evergreen | 222-8032-01R | |
| Cation adjusted Mueller Hinton broth | BD Diagnostics | 212322 | |
| Colistin sulfate | Alfa Aesar | J60915 | |
| D300e Control Software | HP/Tecan | ||
| DensiCHEK Plus McFarland reader | bioMérieux | 21250 | |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | ||
| Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
| HP D300 digital dispenser | HP/Tecan | ||
| HP D300 T8+ cassettes | HP/Tecan | 30097370 | |
| Minocycline hydrochloride | Chem-Impex | 14302 | |
| Picus 12-channel 10-300 µL pipette | Sartorius | 735461 | |
| Polysorbate 20 | Fisher Bioreagents | BP-337 | Brand name: Tween 20 |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271 | |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 PRO | |
| Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette | Eppendorf | 2231000328 |
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