Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Antimicrobica sinergia test di stampante a getto d'inchiostro-assistita Checkerboard automatizzato matrice e il metodo di Time-kill manuale

Published: April 18, 2019 doi: 10.3791/58636
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Antimicrobica sinergia test viene utilizzato per valutare l'effetto di due o più antibiotici usati in combinazione e viene in genere eseguita da uno dei due metodi: la matrice della scacchiera o il dosaggio di time-kill. Qui, presentiamo un automatizzato, a getto d'inchiostro stampante-assistita scacchiera matrice sinergia tecnica e uno studio classico tempo-kill sinergia.

Abstract

Come tassi di patogeni di multidrug-resistente (MDR) continuano a salire, superando lo sviluppo di nuovi agenti antimicrobici, nuovi approcci al trattamento di batteri MDR stanno diventando sempre più una necessità. Un tale approccio è la terapia di combinazione, in cui due o più antibiotici sono utilizzati insieme per trattare un'infezione contro cui uno o entrambi i farmaci possono essere inefficaci da solo. Quando i due farmaci, in combinazione, esercitano una maggiore rispetto a effetto additivo, sono considerati sinergici. Ricerca in vitro di attività sinergica è un primo passo importante nel valutare l'eventuale efficacia di combinazioni di farmaci. Due metodi di prova principale sinergia in vitro sono stati sviluppati: la matrice di scacchiera e lo studio di time-kill. In questa carta, presentiamo un metodo di matrice scacchiera automatizzato che fa uso di tecnologia di stampa a getto d'inchiostro per aumentare l'efficienza e la precisione di questa tecnica, come pure un metodo standard manuale sinergia di time-kill. La matrice di scacchiera automatizzato può servire come un test di screening ad alta resa, mentre lo studio di time-kill manuale fornisce dati aggiuntivi, complementari su uccisione e attività sinergica.

La matrice della scacchiera è una modifica di standard concentrazione inibitoria minima (MIC) test, in cui i batteri sono incubati con antibiotici alle combinazioni differenti concentrazioni e valutati per l'inibizione della crescita dopo incubazione overnight. Manuale delle prestazioni della matrice della scacchiera richiede una laboriosa ed error-prone serie di diluizioni e calcoli. Nel metodo automatizzato presentati qui, il calcolo e l'erogazione della soluzione stock antibiotico necessari volumi sono automatizzati attraverso l'uso di tecnologia di stampa a getto d'inchiostro. Nell'analisi della sinergia di time-kill, batteri sono incubati con gli antibiotici di interesse, sia insieme che singolarmente e campionati a intervalli nel corso di 24 h per coltura quantitativa. I risultati possono determinare se una combinazione è sinergica e se è battericida e fornire dati sull'inibizione e uccisione dei batteri nel corso del tempo.

Introduction

La diffusione di patogeni batterici di multidrug-resistente (MDR), in particolare batteri gram-negativi quali Enterobacteriaceae carbapenem-resistente (CRE), MDR ha lasciato i medici con le opzioni sempre più limitate per la riuscita terapia antinfettiva 1, un problema aggravato dal ritmo lento del romanzo droga antibatterica discovery2,3. Sinergia antimicrobica, in cui due farmaci usati in combinazione esercitano un effetto maggiore di additivo, offre la possibilità di recupero esistenti antibiotici per uso nel trattamento di batteri MDR, anche quando questi batteri sono resistenti a uno o entrambi i gli antibiotici individualmente. Le tecniche descritte in questo articolo forniscono due metodi complementari di sinergia in vitro test che, se utilizzati insieme, consentono gli investigatori a combinazioni di antimicrobici in modo efficiente schermo di interesse per la prova di attività sinergica (automatizzati Metodo della matrice della scacchiera) e quindi di valutare ulteriormente la cinetica di inibizione e di uccisione ha dimostrato dalle combinazioni promettenti individuati nella fase di screening (il metodo manuale di time-kill).

Uno dei metodi più comunemente usati di sinergia in vitro test è il test di matrice della scacchiera, una modificazione della concentrazione minima inibente (MIC) test in cui isolare l'attività inibitoria di due diversi antibiotici contro un batterico sono testati sopra una gamma di concentrazione combinazioni4,5. Se le due droghe esercitano maggiore attività additiva quando utilizzati insieme, la combinazione è considerata sinergico6. Tuttavia, creazione di una matrice di scacchiera manualmente comporta una serie di calcoli e passaggi di diluizione e pipettaggio che sono laboriosi e vulnerabili all'errore umano. Questi vincoli hanno avuto l'effetto di limitare l'uso di sinergia test principalmente per la valutazione retrospettiva di un piccolo numero di combinazioni antibiotiche e isolati batterici e risultati non sono sempre stati coerenti tra studi7, 8,9,10,11. Inoltre, la complessità del test di sinergia ha contribuito alla sua indisponibilità nel laboratorio di microbiologia clinica e per la virtuale assenza di dati di test in vitro sinergia da studi clinici di terapia di combinazione12, 13.

Al fine di aumentare l'efficienza e la velocità effettiva del metodo matrice della scacchiera, abbiamo fatto uso di una tecnica di test automatizzata di MIC precedentemente sviluppata nel nostro laboratorio che utilizza tecnologia di stampa a getto d'inchiostro a proprio e costantemente erogare piccoli volumi soluzione di antibiotico stock nei pozzetti in una piastra di microtitolo14. La piattaforma previene l'esigenza di calcoli complessi e più passaggi di pipettaggio. Il software associato calcola e dispensa volumi appropriati di antibiotici per creare una matrice bidimensionale della scacchiera, se l'utente semplicemente ingressi l'intervallo di concentrazione desiderata e concentrazione della soluzione di riserva degli antibiotici. Abbiamo inizialmente testato questo metodo contro una collezione di CRE isolati15 e successivamente si sono concentrati sulla prova combinazioni contenenti colistina per attività contro gli isolati resistenti colistina16. Colistina è una droga di ultimo ricorso generalmente riservato per l'uso nel trattamento di resistenza MDR patogeni Gram-negativi17,18e colistina rende già MDR batteri quasi pan-resistente19, che li rende ideali candidati per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, uso di droghe che sono insensibili individualmente. Abbiamo trovato che la combinazione di colistina e la sintesi di proteina inibitore antibiotico minociclina hanno avuti un tasso molto alto di sinergia, anche contro i ceppi che erano resistenti a ciascuno di questi farmaci singolarmente, presumibilmente perché colistina esercita un subinibitorie permeabilizing effetto sui batteri anche colistina-resistente. Abbiamo scelto questa combinazione da utilizzare come un esempio in questo documento. Della nota, sinergia test utilizzabile anche da valutare per una maggiore efficacia dei due farmaci che sono entrambi efficaci singolarmente.

Il metodo di matrice automatizzato scacchiera facilita la sinergia rapid, high throughput test. Tuttavia, il metodo di matrice della scacchiera hanno limitazioni. Come un'analisi modificata di MIC, fornisce dati solo su inibizione della crescita batterica e non per uccidere, e non fornisce dati sugli effetti antibiotici nel corso del tempo. Al contrario, manuale delle prestazioni di time-kill sinergia saggi è più laborioso ma fornisce informazioni su inibizione sia uccisione sopra un 24h tempo corso20,21. Abbiamo usato l'analisi tempo-kill su un minor numero di isolati per confermare i nostri risultati di matrice della scacchiera e per determinare se le combinazioni sinergiche abbiamo identificato erano anche battericide.

Entrambi metodi di sinergia di matrice e tempo-kill scacchiera forniscono preziose informazioni sull'attività di combinazioni di farmaci e sono particolarmente utili nella valutazione di potenziali nuove opzioni terapeutiche per altamente resistente ai batteri patogeni. I metodi hanno anche limitazioni intrinseche. Il metodo di diluizione MIC microbroth standard ha una gamma di noto errore previsto di 1 diluizioni22, che è aumentato quando due farmaci sono testati insieme in una matrice di scacchiera. La definizione standard di sinergia, che considera che una combinazione sinergica solo se i farmaci sono attivi insieme a un quarto loro rispettivi MICs6, prende in considerazione questo previsto variabilità, ma tale variabilità (che è pensata per derivare da una combinazione di fluttuazioni biologiche e tecniche23) inevitabilmente genera incertezza circa l'affidabilità dei risultati di sinergia. La mancanza di standard di controllo di qualità stabiliti per le prove di sinergia è anche una limitazione di corrente. Forse la limitazione più significativa di tutti i metodi di collaudo di sinergia è la mancanza di stabilite correlazioni tra i risultati in vitro e gli esiti clinici quando combinazioni sono usati per trattare i pazienti24. Sinergia di più semplice e più rapido test di metodi, come il metodo di matrice automatizzato scacchiera descritto qui, può facilitare l'integrazione di sinergia in vitro testing all'interno di studi clinici o altre valutazioni di risultati per il paziente al fine di meglio caratterizzare il rapporto tra gli effetti in vitro e in vivo in futuro.

Il metodo di matrice scacchiera automatizzato che presentiamo qui offre un'opzione per high throughput screening di una varietà di combinazioni e tiene conto la valutazione rapida di accostamenti insoliti, di "alto rischio-alta ricompensa" senza un grande investimento di tempo e risorse. Il metodo di time-kill, che dimostriamo successivamente, possa fornire ulteriori informazioni di supporto sull'attività sinergica della combinazione e può aiutare a caratterizzare la sua attività battericida e cinetica antibatterico.

Protocol

Attenzione: Utilizzare le procedure di sicurezza appropriate quando si lavora con i batteri. Indossare un camice da laboratorio e guanti in ogni momento. Eseguire il lavoro in una biosicurezza armadietto se aerosol verranno generati o che lavora con gli agenti patogeni ad alto rischio.

Nota: Venti a 24 h prima di iniziare gli esperimenti, striscia fuori la isolate(s) batterica da testare (da uno stock di Colonia-purificato, minimamente i congelati a-80 ° C in brodo di soia triptico con stock 50% glicerolo) su una piastra di agar sangue. Incubare la piastra a 35 ° C nell'aria ambiente.

1. stampante a getto d'inchiostro-assistita automatizzato Checkerboard matrice sinergia

  1. Rendono le soluzioni stock antimicrobiche (colistina e minociclina).
    1. Determinare le concentrazioni di soluzione antibiotica basata sulla solubilità di antibiotici e desiderato concentrazioni finali nella matrice della scacchiera. Fanno scorte di 10 mg/mL di colistina e minociclina per questo esempio. Utilizzare il documento CLSI M100 per determinare solventi appropriati per ogni antibiotico25. Sia colistina e minociclina sono solubili in acqua; Poiché la stampante a getto d'inchiostro D300 richiede l'aggiunta di tensioattivo per liquido acquoso corretta manipolazione, sciogliere gli antibiotici in acqua deionizzata ultrapura con 0,3% polisorbato 20.
    2. Pesare polvere antibiotica usando una bilancia analitica e calcolare il volume di solvente necessaria ad ottenere la concentrazione stock obiettivo.
      1. Se l'antibiotico viene fornito come sale (cloridrato della minociclina, colistina solfato) o in forma idrata (ad es. meropenem triidrato) o se è segnalato dal produttore per avere meno di 100% di purezza, eseguire un calcolo di potenza26 a determinare la quantità di solvente necessario.
      2. Seguire questo esempio del cloridrato della minociclina con una purezza dichiarata di 900 mg/mg:
        Analisi di purezza: 900 mg/mg
        Contenuto di acqua: nessuno
        Frazione attiva: 0.926 (ottenuto dividendo il peso molecolare di minociclina (457.48 Da) dal peso molecolare del cloridrato della minociclina (493,94 Da)).
        Potenza = (purezza Assay) * (1 – contenuto di acqua) * (frazione attiva)
        = (900 mg/mg) * (1) * (0.926) = 833,4 mg/mg o 83.34%
        Quindi determinare il volume di solvente necessario come segue:
        Volume (mL) = [peso (mg) * potenza (mg/mg)] ÷ [concentrazione (mg/mL)]
        Così, ad esempio, se 34,7 mg di minociclina cloridrato polvere è pesato, utilizzare il seguente calcolo per determinare il volume di solvente necessario per ottenere una soluzione di 10 mg/mL:
        Volume = (34,7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2,89 mL
        10.000 mg/mL
    3. Versare la polvere antibiotica in una provetta conica da 15 mL e aggiungere il volume appropriato di acqua più 0,3% polisorbato 20. Vortice fino a completa dissoluzione.
    4. Aliquotare soluzione antibiotica stock in provette per microcentrifuga da 0,5 mL e conservare a-80 ° C fino a che pronto per l'uso.
  2. Eseguire controllo qualità (QC) delle scorte antimicrobici per uso negli esperimenti di matrice scacchiera almeno un giorno prima del test di sinergia affinché QC risultati possono essere valutati prima di utilizzare il brodo per il test di sinergia.
    NOTA:    La tecnica QC qui descritta è identica alla tecnica che sarebbe stata utilizzata per test di concentrazione inibitoria minima (MIC) dei singoli farmaci e può essere utilizzata come tale con eventuali ceppi di interesse per il ricercatore.
    1. Preparare la sospensione batterica.
      1. Prendere un'aliquota di ciascuna azione antibiotica fuori dal congelatore a-80 ° C per avviare lo scongelamento mentre si prepara la sospensione batterica. Vortice, una volta scongelati per garantire che l'antibiotico è in soluzione.
      2. Selezionare un ceppo QC appropriato e determinare l'intervallo accettabile di MIC per farmaci in fase di test basato su tabella 5A-1 a CLSI M10025. Per i farmaci qui, utilizzare e. coli ATCC 25922; i valori MIC per questo ceppo sono 0,25-1 mg/mL per minociclina e 0.25-2 mg/mL di colistina.
      3. Selezionare un intervallo di concentrazioni di antibiotiche per testare che includerà l'intera gamma QC. Utilizzare l'intervallo di 0,0156 mg/mL e 8 mg/mL per minociclina e colistina per ATCC 25922.
      4. Aggiungere 1 mL di sodio cloruro 0,9% a un 12 mm x 75 mm vetro cultura provetta a fondo sferico. Selezionare una o due colonie da una piastra durante la notte di ATCC 25922 e vortice delicatamente per sospendere.
      5. Controllare la concentrazione di batteri utilizzando un lettore di McFarland. Regolare, se necessario con l'aggiunta di cloruro di sodio 0,9% ulteriori o più batteri per ottenere una torbidità McFarland 0,5 lettura.
      6. Preparare una diluizione di 1: 300 della sospensione McFarland 0,5 aggiungendo 100 mL di sospensione per 30 mL di brodo di Mueller-Hinton catione-regolato (CAMHB) in una provetta conica da 50 mL di raggiungere una densità di cella finale di 5 x 105 CFU/mL, come raccomandato da CLSI27.
      7. Con un'ansa sterile da inoculo, striatura di isolamento una goccia dell'inoculo iniziale su una piastra di agar sangue per confermare la purezza dell'inoculo e incubare a 35 ° C nell'aria ambiente.
    2. Aggiungere gli antimicrobici ad una piastra 384 pozzetti a fondo piatto, Piazza-bene, chiara, non trattata usando la D300. Eseguire questo passaggio subito dopo la preparazione sospensione batterica in modo che la sospensione può essere aggiunto alle piastre entro 15 min di preparazione26.
      1. Accendere la stampante a getto d'inchiostro di D300 e il computer associato. Aprire il programma software.
      2. Avviare un nuovo file. Sopra l'immagine della griglia piastra, pulsante destro del mouse su piastra 1 e scegli modifica piastra. Selezionare il tipo di piastra appropriato (384 bene) e il volume supplementare (50 mL).
      3. Aggiungere liquidi (cioè, antibiotiche scorte) al protocollo facendo clic sul segno più accanto a liquidi sul pannello di sinistra. Aggiungere due fluidi (colistina e minociclina).
        1. Passa il mouse sopra il pannello che è apparso per fluido 1 e fare clic sulla matita per modificare. Nome del fluido "Colistina", cambiare classe a "acquoso + Tween 20", modificare la concentrazione a 10.000 e modificare unità di concentrazione in mg/mL (Nota che stock concentrazione è di 10 mg/mL, cioè, 10.000 mg/mL). Lasciare erogare by a concentrazione e lasciare il resto dei campi le impostazioni predefinite. Fare clic su OK.
        2. Ripetere la procedura sopra per fluido 2 (minociclina).
        3. Fare clic sulla scheda Protocollo corrente nella parte superiore dello schermo e modificare la concentrazione (massa) a mg/mL per determinare le unità utilizzate per concentrazioni finali ben antibiotiche.
      4. Selezionare 10 pozzi nella griglia facendo clic e trascinando, quindi fare clic su titolazione nella parte superiore dello schermo. Per specificare titolazione utilizzando selezionare più alta concentrazione, per fluido scegliere colistina, per Più alta concentrazione immettere 8 (assicurarsi che le unità sono mg/mL) e per la distribuzione Selezionare 1:2 (50%). Lasciare i valori predefiniti in posto per il resto della finestra e fare clic su OK.
      5. Ripetere la procedura descritta sopra per minociclina generare la titolazione di minociclina.
      6. Salvare il protocollo e quindi fare clic sul pulsante Esegui in alto a sinistra.
      7. Fare clic sul pulsante Start . Una piastra 384 pozzetti di carico (con il coperchio rimosso) nel supporto piastra e premere Loaded sotto il "carico piastra 1 – sinergia" prompt.
        Nota: Questa richiesta viene scelto dal software e non indica che sinergia test viene eseguito. Inserire un nastro T8 + nel vano e premere Loaded sotto il carico una cassetta T8 + prompt.
      8. Quando richiesto, è possibile aggiungere soluzione antibiotica stock ai serbatoi indicati sulla cassetta. Seguire le istruzioni sullo schermo per caricamento corretto ed erogare con cautela per evitare che eventuali bolle nella soluzione. Dopo l'aggiunta di ogni soluzione, premere il pulsante riempito .
      9. Una volta che la stampante a getto d'inchiostro ha aggiunto antibiotica stock in volumi appropriati a ciascun pozzetto e la casella Esegui completata viene visualizzato, fare clic su Chiudi, rimuovere la piastra e spegnere la D300.
    3. Aggiungere sospensioni batteriche a 384 pozzetti e incubare la piastra.
      1. Versare la sospensione batterica precedentemente preparata in un flacone di reagente sterile.
      2. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 mL di sospensione batterica in tutti i pozzetti contenenti antibiotico. Aggiungere 50 mL di CAMHB senza batteri in un pozzo vuoto; Questo sarà il controllo negativo anche per confermare la sterilità dei media.
      3. Collocare la piastra in un incubatore di aria ambiente 35 ° C ed incubare per 16-20 h26.
        Nota: Una diversa durata di incubazione può essere richiesta se organismi diversi da Enterobacteriaceae sono in fase di sperimentazione; consultare CLSI M10025 per consigli di organismo-specific.
    4. Leggere la piastra su un lettore di micropiastre a una densità ottica di 600 (OD600) e analizzare i risultati.
      1. Utilizzando un programma di foglio di calcolo, ombreggiare le celle con un valore di600 OD di ≥0.07 verde, indicando la crescita e le cellule con un valore di < 0,07 rosso, che indica nessuna crescita.
        Nota: Questi valori sono stati determinati basato su ispezione visiva della crescita vs nessuna crescita e correlazione con letture di OD per questi esperimenti; Letture di600 OD da pozzetti contenenti mezzi da solo erano costantemente sotto 0,07. I tagli appropriati possono differire con batteri e lettura targhe diverse.
      2. Determinare il MIC per ogni farmaco. Il MIC è la più bassa concentrazione di farmaco in cui è inibita la crescita batterica. Se il microfono è nell'intervallo previsto QC secondo il documento CLSI M10025, la soluzione di riserva è appropriata per l'utilizzo.
  3. Preparare la sospensione batterica per matrice della scacchiera.
    1. Prendere un'aliquota di ciascuna azione antibiotica fuori dal congelatore a-80 ° C per avviare lo scongelamento mentre si prepara la sospensione batterica. Vortice, una volta scongelati per garantire antibiotico è in soluzione.
    2. Aggiungi ~ 1 mL di sodio cloruro 0,9% a un 12 mm x 75 mm vetro cultura provetta a fondo sferico. Selezionare una o due colonie da una piastra durante la notte di batteri (in questo caso, e. coli ceppo 0494 FDA-CDC) e agitare delicatamente per sospendere questi nel cloruro di sodio 0,9%.
    3. Controllare la concentrazione di batteri utilizzando un lettore di McFarland. Regolare, se necessario con l'aggiunta di cloruro di sodio 0,9% ulteriori o più batteri per ottenere una torbidità McFarland 0,5 lettura.
    4. Preparare una diluizione di 1: 300 della sospensione McFarland 0,5 aggiungendo 100 mL di sospensione per 30 mL di CAMHB in una provetta conica da 50 mL raggiungere una densità di cella finale di 5 x 105 CFU/mL27.
  4. Aggiungere gli antimicrobici ad una piastra 384 pozzetti a fondo piatto, Piazza-bene, chiara, non trattata usando la D300.
    Nota:     eseguire questo passaggio subito dopo la preparazione sospensione batterica in modo che la sospensione può essere aggiunto alle piastre entro 15 minuti di preparazione26.
    1. Accendere la stampante a getto d'inchiostro, iniziare un nuovo file e aggiungere fluidi per il protocollo come passi 1.2.2.1-1.2.2.3.
    2. Generare la griglia di sinergia.
      1. Fare clic sull'icona di sinergia nella parte superiore dello schermo e procedere con i passaggi. Per tipo selezionare due o più fluidi presi insieme. Per la piastra, non è necessario escludere qualsiasi pozzi; fare clic successivo su questo passaggio senza apportare modifiche.
      2. Nella scheda di titolazione , immettere le concentrazioni antibiotiche e posizionamento.
        1. Al fine di aggiungere minociclina nel fare diminuire il raddoppio diluizioni da 32 a 0,031 mg/mL, oltre a un pozzo negativo con nessun antibiotico, lungo l'asse y , immettere 12 per livelli di titolazione sul pannello di sinistra. Per specificare titolazione utilizzando, selezionare la più alta concentrazione; per liquido, selezionare minociclina; per la più alta concentrazione, immettere 32 (assicurarsi che l'unità è impostata a mg/mL; se non lo è, chiudere la finestra di dialogo sinergia e modificare sotto la scheda Attuale protocollo ). Assicurarsi che sia selezionata la casella di valore comprendono 0 . Cambiare distribuzione a 1:2 (50%).
        2. Ripetere questi passaggi per colistina sul pannello di destro, con 12 livelli di titolazione e una più alta concentrazione di 16. Fare clic su Avanti.
      3. Nella scheda Layout , scegliere i livelli di titolazione dei primi 2 fluidi determinano il numero di righe e colonne in una griglia di layout. Fare clic su Avanti. Se la griglia viene visualizzata come previsto, fare clic su fine.
    3. Salvare il protocollo, quindi fare clic sul pulsante " Esegui " in alto a sinistra.
    4. Fare clic sul pulsante Start . Una piastra 384 pozzetti di carico (con il coperchio rimosso) nel supporto piastra e premere Loaded sotto il carico piastra 1 – sinergia prompt. Inserire un nastro T8 + nel vano e premere Loaded sotto il carico una cassetta T8 + prompt.
    5. Quando richiesto, è possibile aggiungere soluzione antibiotica stock ai serbatoi indicati sulla cassetta. Seguire le istruzioni sullo schermo per caricamento corretto ed erogare con cautela per evitare che eventuali bolle nella soluzione. Dopo l'aggiunta di ogni soluzione, premere il pulsante riempito .
    6. Una volta che il dispenser D300 ha aggiunto antibiotica stock in volumi appropriati a ciascun pozzetto e la casella Esegui completata viene visualizzato, fare clic su Esci, rimuovere la piastra e spegnere la D300.
  5. Aggiungere sospensioni batteriche a 384 pozzetti e incubare la piastra.
    1. Versare la sospensione batterica precedentemente preparata in un flacone di reagente sterile.
    2. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 mL della sospensione in tutti i pozzetti nella matrice della scacchiera. Aggiungere 50 mL di CAMHB senza batteri in un pozzo vuoto; Questo sarà il controllo negativo anche per confermare la sterilità dei media. Incubare in un'incubatrice di aria ambiente 35 ° C per 16-20 h26.
  6. Leggere la piastra su un lettore di micropiastre a OD600 e analizzare i risultati di matrice della scacchiera.
    1. In primo luogo, verificare la purezza della piastra e garantire che le colonie isolate sono di una morfologia unica che è coerenza con la morfologia prevista dell'organismo in fase di test.
    2. Utilizzando un programma di foglio di calcolo, ombreggiare le celle per non indicare la crescita e come al punto 1.2.4.1.
    3. Determinare il MIC per ogni farmaco. Una droga che non inibisce la crescita batterica al più alta concentrazione testata, il MIC è considerato fuori scala.
    4. Per ciascun pozzetto in cui la crescita è inibita, determinare la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) per ogni antibiotico basato su MIC quello dell'antibiotico (Vedi Figura 1B e Figura 2B).
      Nota: La FIC è il rapporto tra la concentrazione di antibiotico in un pozzo in cui la crescita è inibita a sua MIC; così per un farmaco con un MIC di 8 mg/mL, una contenente 8 mg/mL di quella droga ha un FIC di 1, mentre un contenente 4 mg/mL ha un FIC di 0,5.
    5. Calcolare il valore di indice (FICio) concentrazione inibitoria frazionale per ciascun pozzetto in cui la crescita è inibita come somma di FICs di ciascuno dei farmaci in quel pozzo.
    6. Determinare la minima FICio in cui la crescita è inibita (minimo FICio). Se il minimo FICho è £0,5, considera la combinazione sinergica; Se 0,5-4, considera la combinazione indifferente; e se > 4, considera la combinazione antagonistico. Se la combinazione è sinergica presso alcune combinazioni di concentrazione ma antagonista in altri, Nota Questo risultato ma considera la combinazione nel complesso antagonistico.

2. time-kill sinergia test

  1. Rendere le soluzioni stock antimicrobiche. Se questo passaggio viene eseguito prima dell'esperimento, congelare gli stock a-80 ° C fino a che pronto per l'uso.
    1. Determinare le concentrazioni di soluzione antibiotica basata sulla solubilità di antibiotici e desiderato concentrazioni finali in studi di time-kill. In questo esempio, fare scorte di colistina e minociclina ad una concentrazione di 1 mg/mL. Utilizzare il documento CLSI M100 per determinare solventi appropriati per ogni antibiotico25. Utilizzare acqua, come consigliato, per sia colistina e minociclina.
    2. Pesare in polvere antibiotica utilizzando la bilancia analitica e calcolare il volume di solvente necessaria ad ottenere la concentrazione stock obiettivo. Se necessario, eseguire un calcolo di potenza prima di determinare la quantità di solvente necessario, come descritto nel passaggio precedente 1.1.2.1.
    3. Versare la polvere antibiotica nel 15 mL provette coniche e aggiungere il volume appropriato di acqua. Vortice fino a completa dissoluzione.
  2. Utilizzando il metodo di microdilution del brodo manuale descritto in CLSI M0726, eseguire QC di antimicrobico delle scorte per l'uso nel tempo uccidono esperimenti di sinergia. Eseguire questo passaggio almeno un giorno prima del test in modo che QC risultati possono essere esaminati prima di utilizzare lo stock di sinergia.
    1. Selezionare un ceppo QC appropriato e determinare l'intervallo accettabile di MIC per farmaci in fase di test basato su tabella 5A-1 a CLSI M10025. Per i farmaci qui, utilizzare e. coli ATCC 25922; i valori MIC per questo ceppo sono 0,25-1 mg/mL per minociclina e 0.25-2 mg/mL di colistina.
    2. Preparare brodo contenenti antibiotico microdilution piastre.
      1. Selezionare la più alta concentrazione di antibiotico per essere testato in modo è possibile inclusa l'intera gamma QC. Utilizzare una gamma di 0,016 a 8 mg/mL per minociclina e colistina per ATCC 25922.
      2. Diluire le scorte antibiotiche per una soluzione di lavoro in CAMHB a due volte la più alta concentrazione necessaria (perché sarà diluito 1:1 con la sospensione di batteri). In questo esempio, diluire entrambi gli stock da 10 mg/mL a 16 mg/mL.
      3. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 mL di ognuna delle 2 x sospensioni antibiotici in un pozzetto nella prima colonna di una piastra a 96 pozzetti chiara, fondo tondo, non trattata e aggiungere 50 mL di brodo di pianura (cioè senza antibiotico) in ciascun pozzetto della colonne successive.
      4. Rimuovere 50 mL di antibiotico-contenenti brodo da ogni bene nella prima colonna e aggiungere ai pozzetti nella seconda colonna. Pipetta su e giù più volte per mescolare il contenuto, generando una concentrazione di antibiotico metà che della concentrazione nella prima colonna.
      5. Ripetere il passaggio 2.2.2.4 con ogni colonna, così che una serie di diluizioni seriali del duplice, ciascuno con un volume di 50 mL, è preparata. Cambiamento per puntali tra ogni fase di diluizione se lo si desidera per eliminare la possibilità di riporto antibiotico. Nota che le concentrazioni risultanti sono tutti ancora 2x le concentrazioni finali, come essi saranno successivamente diluito 1:1 con sospensione batterica.
      6. Non aggiungere alcun antibiotico per le ultime due colonne, come queste saranno le colonne di controllo negativo e crescita.
    3. Preparare la sospensione batterica.
      1. Preparare una sospensione di McFarland 0,5 da una piastra durante la notte di e. coli ATCC 25922 in 0,9% cloruro di sodio come descritto nella procedura 1.2.1.5-1.2.1.6.
      2. Preparare una diluizione di 1: 150 della sospensione McFarland 0,5 aggiungendo 50 mL della sospensione a 7,5 mL di CAMHB.
        Nota: La sospensione batterica finale sarà diluito 1: 300 una volta è misto 1:1 con la soluzione antibiotica, raggiungendo la densità delle cellule CLSI-consigliato di 5 x 105 CFU/mL27).
    4. Batteri in micropiastra ed incubare.
      1. Aggiungere 50 mL della sospensione batterica in ciascun pozzetto, tranne nella colonna 11th . Aggiungere 50 mL di CAMHB il 11th colonna (controllo negativo).
      2. Incubare la piastra a 35 ° C per 16-20 h.
        Nota: Una diversa durata di incubazione può essere richiesta se organismi diversi da Enterobacteriaceae sono in fase di sperimentazione; consultare CLSI M10025 per consigli di organismo-specific.
      3. Leggere la piastra di crescita utilizzando visivamente la luce trasmessa e, per ogni antibiotico, determinare la concentrazione più bassa in cui non c'è alcuna crescita; Questo è il microfono. Consultare il documento CLSI M07 per ulteriori dettagli sull'interpretazione visiva di MIC26. Se il microfono è nell'intervallo previsto QC, la soluzione di riserva è appropriata per l'utilizzo.
  3. Iniziare la coltura iniziale.
    1. Rendere un 0,5 McFarland sospensione del microrganismo da testare in sterile 0,9% NaCl come descritto sopra.
    2. Aggiungere 100 mL di 0,5 McFarland sospensione a 5 mL di CAMHB in un vetro di 25 x 150 mm tondo tubo cultura inferiore con chiusura in acciaio inox e agitare delicatamente per mescolare.
    3. Con un'ansa sterile da inoculo, striatura di isolamento una goccia della sospensione diluita su una piastra di agar sangue per confermare la purezza dell'inoculo e incubare a 35 ° C nell'aria ambiente.
    4. Sostituire la chiusura sul tubo e incubare in una rastrelliera per provette su un agitatore a 35 ° C nell'aria ambiente per almeno 3 ore, fino a raggiunta logaritmica-fase di crescita (Vedi punto 2.6.1). Procedere al punto 2.4, mentre la cultura è in incubatrice.
  4. Preparare soluzioni antimicrobiche in 25 x 150 mm vetro provette di coltura.
    1. Estrarre antimicrobiche stock aliquote dal congelatore a-80 ° C per lo scongelamento. Vortice, una volta scongelati per garantire antibiotico è in soluzione.
    2. Mentre la cultura iniziale è in incubazione, aggiungere 10 mL di CAMHB a cinque provette di coltura del vetro sterilizzato nell'autoclave 25 x 150 mm e aggiungere soluzioni antibatteriche stock come segue.
      Nota: Per uno studio di sinergia, dovrebbe essere almeno un farmaco ad una concentrazione che non riguarda la crescita della curva singolarmente28; Questo può essere determinato valutando gli effetti delle concentrazioni di farmaco individuale prima dello studio di sinergia.
      1. Filmato 1: Aggiungere la quantità appropriata di antibiotici #1 per ottenere la concentrazione di antibiotico finale di destinazione. In questo caso, aggiungere 10 mL di 1 mg/mL di brodo di colistina per ottenere una concentrazione finale di colistina di 1 mg/mL, in quanto si tratta di una concentrazione che è inefficace contro il ceppo utilizzato in questo esempio.
      2. Filmato 2: Aggiungere la quantità appropriata di antibiotico #2 per ottenere la concentrazione finale antibiotica da testare. In questo caso, aggiungere 10 mL di 1 mg/mL di brodo di minociclina per ottenere una concentrazione finale di 1 mg/mL, una concentrazione che è inefficace contro il ceppo utilizzato in questo esempio.
      3. Filmato 3: Aggiungere la stessa quantità di antibiotico #1 e antibiotico #2 come utilizzati in tubi 1 e 2. In questo caso, aggiungere 10 mL di 1 mg/mL di brodo di minociclina e 10 mL di 1 mg/mL di brodo di colistina.
      4. Tubo 4: non aggiungere antibiotici; Questo sarà il tubo di controllo di crescita.
      5. Filmato 5: non aggiungere antibiotici; Questo sarà il tubo di controllo negativo.
  5. Preparare 96 piastre pozzo profondo in polipropilene con pozzi di 2 mL per diluizioni seriali aggiungendo 900 µ l di cloruro di sodio 0,9% sterile a righe B-H di colonne 1-5 con una pipetta multicanale.
  6. Preparare l'inoculo iniziale e aggiungere ai tubi.
    1. Una volta che la coltura ha raggiunto la fase di crescita logaritmica (~ 3 h per Klebsiella pneumoniae, l'organismo utilizzato in questo esempio), rimuovere il tubo di cultura da shaker, vortice trasferire delicatamente, ~ 1 mL di sospensione in una provetta di cultura del vetro 12 x 75 mm, e controllare la densità con un lettore di McFarland.
      1. Se è inferiore a 1,0 McFarland, tornare tubo shaker e incubare più. Se è maggiore di 1,0 McFarland, aggiungere CAMHB al tubo, vortice delicatamente e ri-campione, ripetendo il processo fino a quando la sospensione è a 1,0 McFarland.
    2. Aggiungere 100 mL della sospensione McFarland 1,0 per tubi 1-4 e vortex delicatamente.
  7. Aliquote di campione da ogni cultura ed eseguire serie di diluizioni di dieci volte.
    1. Al tempo 0 (immediatamente dopo l'aggiunta di batteri ai tubi) e a 1, 2, 4, 6 e 24 h, è possibile rimuovere un 150ml aliquota da ciascuna provetta di cultura inclinando il tubo in modo che solo la punta della pipetta sterile entra il tubo e non l'albero pipettatore non sterili durante il ritiro di aliquota. Aggiungere le aliquote, rispettivamente, pozzetti consecutivi nella prima riga della piastra pozzo profondo 96 precedentemente preparato. Ritorno tubi a una rastrelliera per provette su un agitatore in un'incubatrice di aria ambiente 35 ° C immediatamente dopo la rimozione di aliquote a ciascun punto di tempo.
    2. Usando una pipetta multicanale, rimuovere 100ml da riga A, aggiungere alla riga B (che contiene 900 mL di sodio cloruro 0,9%) e pipettare su e giù 4 - 5 volte al mix, creando un 01:10 diluizione. Eliminare i puntali seguendo ogni passaggio di diluizione per evitare il riporto di batteri, che può condurre ai conteggi di Colonia falsamente elevati.
    3. Ripetere il passaggio 2.7.2 per righe B-H con nuove punte di pipetta per ogni riga.
  8. Piastra diluito campioni per conteggi di Colonia utilizzando la goccia piatto metodo29,30.
    1. Mueller-Hinton agar targhette con le condizioni di antibiotiche e diluizione per essere placcato.
    2. Utilizzando una pipetta multicanale e punte extra-lunghe (per assicurare che le punte raggiungere in sospensione), rimuovere 10ml da ogni pozzetto nella prima colonna e dispensare accuratamente in una riga sulla piastra adeguatamente etichettata. Se si utilizzano piastre piccole (diametro 100 mm), dispensare 3 righe (ciascuno composto da gocce da righe A-H di una singola colonna) per piastra; su grandi piatti (150 mm di diametro), erogare 8 righe per piastra.
    3. Consentire gocce asciugare completamente (~ 15 min).
    4. A 24 h, mettere una goccia di 10 mL prelevata direttamente dal tubo di controllo negativo in una zona indicata di una delle piastre per verificare di sterilità. Invertire le piastre e incubare per una notte a 35 ° C nell'aria ambiente.
  9. Colonie di contare e calcolare la densità delle cellule. Contrassegnare le colonie con un pennarello indelebile di multa-punta sul retro della piastra per evitare duplicazioni o mancante colonie.
    1. In primo luogo, verificare la purezza della piastra e garantire che le colonie isolate sono di una morfologia unica che è coerenza con la morfologia prevista dell'organismo in fase di test.
    2. Per ogni serie di diluizioni, identificare gocce con 3-30 colonie (in genere una goccia ogni serie di diluizioni). Contare le colonie in queste gocce e registrare il conteggio con il fattore di diluizione.
      1. Se non esistono Nessun gocce in una serie di diluizioni con 3-30 colonie, contare le colonie nell'ultima goccia con > 30 colonie e la prima goccia con < 3 colonie (questi dovrebbero essere adiacenti gocce).
    3. Per ogni serie di diluizioni, calcolare il numero di colonie del unità per millilitro (UFC/mL) del campione basata sul numero di colonie a goccia utilizzando la seguente formula: CFU/mL = n(1 /d) (100) dove n è il numero di colonie, d è il fattore di diluizione (1 per il campione non diluito (riga A), 0,1 o 10-1 per il primo 01:10 diluizione (riga B), 0,01 o 10-2 per la seconda 01:10 diluizione (riga C) e così via e il costante 100 account per il fatto che il volume totale della goccia s 10 mL, mentre il valore finale è espresso in CFU/mL, cioè, CFU/1.000 mL. Utilizzare un foglio di lavoro contenenti formule che calcolano CFU/mL dal conteggio delle colonie per semplificare questo processo.
      1. Per serie di diluizioni dove più di una goccia è numerabile (o dove due gocce ha dovuto essere contato perché nessuna goccia cadde nella gamma), media finale CFU/mL conta per contato tutte le gocce.
      2. Perché il limite inferiore di rilevamento è di 300 CFU/mL (3 colonie nella goccia non diluita), record e trama conteggio delle colonie come £300 CFU/mL per serie di diluizioni in cui esistono < 3 colonie nella goccia non diluita.
    4. Ispezionare la goccia di controllo di sterilità da tempo 24; Se si osserva qualsiasi crescita in questa goccia, i risultati dell'esperimento non devono essere utilizzati.
  10. Grafico e analizzare i risultati.
    1. Tracciare le curve di crescita da tre culture contenenti Antibiotico e il controllo di crescita sullo stesso grafico. Tracciare il tempo sull'asse x e CFU/mL, utilizzando una scala logaritmica, sull'asse y .
    2. Calcolare la differenza in CFU/mL tra il tubo di combinazione in momento 24 e l'agente singolo più attivo al tempo 24. Se la differenza è ≥ 2 log10, considerare la combinazione sinergica. Quindi calcolare la differenza tra il tubo di combinazione fase 24 e in tempo 0 CFU/mL. Se la differenza è ≥ 3 log10, considerare la combinazione battericida.

Representative Results

Figura 1A presenta una griglia da un esperimento di sinergia di matrice scacchiera nella quale minociclina a concentrazioni di 0-32 μg/mL è stato combinato con colistina alle concentrazioni di 0-16 μg/mL e testato contro Escherichia coli ceppo FDA-CDC 0494. I valori rappresentano letture spettrofotometriche a densità ottica 600 nm (OD600). Pozzetti con valori di600 OD inferiore a 0,07 (che corrisponde a nessuna crescita mediante ispezione visiva) sono rosso sfumato, mentre pozzi con valori di OD600 0.07 (che corrisponde alla crescita mediante ispezione visiva) sono verde sfumato. Per ogni farmaco, la concentrazione inibitoria minima (MIC; in grassetto) è la più bassa concentrazione di farmaco che inibisce la crescita batterica. Per minociclina, si tratta di 32 μg/mL e per colistina, è 8 μg/mL. L'ombreggiatura viene mantenuta in Figura 1B, ma i valori all'interno dei pozzetti in cui la crescita è inibita vengono sostituiti dai valori di indice (FICio) concentrazione inibitoria frazionario. Questi sono determinati come segue: in ciascun pozzetto, l'indice di concentrazione inibitoria frazionario (FIC) di ogni droga è calcolato dividendo la concentrazione di antibiotico in quel pozzo di MIC della droga, e la FICmi viene calcolato sommando i due FICs. Pozzetti con un FICho valore di 0,5, che è considerato il cut-off per sinergia, sono indicati con un bordo rotto, e il pozzo con il valore più basso FICho (0,094) è in grassetto. Poiché il minimo valore FICho è nella gamma sinergica, la combinazione è considerata sinergica.

Figura 2A e 2B figura mostrano griglie analoghi a quelli in Figura 1A e 1B di figura, ma in questo caso la combinazione non dimostra sinergia contro l'isolato testato (K. pneumoniae isolato 4 BIDMC), perché il minimo FICio in cui la crescita è inibita è 1, che è > 0.5.

La figura 3 illustra le letture di densità ottica da una griglia di sinergia della scacchiera in cui diversi pozzi saltati, si è verificato (l'enterobatterio cloache complesso isolato BIDMC 27). Saltato pozzi sono pozzi in cui è inibita la crescita batterica nonostante la presenza di crescita batterica in pozzetti adiacenti con le più alte concentrazioni di antibiotico. Questo fenomeno, che è conosciuto per accadere in standard MIC Test pure, è probabilmente dovuto la variabilità biologica nelle caratteristiche di crescita batterica da bene per bene e la sensibilità di alcuni antibiotici per piccole differenze di inoculo batterico23 , 31 , 32. se più di uno saltato bene si è verificato in una matrice di scacchiera, abbiamo scartato i risultati e ripetuto il dosaggio.

Figura 4 presenta esempi di risultati di time-kill sinergia di tre combinazioni testati contro K. pneumoniae isolano BIDMC 32. Conteggi di Colonia sono indicati in una scala logaritmica sul y-axis e tempo, in ore, sulla x-asse. La differenza tra l'inoculo iniziale nella provetta contenente la combinazione di farmaci e la concentrazione dei batteri in quel tubo a 24 h è illustrata dalla barra rossa e numero, mentre la differenza tra la concentrazione di batteri a 24 h tra il tubo contenente la combinazione e la provetta contenente l'agente singolo più attivo da solo è illustrata dalla barra blu e dal numero. Figura 4A Mostra risultati dalla combinazione di colistina e minociclina; Questa combinazione era sinergica (differenza tra le concentrazioni di batteri esposti a combinazione e a più attivo agente solo ≥ 2 log10 CFU/mL a 24 h) e battericida (declino da a partire di inoculo per concentrazione alle 24 h ≥ 3 log10 CFU/mL). Figura 4B Mostra i risultati dalla combinazione di colistina e clindamicina, una combinazione che era sinergica ma non era battericida. Questa combinazione ha inibito la crescita dei batteri, che né droga ha fatto da solo, ma non li uccidono. Figura 4 Mostra i risultati dalla combinazione di eritromicina, che non era né battericida che sinergici e colistina.

Figure 1
Figura 1: Matrice di Checkerboard risultati dimostrando sinergia (minociclina + colistina testato contro Escherichia coli ceppo 0494 FDA-CDC). (A) spettrofotometrica interpretazione della lettura e la crescita di una matrice di scacchiera. I valori nelle celle sono le letture di densità ottica a 600 nm (OD600). Le celle con valori di600 OD inferiore a 0,07 (corrispondenti a nessuno sviluppo mediante ispezione visiva) sono rosso sfumato, mentre le celle con valori di OD600 0.07 (corrispondente alla crescita mediante ispezione visiva) sono verde sfumato. Calcolo dell'indice (FICio) concentrazione inibitoria frazionario (B). Ombreggiatura che indica crescita o nessuna crescita è stata mantenuta. Valori per colistina e minociclina lungo x- e y-assi, rispettivamente, ora rappresentano la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC), o il rapporto tra la concentrazione del farmaco in tale colonna o riga alla concentrazione minima inibente ( MIC) di quella droga da solo. Il valore in ogni cella è il FICio, o la somma di FICs dei due farmaci in quel pozzo. La grande scatola linea-bordered rotta racchiude pozzi con un FICsono pari a 0,5. La cella di spessore-bordered indica il pozzo con il più basso FICio in cui la crescita è inibita, o il minimo FICio. Poiché il minimo FICho è 0,5, la combinazione è considerata sinergica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Risultati della matrice della scacchiera di una combinazione che non dimostrano sinergia (minociclina + colistina testato contro K. pneumoniae isolare BIDMC 4). i valori di densità ottica (A) a 600 nm e crescita ' interpretazione dei risultati di matrice scacchiera come descritto nella figura1a. Calcolo dell'indice (FICio) concentrazione inibitoria frazionario (B) come descritto nella figura1a. Perché il minimo FICmi è > 0.5, la combinazione non è considerata sinergica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Risultati di matrice scacchiera che sono non interpretabili dovuto saltato pozzi (minociclina + colistina testato contro l'enterobatterio cloache complesso isolare BIDMC 27). i valori di densità ottica a 600 nm e crescita ' interpretazione dei risultati di matrice scacchiera come descritto nella figura1a. Diversi pozzi saltati, in cui è inibita la crescita batterica nonostante la presenza di crescita in pozzetti adiacenti con le più alte concentrazioni di antibiotico, sono dimostrati. Risultati non sono interpretabili e sperimentare ha bisogno di essere ripetuta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Risultati di sinergia di Time-kill di tre combinazioni testati contro K. pneumoniae isolato BIDMC 32. Conteggi di Colonia sono indicati in una scala logaritmica sul y-axis e tempo, in ore, sulla x-asse. La differenza tra la concentrazione dei batteri nella combinazione a 24 h e l'inoculo iniziale nel tubo è illustrata dalla barra rossa e dal numero. Se il declino di avvio inoculo a concentrazione a 24 h è ≥ 3 log10 UFC/mL, la combinazione è considerata battericida. La differenza tra la concentrazione di batteri a 24 h tra il tubo contenente la combinazione e la provetta contenente l'agente singolo più attivo da solo è illustrata dalla barra blu e numero; Se c'è ≥ 2 log10 riduzione CFU/mL, la combinazione è considerata sinergica. (A) colistina (CST) + minociclina (MIN), una combinazione che sia sinergico e battericida. (B) colistina + clindamicina (CLI), una combinazione che è sinergica ma non battericida. (C) colistina + eritromicina (ERY), una combinazione che non è né sinergico che battericida. Questi risultati sono stati inizialmente pubblicati come parte di uno studio dell'attività sinergica di colistina-contenenti combinazioni contro colistina-resistente Enterobacteriaceae, in cui abbiamo dimostrato che colistina era sinergica con un numero di antibiotici che operano solo singolarmente (es. clindamicina) o principalmente (ad es. eritromicina) contro batteri Gram-positivi16. (Nota che l'eritromicina era sinergica di matrice scacchiera contro il ceppo indicato, ma non da tempo di uccidere, così è stato selezionato qui come un esempio di una combinazione non sinergica.) Abbiamo supposto che colistina, che è noto per agire di permeabilizzazione della membrana esterna gram-negativa, esercita un effetto permeabilizing Sub su batteri gram-negativi resistenti alla colistina, che consenta l'immissione di farmaci come la clindamicina che normalmente non può entrare nella cellula gram-negativa. Pannello (A) di questa figura è stato modificato da Brennan-Krohn, Pironti e Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, agenti antimicrobici e chemioterapia, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I due metodi descritti qui entrambi forniscono informazioni sull'attività di antimicrobici utilizzati in combinazione rispetto alla loro attività individuali. Automatizzato, digitale a getto d'inchiostro stampante-assistita metodo di erogazione è un adattamento del metodo descritto in Clinical Microbiology procedure manuale33, mentre il metodo time-kill segue più da vicino il protocollo corrispondente dallo stesso fare riferimento a34.

Nel metodo di matrice della scacchiera, i calcoli per determinare il volume necessario di antimicrobici stock per aggiungere a ciascun pozzetto nonché l'erogazione di questi volumi è automatizzato, eliminando così alcune delle principali fonti potenziali di errore in un manuale matrice della scacchiera. È ancora essenziale, tuttavia, che l'investigatore determina che gli stock originali sono rese a concentrazione che intendono e che le concentrazioni finali di obiettivo sono inserite correttamente nel software D300. Aggiungendo la sospensione antimicrobica per pozzetti in una piastra 384 pozzetti può essere difficile in un primo momento e richiede cura per garantire quel pipetta suggerimenti Inserire appositi pozzetti e quel liquido non splash fino ai bordi dei pozzi. Un gestore di liquido automatico utilizzabile in sostituzione di una pipetta multicanale portatile per aumentare la velocità e la precisione con cui la sospensione batterica è aggiunto ai pozzi. Come descritto nel protocollo, la D300 richiede l'aggiunta del tensioattivo, polisorbato 20 (P-20), per la corretta gestione di liquida. Un tensioattivo diverso, polisorbato 80, ad una concentrazione di 0,002%, è stato notato per abbassare il MICs colistina per organismi con colistina microfoni di < 2 µ g/mL in brodo standard microdilution saggi. 35 , 36 il nostro laboratorio precedentemente dimostrato che P-20 alle concentrazioni fino a 0,0015% non ha avuto effetto su D300-assistita MIC risultati in confronto con riferimento BMD14. Nell'esempio saggio presentato qui, la P-20 massima è concentrazione è 0,0014%.

Un problema che abbiamo incontrato con alcuni saggi di matrice della scacchiera era un gran numero di pozzi saltati. Ciò è avvenuto ad un tasso sproporzionato con alcuni antibiotici. In particolare, in una schermata di combinazioni contro una collezione di carbapenem-resistente Enterobacteriaceae, abbiamo trovato che mentre 49 di 521 prove (9,4%) erano inutilizzabili a causa di pozzi multipli saltati, 2 dei 12 antibiotici testati (Fosfomicina e cefepime) rappresentati il 46 di queste prove (94%). Tali tassi aumentati possono essere più probabili in farmaci che sono particolarmente suscettibili alla inoculo effetto31,32,37. Della nota, CLSI non consiglia test fosfomicina in brodo diluizione25 dovuto le preoccupazioni circa l'affidabilità dei risultati con questo metodo, che può spiegare i risultati inaffidabili visti con questo farmaco. Possono essere apportate alcune modifiche al metodo di scacchiera automatizzati in base alle preferenze di investigatore. Antimicrobici possono essere erogati in piastre contenenti già sospensione batterica, piuttosto che nei pozzetti vuoti, se questo è preferibile per ragioni di flusso di lavoro all'interno del laboratorio. Mentre piastre da 384 pozzetti sono state utilizzate qui, il metodo può essere effettuato in saggi di piastra a 96 pozzetti con modifica appropriata del volume ben. L'uso di un formato di piastra a 96 pozzetti può aiutare a wells riducente saltato per gli antibiotici che sono particolarmente sensibili alle piccole variazioni di inoculo. Quando calcolo FICho, potrebbe trattarsi di situazioni in cui il MIC è fuori scala (cioè, superiore a quello testato), comprese situazioni dove il farmaco da testare non ha attività singolarmente contro il tipo di organismo in fase di test. In questi casi, la FIC può essere calcolata sulla base supponendo che il microfono è una diluizione superiore alla concentrazione massima testata. Questa è la strategia più conservativa, in quanto presuppone il valore massimo possibile di FIC per qualsiasi diluizione dove l'inibizione è osservata durante la prova di sinergia. Ad esempio, se l'effettivo MIC erano invece due diluizioni raddoppio sopra la più alta concentrazione testato, allora il corrispondente FICs sarebbe duplice inferiore le assegnazioni di conservatore e così via.

Al fine di valutare con precisione l'attività battericida delle droghe in un'analisi di time-kill, è essenziale che le culture sia in fase logaritmica di crescita, particolarmente quando antibiotici attivi parete cellulare vengono testati28. Per i batteri di rapida crescita utilizzati in questo esempio (K. pneumoniae), 3 ore di incubazione con l'agitazione era appropriato per raggiungere questa fase di crescita, ma diverse quantità di tempo può essere necessaria per diversi organismi. In generale, la cultura dovrebbe apparire visibilmente ma non pesantemente torbida. La giusta quantità di tempo può essere determinata mediante la costruzione di una curva di crescita con i conteggi di Colonia presi a serial tempo punti (ad esempio, ogni 30 min per 4-6 h)38. L'inoculo iniziale previsto nello studio tempo-uccidere è anche importante. La concentrazione target dell'inoculo iniziale è di circa 5 x 105 a 1 x 106 CFU/mL. La diluizione descritta qui (100 μL di sospensione McFarland 1,0 in 10 mL di media) genera questo inoculo per Klebsiella pneumoniae e altre specie Enterobacteriaceae in cui lo abbiamo testato. Se la densità della partenza inoculi in un esperimento utilizzando diversi organismi è significativamente più alto o più basso di questo, poi una diluizione differente può essere necessaria. (La diluizione appropriata necessaria per una determinata specie può essere determinata eseguendo un conteggio di piastra di sospensione McFarland 0,5 o 1,0 per determinare quanti organismi questo torbidità rappresenta, quindi calcolare l'importo da cui la sospensione iniziale deve essere diluito per raggiungere la concentrazione finale appropriata.) Se, sulla revisione della conta su piastra dallo studio sinergia, l'inoculo iniziale di una qualsiasi delle provette contenenti antibiotico risulta sono stati significativamente più basso dell'inoculo iniziale del controllo di crescita, ciò potrebbe indicare entrambi riporto antibiotico o molto rapida uccisione dei batteri in breve tempo fra aggiunta di batteri nella provetta contenente Antibiotico e rimozione dell'aliquota per la placcatura. Se il numero effettivo delle colonie nella goccia non diluita in una serie è inferiore rispetto al numero di colonie in diluizioni successive, questo suggerisce effetto antibiotico riporto. Diverse opzioni sono state descritte per impedire questo effetto, tra cui diffusione una singola aliquota sopra un' intera piastra38 o filatura giù il campione, rimuovere il supernatante e ri-sospensione in una soluzione salina sterile prima della placcatura39. In ogni punto tempo il metodo time-kill, è anche fondamentale per lo sperimentatore per in modo efficiente ma accuratamente rimuovere un'aliquota da ciascuna provetta di cultura ed eseguire diluizioni seriali. Ritardi durante questo processo, particolarmente durante i primi punti di tempo che si verificano in stretta successione, possono portare a periodi prolungati durante i quali culture non sono state incubate e scosso, considerando che incurante di erogazione e diluizioni seriali possono portare alla piastra imprecisa conta. Rispetto al metodo di piastra diffusione di piastra conteggio, in cui 100 μL di ogni diluizione si sviluppa su una piastra di agar intero, il metodo della piastra goccia descritto è molto più veloce, richiede un numero molto inferiore di piastre di agar e permette per il conteggio più veloce, come il massimo numerabile numero di colonie per ogni goccia è 30, mentre fino a 300 colonie può in genere essere contato da una piastra di diffusione. Tuttavia, il metodo della piastra di diffusione è anche un'opzione se gli investigatori sono più comodi con questa tecnica. Se gocce diffuso in altro dopo l'erogazione con una pipetta multicanale, singola applicazione delle gocce più ampiamente distanziati con una pipetta monocanale può essere eseguita invece. Nella nostra esperienza, piastre a 4 ° C prima dell'erogazione di gocce di raffreddamento sembrava ridurre eccessiva diffusione.

Una limitazione delle tecniche descritte qui è che i risultati dei due tipi di test di sinergia (matrice di scacchiera e tempo-kill) non sono sempre concordi, e poiché gli articoli di sinergia più pubblicati utilizzano un metodo o l'altro piuttosto che entrambi insieme, può essere difficile sapere come integrare dati da due tipi di analisi. Perché il metodo di matrice automatizzato scacchiera che abbiamo sviluppato è semplice e ad alta produttività, abbiamo usato esso in effetti come una sorta di schermo per testare combinazioni contro un più grande numero di isolati e per determinare quali combinazioni di concentrazione erano sinergici. Abbiamo quindi effettuato un numero minore di studi di time-kill, selezionando combinazioni e le concentrazioni che erano stato efficace nella matrice della scacchiera. Di nota, perché l'analisi della scacchiera viene in genere eseguita su una scala di diluizione microbroth, mentre l'analisi tempo-kill utilizza più grandi volumi (simile a una diluizione di macrobroth), abbiamo trovato che FICs talvolta erano differenti fra i due metodi, con maggiore concentrazioni generalmente richieste nell'analisi tempo-uccidere per dimostrare l'attività. Questo fenomeno è stato notato in precedenza, quando macrobroth e microbroth diluizione MIC Test risultati vengono confrontati per bacilli gram-negativi26 e quando inoculi più grandi (come quello usato in studi di time-kill) vengono confrontati con l'inoculo standard utilizzato in matrice di diluizione e scacchiera microbroth dosaggi32. Un limite specifico della matrice della scacchiera è la variabilità inerente in diluizione microbroth MIC Test22. Mentre FICho tagli per conto di sinergia per questa variabilità matematicamente6 tale variabilità inevitabilmente genera preoccupazione circa l'affidabilità e la coerenza dei risultati di matrice della scacchiera.

A causa delle limitazioni inerenti alla sinergia tutto in vitro (inclusa la coltivazione di batteri in un terreno di coltura artificiale, concentrazioni di antibiotiche statiche e un corso di tempo limitato) metodi di prova, i risultati ottenuti con questi metodi devono essere confermati e ulteriormente valutato utilizzando tecniche supplementari. Tali metodi includono studi in vitro farmacocinetica/farmacodinamica (PK/PD) (ad esempio, la fibra cava infezione modello40), modelli animali e, in definitiva, gli studi umani di PK/PD e l'efficacia. Il metodo di matrice automatizzato scacchiera descritto qui, fornendo un metodo rapido con cui a combinazioni di schermo per potenziali attività sinergica, permette per più mirato l'utilizzo di queste tecniche. Ulteriormente l'automazione di tutti questi metodi, come così come più sistematica indagine sulla relazione tra parametri in vitro e gli esiti clinici, sarà importante nel ridimensionamento fino l'uso di sinergia test e aumentando la sua applicabilità clinica.

Disclosures

Il dosatore digitale D300 e consumabili associati sono stati forniti da Tecan (Morrisville, NC). Tecan non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta e interpretazione di dati, preparazione del manoscritto o decisione di pubblicare.

Acknowledgments

Thea Brennan-Krohn è stata sostenuta da un Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e malattie infettive pediatriche di sviluppo umano di ricerca formazione grant (T32HD055148), un Istituto nazionale dell'allergia e malattie infettive formazione grant ( T32AI007061), borsa di studio di Boston bambini ospedale ufficio di facoltà sviluppo carriera sviluppo della facoltà e il National Institute of Allergy e malattie infettive career development award (1K08AI132716). J.E.K. è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, sotto numero premio R33 AI119114. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  26. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7 (1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.16.1-5.16.23 (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , 5.14.1.11 (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).

Tags

Immunologia e infezione numero 146 sinergia antimicrobica antibiotica sinergia sinergia la resistenza antimicrobica resistenza di colistina Enterobacteriaceae carbapenem-resistente sinergia di time-kill matrice della scacchiera automazione stampa inkjet
Antimicrobica sinergia test di stampante a getto d'inchiostro-assistita Checkerboard automatizzato matrice e il metodo di Time-kill manuale
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E.… More

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter