Formålet med denne artikel er at give en omfattende, systematisk guide til effektiv rensning af histonerne H3 og H4 og kvantificering af acetyleret Histon restkoncentrationer.
I alle eukaryote organismer er kromatin, den fysiologiske skabelon af alle genetiske oplysninger, afgørende for arvelighed. Kromatin er genstand for en bred vifte af forskelligartede posttranslationelle modifikationer (PTMs), som for det meste opstår i de amino termini af Histon proteiner (dvs., Histon hale) og regulere tilgængelighed og funktionelle tilstand af den underliggende DNA. Histon haler udvide fra kernen af nucleosome og tilsætning af grupper af Histon acetyltransferases (hatte) og fjernelse af grupper af Histon deacetyltransferase (HDAC’er) under cellulære vækst og differentiering. Specifikke acetylation mønstre på lysin (K) restkoncentrationer på Histon haler bestemme en dynamisk homøostase mellem transcriptionally aktive eller transcriptionally undertrykt kromatin af (1) påvirker kernen Histon forsamling og (2) rekruttering synergistisk eller antagonistiske kromatin-associerede proteiner til webstedet transskription. De grundlæggende regulerende mekanisme af den komplekse karakter af Histon hale PTMs påvirker fleste kromatin-skabelonbaserede processer og resultater i ændringer i celle modning og differentiering i både normale og patologiske udvikling. Målet med den foreliggende betænkning er at give nybegyndere en effektiv metode til at rense core Histon proteiner fra celler og hjernevæv og pålideligt kvantificere acetylation mærker på histonerne H3 og H4.
Sigt Epigenetik refererer til arvelige ændringer i genet aktivitet, der opstår uafhængigt af ændringer i DNA sekvens1,2. Gen transskription og undertrykkelse bestemmes af (1) adgangen til de kromosomale DNA snoet omkring en octamer af core Histon proteiner (to eksemplarer hver af H2A, H2B, H3 og H4) og (2) udbuddet af transkriptionsfaktorer og stillads proteiner rekrutteret til specifikke promotor websteder3,4. Gen transskription er reguleret af enzym-medieret ændringer af bestemte DNA promotor websteder og PTMs af Histon haler5,6,7. N-termini af Histon H3 og H4 er blandt de mest velbevarede sekvenser kendt i Eukaryote organismer3, og deres posttranslationelle modifikationer er blevet udførligt dokumenteret for at spille en central rolle i fastlæggelsen af kromatin struktur og funktionen8,9. PTMs på Histon haler (dvs., acetylation, methylering, fosforylering og ubiquitination) ændre interaktion potentiale af haler, påvirke de strukturelle tilstand og foldning af kromatin fiber, og dermed regulere DNA tilgængelighed og behandling af4,10,11,12. Acetylgrupper føjes til og fjernes fra K rester på Histon haler af en række specifikke Histon-interagere epigenetiske enzymer, nemlig hatte og HDAC’er, henholdsvis13. For eksempel, har acetylation af Histon H4 på lysin 12 (H4K12ac) tidligere vist at aktivere transkription af gener relateret til hukommelse erhvervelse og konsolidering14. Derudover tyder flere linjer af beviser på, at genet transskription enzym-medieret epigenetiske kontrol er et afgørende aspekt af sunde cellulære vækst og differentiering6,15. Vekslen i den epigenetiske regulering af genekspression, enten af epigenetiske modifikationer af DNA eller af en mutation i de epigenetiske enzymer, selv, har vist sig at være dysregulated i menneskelige sygdomme hvor ændring i et bestemt genaktivitet er kendetegnende patologi (fx, kræft)6,16,17. Således, vurdering af ændringer i kernen Histon PTMs fremstår som en høj værdi mål for potentielle terapeutiske indgreb. Dog har bestemme overfloden, interagerende partnere og specifikke roller af histonerne PTMs bevist udfordrende18.
I den aktuelle betænkning, er der beskrevet en optimeret, medium-overførselshastighed strategi til at rense core histoner fra celler og hjernen væv i en enkelt fraktion, og en fuldstændig protokol til kvantificering af histonerne H3 og H4 PTMs. Af note, selv om i øjeblikket er publiceret syre-baserede rensning teknikker og antistof-baserede Histon opdagelse strategier er blevet bredt vedtaget for Histon karakterisering, de mangler beskrivende detaljer vedrørende kritiske faser af proceduren, således hindrer hurtig og replikerbar Histon udvinding og kvantificering. For eksempel, behandling af celle uddrag og væv biopsier kræver forskellige værktøjer og teknologier for vellykket ekstraktion. Desuden viser den optimerede protokol præsenteret i de aktuelle manuskript en praktisk, medium-overførselshastighed tilgang. Core histoner er udtrukket som en enkelt, rene fraktion, som muliggør pålidelig downstream antistof-medieret PTM detektion uden indblanding fra urenheder. Desuden, i det aktuelle manuskript, har udfordringer vedrørende Histon registrering på grund af deres lille molekylvægt omgået. Typisk, manglen kompatibilitet mellem rensning, kvantificering og gel elektroforese protokoller hindre forskere fra at opnå replikerbar og afgørende resultater. Her, præsenteres en optimeret arbejdsprocessen til at rense core histoner fra celler og væv og forberede dem til downstream PTM analyser via vestlige skamplet.
Den nuværende protokol giver mulighed for rensning af core Histon proteiner samtidig bevare deres indfødte posttranslationelle modifikationer (dvs., acetylation, methylering og fosforylering). Figur 1 viser tidslinjen af Histon rensning protokol.
I den nuværende arbejde viste vi en optimeret metode til at rense core Histon proteiner og kvantificere Histon H3 og H4 PTMs (fx, acetylation). Præsenteres-protokollen er en omfattende arbejdsproces, der inkorporerer optimeret procedurerne vedrørende celler og hjernen væv forberedelse, rå Histon rensning og detaljerede Histon nedbør, eluering og kvantificering, der efterfølges af Histon elektroforese og robust Histon PTM kvantificering. Den store mængde af oplysninger her giver mulighed for en replikerbar generation af data af høj kvalitet, på trods af behovet for langvarig manipulationer af Histon prøver.
Mange i øjeblikket publicerede protokoller kræver brug af HPLC at isolere ren brøkdele af histonerne H3 og H419. Selvom HPLC er en kraftfuld teknik, afskrække dens kompleksitet og lav-overførselshastighed de fleste molekylærbiologer og nonexperts fra sin hyppig brug. Faktisk, HPLC er ikke tilgængelig for mange labs, og højt kvalificerede personale er forpligtet til at drive instrumentet. HPLC er ofte tidskrævende, dyrt og potentielt farlige. Præsenteres her er en billig, medium-overførselshastighed strategi til at opnå resultater af tilsvarende kvalitet, der omgår HPLC. Den rapporterede strategi er også mere praktiske og egnet til brug i næsten enhver lab da det bruger en simpel spin kolonne tilgang, som ikke kræver specialiseret instrument operation færdigheder. Derudover er Histon H3/H4 tetramer udtrukket som en enkelt, ren, og rigelige brøkdel, gør det muligt for en pålidelig kvantificering af bevarede PTMs på hver af proteinerne.
PTMs er ekstremt følsomme over for ændringer i oxidativ stress og ændringer i pH20,21. Således, i modsætning til tidligere offentliggjorte metoder18rapporterer vi en effektiv strategi for skylning celler i serumfrit medier til at sikre et minimum metaboliske forstyrrelser af celler og at undgå indblanding af de indfødte PTMs med serum komponenter. Den nuværende protokol ikke kun omfartsveje den traditionelle kerner isolation, men også giver optimal gange for celle lysis og den nøjagtige væv homogenisering procedure, der giver mulighed for bevarelse af den nukleare kuvert samtidig undgå nukleare sammenlægning. Selv om udvinding tid kan manipuleres baseret på antallet af celler, celletype anvendes, væv størrelse, etc., er udvidede lysis ikke ønskeligt, da det kan føre til lysering af kerner og DNA release, så prøven svært at håndtere. Flere kontrolposter i protokollen findes vigtigere, for validering af vellykket Histon rensning (fx, trin 2.7 og 3.2.3). Denne strategi også letter fejlfinding i hele den langvarige procedure.
Et andet vigtigt og enestående træk ved præsenteres protokollen er dens fuld kompatibilitet med efterfølgende western blot analyseværktøjer og andre, hvis det ønskes. Histon proteiner er fundet på ~ 15 kDa13,22,23 og, på samme måde til andre små molekylvægt proteiner, har bevist udfordrende at opdage ved hjælp af standard immunoblotting teknikker. Brug af en høj ydeevne og høj overførselshastighed transfersystemet i kombination med optimal opløsning protein geler giver mulighed for vedligeholdelsen af protein indfødte bekræftelse (i mangel af SDS) og aktivitet i mangel af SDS og høj overførselshastighed effektivitet af lavmolekylære Histon proteinerne, således sikrer en pålidelig Histon PTM kvantificering.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne udtrykke deres taknemmelighed til Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Alzheimer’s Research Program (tilskud 6AZ08 og 7AZ26), NIH-NIAAA (grant 5R01AA023781-03) og American Heart Association (grant 17PRE33660831).
1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFiser Scientific | 05-408-129 | or equivalent from other sources |
Sterile water | Gibco | 15-230-204 | or equivalent from other sources |
70% perchloric acid | Sigma Aldrich | 311421 | or equivalent from other sources |
100% acetone | Sigma Aldrich | 270725 | or equivalent from other sources |
pH-indicator strips, non-bleeding | Milliipore Sigma | 1095310001 | |
4x SDS sample buffer | BIO-RAD | 161-0747 | |
Benchtop rotor | Cole-Parmer | UX-04397-34 | or equivalent from other sources |
1.5 mL tube rack | ThermoFiser Scientific | 05-541 | or equivalent from other sources |
Histone purification mini kit | Active Motif | 40026 | spin columns included in the kit |
Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFiser Scientific | 78430 | or equivalent from other sources |
Nanodrop instrument | ThermoFiser Scientific | ND-2000 | |
Tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | required for histone extraction from cultured cells |
Tissue culute media | varies based on cell line used | varies based on cell line used | required for histone extraction from cultured cells |
Low-serum media | ThermoFiser Scientific | 51985091 | required for histone extraction from cultured cells |
Plastic cell scraper | Falcon | 353086 | required for histone extraction from cultured cells |
SDS-PAGE gradient gel | BIO-RAD | 456-9035 | required for histone extraction from cultured cells |
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | BIO-RAD | 1610436 | required for histone extraction from cultured cells |
Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution | BIO-RAD | 1610438 | required for histone extraction from cultured cells |
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | required for histone extraction from cultured cells |
Trans-Blot Turbo Transfer System | RIO-RAD | 1704150 | required for histone extraction from cultured cells |
Ponceau S stain | CellSignalling | 59803S | required for histone extraction from cultured cells |
Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance | Kimble Chase | 885302-0007 | required for histone extraction from tissues |
100% bleach | Clorox | 68973 | required for histone extraction from tissues |
H4K12ac antibody | Active Motif | 39166 | required for PTMs quantification via WB |
H3K27ac antibody | Active Motif | 39134 | required for PTMs quantification via WB |