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Neuroscience

माउस मस्तिष्क में लोकस का स्थानीयकरण

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/58652
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 1
1Department of Physiology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, 3Department of Molecular and Medical Genetics, OHSU, 4X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

बिन्दुओं का एक छोटा सा समूह है, जो विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल न्यूरॉन्स है । यहाँ, हम इस नाभिक में प्रोटीन और धातुओं के अध्ययन के लिए माउस मस्तिष्क वर्गों को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

लोकस (LC) (नियंत्रण रेखा) norepinephrine का एक प्रमुख केंद्र ंयूरॉंस का उत्पादन है कि शारीरिक कार्यों की एक संख्या मिलाना है । नियंत्रण रेखा के संरचनात्मक या कार्यात्मक असामान्यताएं कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस, और सेरिबैलम सहित कई मस्तिष्क क्षेत्रों प्रभाव और अवसाद के लिए योगदान कर सकते हैं, द्विध्रुवी विकार, चिंता, साथ ही पार्किंसंस रोग और अल्जाइमर रोग. ये विकार अक्सर धातु की असंतुलन के साथ जुड़े होते हैं, लेकिन एलसी में धातुओं की भूमिका आंशिक रूप से समझ में आ जाती है । विज्ञान के morphologic और कार्यात्मक अध्ययन बेहतर मानव विकृतियों और धातुओं के योगदान को समझने के लिए आवश्यक हैं । चूहों एक व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रयोगात्मक मॉडल हैं, लेकिन माउस नियंत्रण रेखा (~ ०.३ मिमी व्यास) छोटे और एक गैर विशेषज्ञ के लिए पहचान करने के लिए मुश्किल है. यहाँ, हम माउस मस्तिष्क में नियंत्रण रेखा को स्थानीयकृत करने के लिए एक कदम दर कदम इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन. डोपामाइन-β-hydroxylase (dbh), और वैकल्पिक रूप से, tyrosine hydroxylase (वें), दोनों उच्च नियंत्रण रेखा में व्यक्त एंजाइमों, मस्तिष्क स्लाइस में immunohistochemical मार्कर के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. LC-युक्त वर्गों के आसन्न वर्गों आगे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, रूपात्मक अध्ययन के लिए प्रोटोकॉल सहित, चयापचय परीक्षण, साथ ही एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा धातु इमेजिंग (xfm).

Introduction

बिंबावासी में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है और नोराएपिनेफ्रिन (पूर्वोत्तर) उत्पादन1का एक प्रमुख स्थल है । नियंत्रण रेखा कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम3 के लिए मस्तिष्क2 भर में अनुमानों भेजता है और circadian ताल4,5, ध्यान और स्मृति6सहित प्रमुख शारीरिक प्रक्रियाओं, नियंत्रित करता है, तनाव7, संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं8, और भावना9,10. नियंत्रण रेखा के रोग स्नायविक और neuropsychiatric विकारों में फंसाया गया है11, पार्किंसंस रोग सहित12,13,14, अल्जाइमर रोग14, अवसाद15 ,16,17, द्विध्रुवीविकार 18,19, और चिंता20,21,22,23, 24. इन भूमिकाओं को देखते हुए, नियंत्रण रेखा का विश्लेषण अपने कार्य और शिथिलता का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

चूहों को व्यापक रूप से शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है । उनके छोटे आकार के कारण, माउस LC ~ ३०० μm की एक औसत व्यास है, कठिनाई संरचना का पता लगाने के लिए अग्रणी. मस्तिष्क sectioning के दौरान, नियंत्रण रेखा आसानी से या तो कोरोनल या सममितार्द वर्गों में याद किया जा सकता है । पशुओं में नियंत्रण रेखा की पहचान का वर्णन उपलब्ध अध्ययन एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल है कि एक गैर विशेषज्ञ1,25का पालन कर सकते है प्रदान नहीं करते हैं । इस प्रकार, नियंत्रण रेखा के स्थानीयकरण के लिए मार्गदर्शन की पेशकश करने के लिए, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हम कई अनुप्रयोगों के लिए माउस मस्तिष्क में इस क्षेत्र का पता लगाने के लिए विकसित (चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3). प्रोटोकॉल ध्यान से नियंत्रित मस्तिष्क परिच्छेदन और immunohistochemical पता लगाने पर लागू होता है dbh26,27, या वैकल्पिक रूप से24वें, दोनों एंजाइमों उच्च LC28में समृद्ध । एक बार नियंत्रण रेखा इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री द्वारा स्थित है, आसन्न मस्तिष्क स्लाइस आगे के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, रूपात्मक और चयापचय विश्लेषण सहित, साथ ही एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से धातु इमेजिंग अध्ययन (xfm)29. हम xfm का वर्णन इस प्रोटोकॉल में एक उदाहरण के रूप में (चित्रा 3) ।

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Protocol

पशुओं के अध्ययन जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग (acuc) प्रोटोकॉल संख्या M017M385 द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. ब्रेन टुकड़ा करने की क्रिया

  1. स्थिर करने के लिए, 3% आइसोफ्लूराने के अनुप्रयोग द्वारा चूहों को एनेस्थेटिज करें ।
    1. आइसोफ्लूराने की बूंदों के साथ एक कपास की गेंद को भिगो दें और इसे 15 मिलीलीटर माइक्रोअपरेपिज ट्यूब में रखें । जानवरों की नाक को ट्यूब में रखें और इसे आइसोफ्लूराने को श्वास लेने दें । पैर की अंगुली-चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई के लिए जाँच करें ।
  2. अपनी पीठ पर जानवर प्लेस और अपने पेट के लिए उपयोग कर रही है, जबकि एक टी पिन के साथ नीचे अपने हाथ-पांव पिनिंग द्वारा इसे स्थिर ।
  3. पेट की त्वचा से एक स्निप बनाकर और छाती क्षेत्र में त्वचा के माध्यम से कटौती करके सर्जिकल कैंची से जानवर को काटें । टी पिन का उपयोग कर त्वचा को पिन कर लीजिये । फिर छाती को पेरिटोनियल झिल्ली को तोड़ने. वक्ष गुहा खुर और डायाफ्राम काटने से दिल बेनकाब ।
  4. सही atrium काट रक्त जानवर से बाहर प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं । बाईं वेंट्रिकले में एक 25 गेज सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज डालें और 10 मिलीलीटर फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) के साथ शवद ।
    नोट: यह समाधान प्रणालीगत परिसंचरण और सही atrium के माध्यम से बाहर निकलने के माध्यम से प्रवाह करने के लिए अनुमति देता है ।
  5. 10 मिलीलीटर सिरिंज को निकालें और ६० मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 25 गेज सुई डालें । बर्फ ठंडा 4% पैराफॉर्मालडिहाइड (पीएफए) के ५० मिलीलीटर के साथ बाएं वेंट्रिल के माध्यम से perfuse ।
    1. एच2ओ में 10% पीएफए समाधान को कम करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम 4% पीएफए समाधान को ठंडा करके आइस कोल्ड 4% पीएफए समाधान तैयार करें ।
  6. माउस के सिर को अलग करें और खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें ।
    1. त्वचा को गर्दन से काटें, और फिर खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए आंखों की ओर काटें । नाक के लिए गर्दन से खोपड़ी दरार, और फिर एक नेत्रगोलक से दूसरे करने के लिए । खोपड़ी को छील कर बाहर निकाल दें और पूरे मस्तिष्क को एक्साइज करें ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 ज के लिए 4% पीएफए में मस्तिष्क को सेते हैं ।
  8. 30% सुक्रोज समाधान के 25 मिलीलीटर से भरा एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में संदंश के साथ मस्तिष्क स्थानांतरण । यह 48-72 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक मस्तिष्क ट्यूब के नीचे करने के लिए डूब ।
  9. मस्तिष्क के माध्यम से एक वयस्क माउस मस्तिष्क स्लाइसर मैट्रिक्स कोरोनल के माध्यम से कट (~ 3 मिमी bregma के पीछे) । ब्रेनन युक्त मस्तिष्क खंड रखें ।
    नोट: यह दो मस्तिष्क वर्गों में परिणाम होगा-एक कॉर्टेक्स के सबसे युक्त (कटौती के पूर्वकाल) और एक से युक्त ब्रेनपीम/सेरिबैलम (कटौती के पीछे). निम्न चरणों के लिए ब्रेम em अनुभाग का उपयोग करें ।
  10. एक embedding मोल्ड के तल पर रखा कट सतह के साथ ब्रेनन अनुभाग एंबेड, इष्टतम काटने तापमान यौगिक (OCT) से घिरा हुआ; एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर करने के लिए एम्बेडेड मस्तिष्क ले जाएँ और अधिक से अधिक 12 एच के लिए फ्रीज – आगे उपयोग तक.
  11. cryostat में काटना: एम्बेडिंग मोल्ड cryostat में अक्टूबर में मस्तिष्क युक्त जगह; cryostat की है कि करने के लिए मस्तिष्क ब्लॉक के तापमान को समायोजित करने के लिए कई घंटे के लिए क्रायोस्टेट में सेते.
  12. दूर embedding मोल्ड छील करने के लिए अक्टूबर मस्तिष्क युक्त ब्लॉक बेनकाब ।
  13. मस्तिष्क को छूने के बिना ब्लॉक की सतह से OCT के अतिरिक्त हटाने के लिए रेज़िडोर ब्लेड का प्रयोग करें ।
  14. माउंट cryostat के चक पर अक्टूबर ब्लॉक, सामने की ओर मस्तिष्क की कटौती की सतह को उजागर ।
  15. मस्तिष्क की कटौती की सतह को समायोजित करें ताकि यह cryostat के razorblades के समानांतर में उन्मुख है ।
  16. मेडुला में शुरुआत मस्तिष्क ट्रिम, १०० μm वर्गों काटने rostrally ।
  17. एक सतत स्लाइस के रूप में सेरिबैलम और ब्रेनसेम कटौती जब तक rostrally ट्रिम. ५० μm मोटाई पर स्लाइस का संग्रह शुरू ।
    नोट: एक के रूप में मेडुला से rostrally छांटो, ब्रेंडन और सेरिबैलम दो अलग वर्गों के रूप में कटौती करेगा । रोस्ट्रम वर्गों में, ब्रेनसेम और सेरिबैलम अंततः 4वें वेंट्रिकले के स्तर पर विलय होगा । एक बार 4वें वेंट्रिकले के पार्श्व किनारों को अच्छी तरह से बनाया जाता है, तो सेरिबैलम और ब्रेनसेम एक निरंतर स्लाइस के रूप में बाहर आ जाएंगे ।
    1. संदंश के साथ OCT-घिरा मस्तिष्क टुकड़ा लीजिए और यह pbs (चित्रा 2a) के साथ भरा एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से जगह है । नियंत्रण रेखा सबसे प्रमुख जब सेरिबैलम और अवर कोलीकुलस में एक दूसरे से मिलने जाएगा ~-५.५२ mm bregma के पीछे (चित्र 1b) ।
      नोट: नियंत्रण रेखा के सबसे पूर्वकाल भाग गायब हो जाएगा एक बार सेरिबैलम पूरी तरह से खोदी गई है और अब पर अवर कोलीकुलस चारों ओर से घेरे ~-५.३४ मिमी bregma के पीछे (चित्रा 1c).

2. डोपामाइन β-hydroxylase या tyrosine hydroxylase (चित्रा 2) के लिए इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री

  1. Day 1
    1. चयनित स्लाइस को पीबीएस में 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं ।
    2. 24 एच के लिए ०.५% फास्फेट में पारगमयता 4 डिग्री सेल्सियस पर डिटर्जेंट (pbsd) के साथ खारा buffered ।
      1. पीबीएस के 25 मिलीलीटर में डिटर्जेंट का पतला १२५ μl ।
  2. दिन 2
    1. ०.५% pbsd में 5 मिनट के लिए स्लाइस को तीन बार धोएं ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५% pbsd में 1:500 के कमजोर पड़ने पर 18 ज के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी, एंटी-डीबीएच या एंटी-गु जोड़ें ।
  3. Day 3
    1. ०.५% pbsd में 10 मिनट के लिए तीन बार स्लाइस धो लें ।
    2. वांछित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (ग्रीन प्रतिदीप्ति के लिए ४८८ गधा विरोधी खरगोश) में 1:1000 की एक कमजोर पड़ने पर ०.५% pbsd के लिए 16 ज ।
    3. एल्यूमीनियम में 24 अच्छी तरह थाली लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह है ।
    4. ०.५% pbsd में 5 मिनट के लिए स्लाइस को तीन बार धोएं ।
    5. पीबीएस में 5 मिनट के लिए धो लें ।
    6. एक पेंसिल ब्रश के साथ एक पानी के कंटेनर में स्लाइस स्थानांतरण ।
    7. आरोपित स्लाइडों पर पानी में तैरते माउंट स्लाइस ।
    8. coverslip हार्ड सेट बढ़ते मीडिया के साथ वर्गों (dapi के बिना) ।
    9. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए घुड़सवार मस्तिष्क वर्गों सूखी ।
    10. उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी फ्लोरोफोर तरंगदैर्घ्य से संकेत का पता लगाने के लिए सेटिंग्स के साथ एक संनाभि या फ्लोरिसेंट माइक्रोस्कोप पर छवि मस्तिष्क स्लाइस ।
    11. मस्तिष्क स्लाइस के फोकल विमान को खुर्दबीन समायोजित करें और 10x इज़ाफ़ा पर एक छवि ले ।
    12. मस्तिष्क स्लाइस में एक संभव एलसी क्षेत्र का पता लगाने के लिए, अभिविन्यास के लिए 4वें वेंट्रिकले का उपयोग करें; सेरिबैलम वेंट्रिकले के ऊपर स्थित है, pons और ब्रेनसेम30से नीचे पाए जाते हैं ।
    13. नियंत्रण रेखा का पता लगाने के लिए, 4वें वेंट्रिकले के पार्श्व किनारों पर ध्यान केंद्रित; नियंत्रण रेखा 4गु वेंट्रिल के किनारों से निकलती है और पोनों/ब्रेनकेम क्षेत्र (चित्रा 2b, 2b) की ओर इंगित करती है ।
    14. इमेजिंग और कुछ मस्तिष्क स्लाइस में नियंत्रण रेखा के स्थानीयकरण के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क स्लाइस युक्त स्लाइड की दुकान ।

3. मस्तिष्क स्लाइस में नियंत्रण रेखा का पता लगाने

  1. नियंत्रण रेखा युक्त मस्तिष्क अनुभाग का पता लगाने के लिए, ऊपर वर्णित के रूप में माउस मस्तिष्क स्लाइस और 24 अच्छी तरह से व्यंजन भरा pbs में वर्गों इकट्ठा, के रूप में चित्रा 2aमें दिखाया गया है ।
    1. एक मस्तिष्क अनुभाग के प्रति अच्छी तरह से जगह के लिए नियंत्रण रेखा के समुचित स्थानीयकरण के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. ४८ मस्तिष्क स्लाइस कि मस्तिष्क प्रति immunostained हो जाएगा की कुल लीजिए ।
    नोट: चित्रा 2a में दिखाए गए दो व्यंजन के सभी कुओं में एक जानवर से मस्तिष्क स्लाइस होते हैं ।
  3. immunostain dbh, या गु के लिए हर तीसरे पांचवें टुकड़ा करने के लिए । अधिमानतः, उन मस्तिष्क स्लाइस कि आगे (एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, xfm) के माध्यम से बीएसए कर रहे हैं के निकट हैं इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री प्रदर्शन.
    नोट: यह प्रक्रिया अंतिम परख स्लाइस में नियंत्रण रेखा के सटीक स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2a; कुओं के बीच संख्या के साथ लेबल) ।
  4. आवेदन के आधार पर इम्यूनोसना कर रहे हैं कि मस्तिष्क स्लाइस की संख्या को समायोजित करें, उदा, चाहे वे केंद्र और नियंत्रण रेखा के किनारे के सटीक स्थान की आवश्यकता होती है, या सिर्फ एक मोटा सन्निकटन.
  5. इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री के बाद, 4वें वेंट्रिकले (चित्रा 2b, 2b) के दोनों किनारों पर अभिव्यक्ति का एक विशिष्ट पैटर्न के माध्यम से नियंत्रण रेखा युक्त मस्तिष्क स्लाइस का पता लगाएं । लगातार मस्तिष्क स्लाइस के नियंत्रण रेखा में dbh संकेत के आवर्धन चित्रा 2d, 2eमें दिखाया गया है; नियंत्रण रेखा की आवर्धित छवि है कि गु के लिए दाग है चित्रा 2f में दिखाया गया है ।
  6. आगे के अध्ययन के लिए नियंत्रण रेखा से युक्त उन वर्गों का प्रयोग करें-xfm के लिए इस मामले में धातु के स्तर यों तो (चित्रा 3) ।
  7. xfm करने के लिए, इकट्ठा 10-30 μm (सेटअप पर निर्भर करता है) पतली पतली बहुलक फिल्म जिसके साथ वे नमूना धारकों पर रखा जा सकता है और synchrotron पर imaged पर कोरोनल मस्तिष्क स्लाइस ।
  8. स्टोर मस्तिष्क स्लाइस जो xfm के लिए पतली पॉलीमेरिक फिल्म पर कमरे के तापमान पर तैयार कर रहे है और xfm प्रदर्शन ।

4. xfm के माध्यम से नियंत्रण रेखा में धातु इमेजिंग

  1. स्लाइस उदाहरण माउस मस्तिष्क के रूप में ऊपर वर्णित है, नियंत्रण रेखा का निर्धारण, और इन मस्तिष्क एलसी युक्त स्लाइस से xfm के माध्यम से धातु के स्तर को मापने ।
  2. उन्नत फोटॉन स्रोत (आर्गोने नेशनल लेबोरेटरी, आर्गोने आईएल) में बीएमलाइन 2-आईडी-ई पर इमेज मौलिक वितरण ।
  3. रिकॉर्ड डेटा ' मक्खी पर '31पहले वर्णित के रूप में.
  4. मस्तिष्क स्लाइस कार्यक्रम नक्शे३२,३३का उपयोग कर युक्त में मौलिक सांद्रता निर्धारित करें ।

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Representative Results

(जैसे Cu, Fe, zn, और Mn के रूप में) धातु homeostasis में परिवर्तन अक्सर न्यूरोलॉजिकल विकारों में देखा जाता है, नियंत्रण रेखा में परिवर्तन सहित३४,३५. इस प्रकार, मस्तिष्क में धातु के स्तर का निर्धारण रोग तंत्र की समझ के लिए आवश्यक है. वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके जनरेट किए गए मस्तिष्क अनुभागों को lc में Cu और अन्य धातुओं के स्तर को मापने और उन्हें नियंत्रण रेखा के बाहर के क्षेत्रों में स्तरों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (चित्र 3) । हमारे उदाहरण में, मस्तिष्क स्लाइस कि नियंत्रण रेखा के माध्यम से काटा गया था, फॉस्फेट, पोटेशियम, क्लोराइड और तांबे मापा गया था । केवल कॉपर विशेष रूप से नियंत्रण रेखा में ऊंचा किया गया था । उच्च संकल्प xfm इमेजिंग (यहां नहीं दिखाया गया है) भी धातु के स्तर के subcellular वितरण का पता लगाने के लिए किया जा सकता है । इसके अलावा इस प्रोटोकॉल के संभावित अनुप्रयोगों बहुतायत का पता लगाने और dbh के इंट्रासेलुलर वितरण (चित्रा 2b, 2d, 2b), गु (चित्रा 2b, 2b), और अंय नियंत्रण रेखा में व्यक्तिगत रूप से या में व्यक्त प्रोटीन शामिल सह-धुंधला assays, नियंत्रण रेखा आकारिकी और न्यूरोनल घनत्व के अध्ययन.

Figure 1
चित्रा 1: माउस ब्रेम में नियंत्रण रेखा का स्थानीयकरण । (क) योजनाबद्ध रूप से ब्रेनेटम के उस क्षेत्र का प्रदर्शन करना जो नियंत्रण रेखा को स्थानीयकृत करने के लिए खोदी जाएगी । (ख) paxinos और फ्रैंकलिन ब्रेन एटलस30के आधार पर, नियंत्रण रेखा सबसे प्रमुख होगा जब सेरिबैलम और अवर कोलिक्युलस एक दूसरे से मिलने (-५.५२ मिमी bregma के पीछे) । बाईं छवि नियंत्रण रेखा के माध्यम से एक कोरोनल अनुभाग में कटौती से पता चलता है, जबकि सही छवि nissl धुंधला के माध्यम से 4वें वेंट्रिकले के पार्श्व किनारों पर नियंत्रण रेखा के स्थानीयकरण को दर्शाता है । (ग) नियंत्रण रेखा का सबसे पूर्वकाल भाग गायब हो जाएगा एक बार सेरिबैलम पूरी तरह से खोदी गई है और अब अवर कोलिक्युलस चारों ओर से घेरे (-५.३४ मिमी bregma के पीछे). सही छवि पर nissl धुंधला पता चलता है कि नियंत्रण रेखा केवल मामूली इस कोरोनल टुकड़ा में मौजूद है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: dbh या वें के लिए immunostaining मस्तिष्क स्लाइस द्वारा नियंत्रण रेखा का पता लगाने. (क) एक माउस मस्तिष्क मस्तिष्क स्टेम के आसपास ५० μm स्लाइस में खोदी और २ २४ अच्छी तरह से व्यंजन में एकत्र किया गया था । हर 5वें से 8वें एकत्र मस्तिष्क स्लाइस xfm के माध्यम से इमेजिंग के लिए फिल्म कवर coverslip पर रखा गया था । इन स्लाइस कुओं के बीच नीले रंग की संख्या के साथ लेबल कर रहे हैं । pbs में चल आसन्न स्लाइस dbh के लिए immunostained नियंत्रण रेखा का पता लगाने के लिए (कुओं पर रेड क्रॉस के साथ लेबल) थे । हरे घेरे dbh संकेत के लिए सकारात्मक स्लाइस निरूपित करता है, और इस तरह नियंत्रण रेखा शामिल हैं । (इ) एक कोरोनल मस्तिष्क स्लाइस जिसमें LC को dbh के साथ इम्यूनोसना और एक संनाभि सूक्ष्मदर्शी पर imaged किया गया था । छवि (हरे रंग में) नियंत्रण रेखा में मजबूत संकेत से पता चलता है । (ग) एक कोरोनल टुकड़ा जिसमें नियंत्रण रेखा को tyrosine hydroxylase (गु) और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर imaged के लिए immunostained था । छवि दोनों बाएँ और दाएँ नियंत्रण रेखा के लिए मजबूत संकेत से पता चलता है. (घ) स्लाइस dbh के लिए immunostained थे, और 7 स्लाइस (बाईं ओर) और 9 (दाईं ओर) निहित LC । आसन्न वर्गों xfm विश्लेषण के लिए चयन किया गया. (ई) स्लाइस 10 भी नियंत्रण रेखा से पता चला । इस खंड में, वाम नियंत्रण रेखा अपने केंद्र के माध्यम से कटौती की थी, जबकि सही नियंत्रण रेखा अपने पूर्वकाल-सबसे बढ़त पर कब्जा कर लिया था । (च) एक खंड जिसमें नियंत्रण रेखा को गु के लिए इम्यूनोसना और एक संनाभि सूक्ष्मदर्शी पर imaged किया गया था । छवि हरे रंग में लेबल नियंत्रण रेखा में ंयूरॉंस व्यक्त गु दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: नियंत्रण रेखा में धातु के स्तर की इमेजिंग । घन-ट्रांसपोर्टर ATP7B के एक नॉकआउट के साथ एक पुरुष 12-सप्ताह पुराने माउस के मस्तिष्क अलग और इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था । गैर दाग नियंत्रण रेखा से सटे स्लाइस-युक्त वर्गों लिया गया और धातु के स्तर xfm के माध्यम से मापा गया । Cu स्तर विशेष रूप से नियंत्रण रेखा में वृद्धि हुई (पीले तीर के साथ लेबल) के रूप में आसपास के मस्तिष्क क्षेत्र की तुलना में, जबकि अंय तत्वों (कश्मीर, पी, और सीएल) अपरिवर्तित थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

ठीक से नमूना orienting इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है । क्योंकि हम नियंत्रण रेखा का पता लगाने के लिए मस्तिष्क की पृष्ठीय सतह की संरचनात्मक विशेषताओं का उपयोग कर रहे हैं (सेरिबैलम और अवर कोलिक्युलस के बीच सीमा), यह महत्वपूर्ण है कि वर्गों ठीक से गठबंधन किया. यह ठीक से माउस मस्तिष्क स्लाइसर मैट्रिक्स में मस्तिष्क की स्थापना में देखभाल की आवश्यकता है । हम को काटने की सलाह देते हैं ~ ५०० μm अधिक ऊतक पूर्वकाल और नियंत्रण रेखा के पीछे के लिए नाभिक से बचने के लिए. सबसे आम गलती नियंत्रण रेखा पूरी तरह से लापता में परिणाम है कि बहुत कुछ वर्गों में कटौती करने के लिए है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के बाद एक पहली बार के लिए, हम आवश्यक से अधिक वर्गों को काटने की सलाह देते हैं । मस्तिष्क एटलस छवियों धुंधला करने से पहले का अध्ययन बहुत उपयोगी है । ब्रेन्टम परिवर्तन की उपस्थिति हर कुछ सौ माइक्रोन की सराहना करता है और, कुछ अनुभव के साथ, यह क्या वर्गों बस स्थूल उपस्थिति से धुंधला करने लायक हैं पता करने के लिए संभव है.

एलसी को स्थानीयकृत करने की प्रक्रिया के दौरान, संकेत में भिन्नता हो सकती है निर्भर करता है कि मस्तिष्क को सेक्शनिंग के दौरान कितनी अच्छी तरह उन्मुख किया गया था । जब नियंत्रण रेखा के केंद्र के माध्यम से काटने, संकेत उज्ज्वल है और एक बड़ा क्षेत्र के रूप में नियंत्रण रेखा है, जो एक बहुत छोटे क्षेत्र पर एक संकेत के रूप में दिखाई देगा के किनारे की तुलना में शामिल है । इस मामले में कि कोरोनल स्लाइस थोड़ा झुका रहे हैं, 4वें वेंट्रिकले के एक पक्ष के नियंत्रण रेखा स्पष्ट हो सकता है और दूसरी तरफ एक आसन्न स्लाइड में केवल दृश्यमान हो सकता है । इस प्रकार, एक हमेशा एक मस्तिष्क स्लाइस के भीतर अधिकतम तीव्रता में दोनों नियंत्रण रेखा क्षेत्रों की उपस्थिति की उम्मीद नहीं कर सकते. इस विरूपण साक्ष्य मस्तिष्क काटने से बचा जा सकता है बिल्कुल कोरोनल माउस मस्तिष्क स्लाइसर मैट्रिक्स में और ध्यान से अक्टूबर के साथ घनीय embedding मोल्ड में मस्तिष्क embedding ।

immunostaining, विरोधी tyrosine hydroxylase एंटीबॉडी के साथ कम से कम, अत्यंत क्षमा है और, हमारे अनुभव में, मोटाई में १०० μm अप करने के लिए वर्गों पर काम करता है. हमने पाया है कि अवरुद्ध समाधान नियंत्रण रेखा के उच्च संकेत करने वाली शोर धुंधला, लागत को कम करने और नियंत्रण रेखा का पता लगाने के लिए आवश्यक समय की राशि को कम करने के लिए आवश्यक नहीं है । हमारे अनुभव में, धुंधला प्रोटोकॉल ऊपर एसपी किया जा सकता है-कम गुणवत्ता और धुंधला के penetrance के साथ-जबकि 2 एच के लिए permeabilization को कम करने, प्राथमिक एंटीबॉडी 8 एच के लिए, और माध्यमिक एंटीबॉडी 2 एच के लिए इसके अतिरिक्त, यदि एक बस नियंत्रण रेखा का पता लगाने में रुचि है ( उदाहरणके लिए, एक वायरस के इंजेक्शन मान्य के लिए/ट्रेसर), एक निश्चित मस्तिष्क से वर्गों को १०० μm मोटाई पर एक vibratome पर काटा जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है, डिजाइन द्वारा, पशु euthanizing और मस्तिष्क को हटाने की आवश्यकता है । इसलिए, यह vivo स्थानीयकरण (जैसे, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग) के लिए उपयोगी नहीं है । एक और सीमा है कि इस प्रोटोकॉल pfa निर्धारण जो ऊतक के मूल राज्य बदल सकता है की आवश्यकता है । इन बदलावों में कॉपर, कैल्शियम, आयरन और जिंक३६जैसी मौलिक सामग्री शामिल है । पीएफए स्थिरीकरण के कारण धातु वितरण का वास्तविक परिवर्तन एक नमूने में परीक्षण किया जा सकता है जो एक गैर तय नमूने के समानांतर में चलाया जा सकता है. इन दोनों नमूनों के बीच धातु वितरण की तुलना एक निश्चित अध्ययन में ब्याज की है जो धातु के वितरण पर पीएफए निर्धारण के प्रभाव पर सबूत प्रदान करेगा. pfa निर्धारण से बचना चाहिए, तो इस प्रोटोकॉल के सामान्य सिद्धांत (immunostaining द्वारा नियंत्रण रेखा का पता लगाने और पालन अप प्रयोगों के लिए आसन्न वर्गों का उपयोग कर) बिना निर्धारण के जमे हुए वर्गों के लिए बढ़ाया जा सकता है.

हम ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल काफी हद तक इस समस्या को हल करने के लिए मौजूदा तरीकों की एक शोधन है । नवीनता पिछले दृष्टिकोण सिलाई में मौजूद है एक बहुत छोटा है, आसानी से चूक नाभिक पता लगाने के लिए । हम उम्मीद करते हैं कि इस प्रोटोकॉल की आवश्यकता के आधार पर आसानी से संशोधित और विस्तारित किया जा सकता है (उदा., ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करके प्रतिरक्षा से बचने के लिए नियंत्रण रेखा में फ्लोरोफोस व्यक्त करना).

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Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

हम माउस कॉलोनी के रखरखाव के लिए अबीगाएल मुचेन्डिटसी का शुक्रिया अदा करते हैं । आरगोनने राष्ट्रीय प्रयोगशाला में उन्नत फोटॉन स्रोत का उपयोग अमेरिका के ऊर्जा विभाग द्वारा समर्थित किया गया था, विज्ञान के कार्यालय, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय, अनुबंध संख्या के तहत: DE-AC02-06ch11357. हम उंनत फोटॉन स्रोत पर उपयोगकर्ता सहायता और सहायता के लिए ओल्गा एंटीपोवा और Dr. stefan vogt का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया 2r01gm101502 SL के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult mouse brain slicer matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey) Thermo Fisher Scientific A-21206
Charged glass slides Genesee 29-107
Confocal microscope Zeiss LSM 800
Cryostat Microm GmbH HM 505E
Cryostat cutting blades Thermo Fisher Scientific MX35
Scissors Mini, 9.5cm Antech Diagnostcs 503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit) B. Eipper -
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit) Cell Signaling 8586
Falcon tubes, 50ml USA Scientific 339652
Forane (isofluorane) Baxter NDC 1019-360-60
Forceps Micro Adson Antech Diagnostcs 501245
Hardset mounting media EM sciences 17984-24
Microscope Pascal LSM 5
Multi-well plates, 24 wells Thermo Fisher Scientific 930186
Optimal cutting temperature compound (OCT) VWR/ tissue tech 102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% Fisher Scientific SF98-4
Peel-A-Way disposable embedding molds Polysciences Inc. 18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS) Life Tech 14190250
Razor blades Amazon ASIN: B000CMFJZ2
Spatulas Antech Diagnostcs 14374
T pins Office Depot 344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition Amazon ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD) Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit) EMD Millipore AB152
Ultralene thin film for XRF SPEX Sample Prep 3525
Wide-field fluorescent microscope Zeiss Axio Zoom.V16

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४५ मस्तिष्क लोकस धातु इम्यूनोहिस्टोकैमिस्ट्री एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी norepinephrine तांबा dbh TH ATP7A ATP7B

Erratum

Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 04/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

माउस मस्तिष्क में लोकस का स्थानीयकरण
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Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M.,… More

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).

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