Summary
يمكن استخدام ديسيلولاريزيد السقالات المستمدة من الغضروف سقالة لإصلاح الغضروف دليل وكوسيلة لتجديد الأنسجة أوستيوتشوندرال. هذا الكتاب يصف عملية ديسيلولاريزيشن بالتفصيل ويوفر اقتراحات لاستخدام هذه السقالات في الإعدادات في المختبر.
Abstract
عيوب Osteochondral تفتقر إلى القدرة الكافية على إصلاح جوهري لتجديد أنسجة العظام والغضاريف السليمة وظيفيا. وإلى هذا الحد، قد ركزت البحوث الغضروف على تطوير السقالات التجدد. توضح هذه المقالة تطوير السقالات تماما المستمدة من المصفوفة خارج الخلية الغضروف الطبيعي، قادمة من جهة مانحة الخيول. وتشمل التطبيقات المحتملة للسقالات إنتاج اللوجرافتس لإصلاح الغضاريف، وصفه سقالة للأنسجة أوستيوتشوندرال الهندسية، وتوفير نماذج في المختبر لدراسة تشكيل النسيج. قبل ديسيلولاريزينج الأنسجة، تتم إزالة الخلايا المانحين، ولكن العديد من الرموز النشطة بيولوجيا الطبيعية ويعتقد أن الإبقاء على. والميزة الرئيسية لاستخدام هذه سقالة طبيعية بالمقارنة مع سقالة منتجة صناعيا أن لا الروغان المزيد من البوليمرات المطلوبة لتجديد الأنسجة أوستيوتشوندرال بالسيارة. يمكن استخدام السقالات المستمدة من الغضروف مصفوفة لتجديد أنسجة العظام والغضاريف في إعدادات المجراة في سواء في المختبر.
Introduction
عيوب غضروف مفصلي في الركبة بسبب الأحداث المؤلمة التي يمكن أن تؤدي إلى عدم الراحة، وقبل كل شيء يمكن أن يكون لها تأثير كبير على حياة السكان الشباب والنشطة1،2،3. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي تلف الغضروف في سن مبكرة إلى ظهور أكثر سرعة من هشاشة العظام في وقت لاحق في الحياة4. حاليا، يتم العلاج الإنقاذ الوحيد لهشاشة العظام المعمم في الركبة جراحة استبدال المفاصل. كما غضروف هيبوسيلولار، أنيورال، والأنسجة أفاسكولار، محدودة جداً قدرتها على التجدد. ولذلك، يتم التماس نهج الطب التجديدي بعد المعونة وحفز التجدد قدرة الأنسجة الأصلية. ولهذا الغرض، تصمم السقالات ويستخدمها الجسم للخلايا الأصلية5أما خلية ناقل أو مادة استقرائية التي تحرض على التفرقة وتجديد الأنسجة.
وقد درست السقالات ديسيلولاريزيد على نطاق واسع في الطب التجديدي6. قد حققت بعض النجاح، على سبيل المثال، في المساعدة على تجديد الجلد7وهياكل البطن8الأوتار9. وميزة استخدام السقالات ديسيلولاريزيد هو أصلهم الطبيعية وقدرتها على الاحتفاظ بالرموز النشطة بيولوجيا أن كلا من جذب والحث على تمايز الخلايا إلى النسب الملائمة اللازمة لإصلاح الأنسجة6،10. وعلاوة على ذلك، نظراً للمصفوفة خارج الخلية (ECM) مادة بيولوجية طبيعية، ويمنع ديسيلولاريزيشن استجابة المناعية محتملة عن طريق إزالة المحتوى الخلوية أو الوراثية، هي التغلب على المسائل المتعلقة بتوافق مع الحياة وتحلل الأحيائي.
السقالات مصفوفة المستمدة من الغضروف (إليه التنمية النظيفة) أظهرت تشوندروجينيك كبيرة محتملة في تجارب في المختبر عندما تبذر مع الخلايا اللحمية الوسيطة11. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت هذه السقالات إمكانات لنسيج العظام النموذج عن طريق التحجر endochondral في مواقع خارج الرحم في إعدادات المجراة في12. كما توجه إليه التنمية النظيفة السقالات التشكيل كل العظام وأنسجة الغضاريف، ويجوز عقد هذه السقالات المحتملة لإصلاح العيب أوستيوتشوندرال بالإضافة إلى إصلاح الغضاريف.
توضح هذه المقالة بروتوكول مقتبس من يانغ et al. (2010)13 لإنتاج ديسيلولاريزيد السقالات إليه التنمية النظيفة من الخيول خنق الغضروف. هذه السقالات غنية بالكولاجين من النوع الثاني، ويخلو من الخلايا، ولا تحتوي على أي الجليكوزامينوجليكان (الكمامات) بعد ديسيلولاريزيشن. يمكن إجراء تجارب في المختبر والمجراه في على حد سواء على إصلاح الخلل تشوندرال (osteo) باستخدام هذه السقالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لهذا البروتوكول، تم الحصول على خنق الخيلي الغضروف من الخيول التي قد توفي نتيجة لأسباب أخرى من هشاشة العظام. تم الحصول على الأنسجة بإذن أصحابها، وتمشيا مع القواعد الأخلاقية المؤسسية.
ملاحظة: ويصف هذا البروتوكول تصنيع السقالات من الغضروف الخيلي ديسيلولاريزيد، التي يمكن أن تستخدم للتطبيقات مثل أنظمة زراعة الأنسجة في المختبر أو في فيفو غرس في استراتيجيات الطب التجديدي. يجب تنفيذ الخطوات الانزيمية المعاملة حسب الترتيب الزمني المبين.
1-حصاد غضروف مفصلي من الجهات المانحة (المأخوذة) المفاصل
- قدما خطوة الحصاد، إعداد 1 لتر غضروف الغسيل الحل، وتتألف من العقيمة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، وتستكمل مع 100 البنسلين يو/مليلتر، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 1% (v/v) باء الامفوتريسين
- ارتداء القفازات ومعطف معمل أثناء إجراء الحصاد الكامل، حيث يمكن أن تحمل الجهة المانحة مسببات الأمراض.
- الحصول مشترك (المأخوذة) سليمة لعزل الغضروف.
ملاحظة: عند هذه النقطة، الجلد حول المشترك لا تزال سليمة. غضروف خنق الخيول التي تم الحصول عليها من الحصان واستخدمت في هذا البروتوكول، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم المفاصل الأخرى من الأنواع الأخرى. - قم بإزالة الجلد الموجود حول مجال اهتمام مشترك باستخدام مشرط وملقط جراحي. وبالإضافة إلى ذلك، قم بإزالة أنسجة العضلات والدهون المفرطة إذا لزم الأمر، دون الأضرار المشتركة الكامنة. بشكل اختياري، نقل الجثث معدّة لسلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
- لأداء أرثروتومي، أي، انفصالاً المشترك، أولاً بتحديد موقع حيث يحدد المشترك عن طريق إجراء التمديد والانحناء للمشترك.
- بعناية إزالة طبقات أكثر من الدهون، والعضلات، والاوتار بدون مشرط وملقط الجراحة لفتح المنطقة المشتركة.
- جعل شق للوصول إلى تجويف المشتركة.
ملاحظة: تجويف مشترك مليء بالسائل الزليلي، الذي يمكن بالتنقيط من التجويف عند تنفيذ شق صحيح. - الاستمرار في فتح المشترك تماما بالقطع عن طريق الأوتار التي تبقى المشترك معا.
- فحص الغضروف عن أي ضرر العيانية.
ملاحظة: إذا لم يكن لدى غضروف مفصلي مظهر لامع وسلس أو إذا كان عنيفا واضحا أو الشقوق أو عيوب موجودة، تجاهل الغضروف. - استخدام مشرط معقم لإزالة الغضروف من عظم سوبتشوندرال. قطع كل الطريق وصولاً إلى عظم سوبتشوندرال لإزالة أيضا عميق منطقة الغضروف (الشكل 1). لمنع جفاف الغضروف، بانتظام بالتنقيط الغضروف الغسيل الحل في الغضروف.
ملاحظة: وفي هذا الوقت، لا يهم حجم شرائح الغضروف. - جمع الشرائح غضروف في أنابيب 50 مل يحتوي على غضروف المجهز سابقا الغسيل الحل (الشكل 2A).
- بعد جمع الغضروف من جميع المجالات التي تهم، تجميد الأداة شرائح غضروف في النتروجين السائل لمدة 5 دقائق.
- نقل الشرائح غضروف في أنابيب 50 مل وفورا ليوفيليزي الشرائح ح 24 من غضروف في تجميد مجفف. تعيين التجميد مجفف في 0.090 تقريبا [مبر] بينما يكون مكثف الجليد-51 درجة مئوية (الشكل 2).
- تخزين الشرائح غضروف في مكان جاف في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: تصل إلى نقطة تشكيل سقالة، الحلول والغضاريف لم يكن لديك يجب إعداد ومعاملتهم بطريقة عقيمة.
2. إنشاء ديسيلولاريزيد جسيمات الغضروف
- سوبميرسي شرائح الغضروف المجففة بالتبريد بالنتروجين السائل.
- طحن العينات مباشرة أما يدوياً أو بواسطة آلة طحن. عند طحن شرائح الغضروف من جهة، استخدام مدافع الهاون والمدقة وطحن الشرائح لحوالي 45 دقيقة حتى أنهم المسحوق (الشكل 2 و 2D). عند طحن تلقائياً، استخدم آلة طحن في سرعته المحددة مسبقاً لبضع ثوان حتى دقيقة، حتى يتم المسحوق شرائح الغضروف مجمدة في الأداة الإضافية.
ملاحظة: قبل بارد الهاون أو حجرة طحن آلة طحن بإضافة النيتروجين السائل. عند استخدام ماكينة طحن، تأكد من أن جميع الجزيئات هي الأرض، وأن لا جزيئات البقاء في الجزء السفلي من حجرة الطحن. - منخل الجسيمات الغضروف للتخلص من أجزاء أكبر باستخدام غربال بحجم فتحات الشباك مم 0.71.
- تخزين الجسيمات في مكان جاف في درجة حرارة الغرفة.
3-الانزيمية ديسيلولاريزيشن مع التربسين 0.25%-EDTA
- إعداد الحل الهضم، تتألف من التربسين 0.25% مع يدتا تستكمل مع 100 البنسلين U/mL، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 1% (v/v) الامفوتريسين باء مخزن الحل عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تريبين هو حوزتي التي تحط من البروتينات المقيمين في أنسجة الغضروف. سوف تفتح هذه الخطوة الانزيمية بنية الغضروف كثيفة. - ملء الأنابيب 50 مل مع الجسيمات الغضروف المسحوق حتى حجم حوالي 7.5 مل في الأنبوب.
-
احتضان الجسيمات الغضروف مع الحل الهضم المعدة في 37 درجة مئوية ح 24 في المجموع، أثناء تحديث الحل الهضم كل ح 4.
- أولاً، إضافة 30 مل الحل الهضم لكل أنبوب 50 مل يحتوي على جزيئات الغضروف.
- ثم، ريسوسبيند الجسيمات باستخدام دوامة أو بيبيت حيث أن جميع الجزيئات يتعرض للحل الانزيمية.
- العينات ح 4 في 37 درجة مئوية على اسطوانة احتضانها.
- لتحديث الحل الهضم، الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 3113 x ز يسبب ترسب الجسيمات الغضروف. تجاهل المادة طافية.
ملاحظة: المادة طافية سيصبح أكثر وضوحاً مع كل فترة الحضانة التربسين. - كرر الخطوة 3.3.1–3.3.4 حتى الجسيمات قد تم المحتضنة مع الحل الهضم لدورات 6 ح 4.
- بعد دورة النهائي، إزالة المادة طافية بعد سينتريفوجينج وتغسل الجسيمات في 30 مل غضروف الغسيل الحل مرتين. الطرد المركزي الجسيمات لمدة 20 دقيقة في 3113 x ز بين كل من يغسل.
4-الانزيمية ديسيلولاريزيشن مع العلاج نوكلاس
- إعداد 10 ملم حل HCl تريس في درجة الحموضة 7.5 في المياه..
- إضافة 50 يو/مليلتر deoxyribonuclease و ribonuclease يو/مليلتر 1 A إلى المخزن المؤقت تريس-HCl، للحصول على الحل نوكلياسي.
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتحط على وجه التحديد ديوكسيريبونوكليسيس وريبونوكليسيس. - لإزالة غضروف الغسيل الحل من الجسيمات الغضروف (الخطوة 3، 4)، الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3,113 س ز، وإزالة المادة طافية.
- إضافة 30 مل الحل نوكلاس للجسيمات الغضاريف وآثاره الجسيمات من خلال الحل، مع التأكد من أن جميع الجزيئات معرضون لحل نوكلاس.
- احتضان هذه العينات على اسطوانة أجل ح 4 في 37 درجة مئوية.
- إزالة الحل نوكلاس بالجسيمات الغضروف لمدة 20 دقيقة في 3,113 س ز سينتريفوجينج وتجاهل المادة طافية.
- تغسل العينات بإضافة 30 مل 10 مم حل HCl تريس دون ديوكسيريبونوكليسي وريبونوكليسي أ للجسيمات الغضروف. ريسوسبيند الجسيمات وترك العينات اسطوانة ح 20 في درجة حرارة الغرفة.
5-المنظفات ديسيلولاريزيشن
- جعل الحل المنظفات بإذابة 1% (v/v) أوكتوكسينول-1 في برنامج تلفزيوني.
- إزالة الحل تريس-HCl من الجسيمات غضروف سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 3,113 س ز وتجاهل المادة طافية.
- إضافة 30 مل الحل المنظفات 1% مستعدة للجسيمات الغضروف. ريسوسبيند الجسيمات الغضروف برفق لتجنب الإرغاء من الحل.
ملاحظة: هذه الخطوة ينهار الأغشية الخلوية. - العينات على اسطوانة أجل 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة على اسطوانة احتضانها.
- إزالة الحل المنظفات بالطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3,113 س ز وتجاهل المادة طافية.
-
لإزالة كل بقايا الحلول ديسيلولاريزيشن، تغسل الجسيمات غضروف في 6 دورات ح 8 في 30 مل غضروف الغسيل الحل. أداء الغسيل على اسطوانة في درجة حرارة الغرفة.
- للتغيير إلى الغسيل القادمة، الطرد المركزي من تعليق لمدة 20 دقيقة في س 3,113 زوتجاهل المادة طافية وإضافة غضروف الطازجة الغسيل الحل.
- ترك الغسيل الأخير في الأنابيب وتخزين الجسيمات غضروف ديسيلولاريزيد في-80 درجة مئوية.
6-إقامة السقالات من الجسيمات ديسيلولاريزيد
- إذا تم تخزين الجسيمات في-80 درجة مئوية، ذوبان الجليد الأنابيب المغلقة التي تحتوي على جزيئات غضروف في الماء الدافئ قبل إنشاء السقالات.
- نقل الجسيمات الغضروف مع مغرفة صغيرة إلى قالب أسطواني، على سبيل المثال، قنينة بلاستيكية مع قطرها 8 مم وارتفاعه 2 سم.
- عند وضع الجسيمات الغضروف إلى العفن البلاستيك، اضغط جميع الهواء-الفقاعات بها لتجنب تسوس الأسنان في السقالة، وملء القالب حتى الحافة.
ملاحظة: فإنه سيكون أكثر صعوبة لأن السقالات من العفن معدنية بعد تكوين سقالة، والذي يمكن أن يؤدي إلى تصدعات في السقالة. - تجميد القوالب مع جزيئات الغضروف لمدة 10 دقائق في-20 درجة مئوية.
- ليوفيليزي السقالات الغضروف داخل على قوالب ح 24 في تجميد مجفف.
- بعد lyophilization، تأخذ السقالة من العفن (الشكل 3) وتشابك لهم مع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء على مسافة 30 سم و 365 نيوتن متر بين عشية وضحاها.
- من أجل استخدام السقالات لزراعة الخلايا في المختبر أو غرس المجراة في، تعقيم السقالات مع، على سبيل المثال، الإثيلين أوكسيد (إيتو) الغاز.
ملاحظة: إيتو التعقيم على طرف خارجي.
7-توصيف السقالات ديسيلولاريزيد مع ستينينجس النسيجي
ملاحظة: لضمان ديسيلولاريزيشن كاملة وتصور الحرف الطبيعية المتبقية من الغضروف، تنفيذ عدة ستينينجس النسيجي قبل استخدام السقالات في أي تجربة، بما في ذلك الهيماتوكسيلين وتلطيخ ويوزين (H & E) لضمان ديسيلولاريزيشن، سافرانين-O تلطيخ لتصور الوجود المتبقي لهفوة، الكولاجين النوع الأول إيمونوهيستوتشيميستري للتفريق بين المحتوى الكولاجين، والكولاجين النوع الثاني إيمونوهيستوتشيميستري للتفريق بين المحتوى الكولاجين.
- قص السقالات في شرائح رقيقة حوالي 3 مم مع مشرط.
ملاحظة: إذا قطعت السقالات في أحجام أكبر أو أصغر، مدد دورات الجفاف تحتاج إلى تكييف. - تضمين السقالات في قطره من 4% (w/v) الجينات وحمل العابرة للربط عن طريق إضافة كمية مماثلة من 3.7% فورمالين غير مخزنة يحتوي على 20 مم كاكل2.
ملاحظة: تضمين الجينات يجعل شرائح السقالة أكثر تشدداً مقارنة بخطوات الغسيل قبل تضمين البارافين. في حالة السقالات قد تم خلية المصنفة أو في فيفو مزروع، تضمين الجينات ليس من الضروري، كما سيتم تشكيل السقالات مقاومة كافية نظراً لإدماج إدارة المحتوى في المؤسسة بالخلايا. - يذوي العينات قبل وضعها في سلسلة متدرجة من إيثانول، بدءاً من دورات ساعة واحدة من 70%، 96%، 96%، 100%، و 100 ٪ الإيثانول، تليها دورتين ح 1 من زيلين نفط، وانتهاء بدورتين ح 1 من البارافين في 60 درجة مئوية.
- بعد الجفاف، البارافين--تضمين العينات في العفن وتبريد العينات.
- قطع العينات مع مبضع في شرائح من 5 ميكرومترات سميكة.
- قبل التلوين، ترطيب العينات بوضعها في سلسلة إيثانول متدرج يتم إرجاعها. بدء تشغيل مع يغسل اثنين من زيلين نفط لمدة 5 دقائق، تليها يغسل 2 من الإيثانول 100%، 95%، و 70% لمدة 3 دقيقة للمياه والصرف الصحي. وأخيراً، غسل العينات 3 مرات في الماء لمدة 2 دقيقة.
ملاحظة: في حالة استخدام الجينات لتجهيز العينات لتضمين البارافين، تأكد من يغسل الجينات مع حمض الستريك 10 ملم قبل الإماهة المقاطع البارافين. - وصمة عار العينات والهيماتوكسيلين ويوزين، سافرانين-س، الكولاجين أنا، والكولاجين الثاني كما هو موضح السابق11.
8-توصيف السقالات ديسيلولاريزيد مع التحليلات الكمية
- الحصول على الملخصات غراء من السقالات كما هو موضح سابقا11.
- القيام فحص مع مجموعة أدوات القياس الكمي الحمض النووي القائم على الأسفار لقياس محتوى الحمض النووي المزدوج-حبلا السقالات لضمان ديسيلولاريزيشن كاملة. يتبع البروتوكول توفيرها من قبل الشركة المصنعة. التعبير عن كمية الحمض النووي كل الوزن الجاف من السقالة.
- القيام مقايسة ديميثيلميثيليني أزرق لتحديد ما تبقى الكمامات داخل السقالة، كما هو موضح سابقا11. التعبير عن المبلغ في هفوة في الحمض النووي.
9-البذر للسقالات ديسيلولاريزيد
- قص السقالات معقمة من الخطوة 6.7 في ملم 3 شرائح سميكة.
- نقل السقالات في آبار منفصلة من لوحة 6-جيدا.
- ترطيب السقالات مع خلية الثقافة المتوسطة التي بيبيتينج 1 مل من متوسطة فوق السقالة والسماح لها نقع 30 دقيقة لاستخدام تشوندروسيتي أو الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) التوسع في المتوسط.
ملاحظة: استخدام الوسيلة نفسها الإماهة سقالة أما بالنسبة للثقافة خلية من الخلايا التي سوف تكون المصنف. تشوندروسيتي توسيع المتوسطة يتكون من وسائل الإعلام دولبيكو تم التعديل (دميم) مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين 10 نانوغرام/مل تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو 2 (صندوق الأجيال القادمة-2). ماجستير التوسع متوسطة تتألف من الحد الأدنى ألفا المتوسطة الأساسية (-الفنزويلية) مع 10% الحرارة-إبطال FBS، 0.2 مم 2 فوسفات حمض الأسكوربيك L، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، و 10 نانوغرام/مل صندوق الأجيال القادمة-2. - إعداد 3 × 106 خلايا في 100 ميكروليتر من المتوسطة، وهي وحدة التخزين المطلوبة لكل سقالة مع قطرها 8 مم وارتفاعه 3 مم.
ملاحظة: يمكن استخدام العديد من أنواع الخلايا من مختلف الأنواع للبذر. عند استخدام تشوندروسيتيس أو الخلايا اللحمية الوسيطة، عزل الخلايا كما هو موضح سابقا11. عند استخدام تشوندروسيتيس، تأكد من أن أنها لا تم توسيع الماضي مرور P1 بغية التقليل من عدد تشوندروسيتيس ديديفيرينتياتيد. عند استخدام الخلايا اللحمية الوسيطة، يجب اختبار قدرتها على التفريق بين نسب متعددة، كما هو موضح سابقا14. - بيبيت 50 ميكروليتر من إعداد تعليق خلية فوق سقالة غارقة قبل واحتضان السقالة ح 1 في 37 درجة مئوية.
- تشغيل سقالة رأسا على عقب أسفل، ميكروليتر بيبيت 50 المتبقية من تعليق خلية في هذا الجانب من السقالة بعناية واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، أضف 3 مل متوسطة إلى الآبار، وثقافة السقالات المصنف الخلية عند 37 درجة مئوية. التعامل مع لوحة الثقافة برفق لتجنب المفرزة من الخلايا.
- الثقافة السقالات للفترة الوقت المطلوب للتجربة وتغيير المتوسطة 2 – 3 مرات في أسبوع. بيبيت بعيداً ببطء وإلى أقصى حد من السقالة قدر الإمكان.
- بعد استزراع من السقالة المصنف الخلية، قص السقالات في النصف ومعالجتها للأنسجة والتحاليل البيوكيميائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب دائماً تأكيد ديسيلولاريزيشن سقالات إليه التنمية النظيفة باستخدام ستينينجس النسيجي، فضلا عن استخدام الحمض النووي التحديد الكمي لقياس كمية مخلفات الحمض النووي. ديسيلولاريزيشن غير كافية تؤدي إلى الاستجابات المناعية غير المرغوب فيها التي تؤثر على النتائج في إعدادات المجراة في15،،من1617. لهذا الأسلوب ديسيلولاريزيشن محددة، كان الحمض النووي دون كشف المدى، التي بدأت في 13.6 ± 2.3 نانوغرام/mg وزن جاف الحمض النووي (n = 3). ديسيلولاريزيشن الكامل باستخدام هذا البروتوكول سيؤدي إلى إنتاج السقالة التي هي غنية بالكولاجين من النوع الثاني (الشكل 4) ولا الخلايا (الشكل 4A) أو الكمامات (الشكل 4 باء). يتم عرض الغضروف الخيلي صحية كالمقارنة، الملون Safranin-O (الشكل 5A) والكولاجين الثاني (الشكل 5 (ب)).
يجب عرض السقالة مسامية الميكروسكوب متجانسة. فقاعات الهواء سيؤدي إلى ثقوب كبيرة يمكن اكتشافها بسهولة في السقالة وهي، لذلك، إزالة بعناية. قد يكون لها تأثير ضار على الخواص الميكانيكية هذه الثقوب الكبيرة في السقالة ويؤدي إلى مرفق خلية متنافرة عند البذر. النجاح في إنتاج السقالة ينطوي أيضا على خطوة التجفيف تدوم 24 ساعة على الأقل؛ سوف يؤدي هذا إلى سقالة له مظهر أبيض (الشكل 3). في حالة عدم كفاية lyophilization، سيتعين السقالات لون مصفر والمسام واضحة لا يمكن ملاحظتها.
من أجل السقالة ﻻستخدامها في فيفو يجب إظهار التطبيقات والبذر الخلايا في المختبر، والتكامل الخلية مع سقالة، فضلا عن وظيفة الخلوية،. هنا، كانت تبذر السقالات مع MSCs التي تنتجها إدارة المحتوى في المؤسسة بعد 4 (الشكل 6A-د) و 6 (6E الشكل-ح) أسابيع لاستزراع في المختبر. تشكيل هفوة والكولاجين الثاني والكولاجين طرفية الأول، فضلا عن وجود خلايا، وأبدى. بالإضافة إلى ذلك، يتم عرض خصوصية الكولاجين الثاني في الشكل 5B، حيث الغضاريف ولكن ليس من العظام هو الملون إيجابية بالنسبة للكولاجين الثاني في المكونات أوستيوتشوندرال.
رقم 1: الركبة الخيول بعد إزالة غضروف سمك كامل- تتم إزالة الغضروف من condyles استخدام مشرط حتى يتم التوصل إلى طبقة الغضروف متكلسة الذي لا يمكن قص باستخدام مشرط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: خطوات متسلسلة في خلق ديسيلولاريزيد الجزيئات مصفوفة المستمدة من الغضروف. (A) الغضروف الشرائح التي تم إزالتها من condyles يتم غسلها في حل المضادات الحيوية التي غرست في. (ب) الغضروف الشرائح المجففة بالتبريد هي، والآن لها مظهر أبيض وورقة مثل. (ج) الأداة الإضافية-تجميد الغضروف المجففة بالتبريد أداء اليمين من قبل (د) جسيمات الغضروف سحق باليد-الطحن باستخدام مدافع الهاون والمدقة. كما يمكن أن يتم الخطوة D مع الطحن التلقائي. وقد تم تعديل هذا الرقم من بندرs et al.11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: المنتج النهائي، سقالة مصفوفة المستمدة من الغضروف ديسيلولاريزيد. هذا سقالة أسطوانية ارتفاعها 2 سم وقطرها 8 مم. وقد السقالة بنية مسامية واضحة. عرض الصورة اليمنى واليسرى سقالة من زاويتين مختلفتين. علما بأن لا توجد ثقوب كبيرة موجودة على سطح السقالة كما تم إزالة كافة فقاعات الهواء قبل ليوفيليزيشن. وقد تم تعديل هذا الرقم من الشواذ et al.11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: توصيف النسيجي من السقالة. (أ) ح & ه تلطيخ جزيئات ECM يظهر ذات أحجام مختلفة، وعدم وجود خلايا. (ب) صبغة Safranin-O يبين أن لا الكمامات قد أبقى في عملية ديسيلولاريزيشن. (ج) الكولاجين النوع الثاني إيمونولوكاليزيشن ويكشف عن الجسيمات ديسيلولاريزيد غنية بالكولاجين من النوع الثاني. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من الشواذ et al.11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تمثيل النسيجي الغضاريف الخيلي صحية- (أ) أوستيوتشوندرال التوصيل ملطخة بالعظام يظهر Safranin-O والأخضر سريع دون الكمامات (الأخضر) والغضاريف مع الكمامات (أحمر)، وطبقة الغضروف متكلسة في بين. (ب) الكولاجين osteochondral الثاني الملون التوصيل البقع الغضاريف ولكن ليس من العظام. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تشكيل المحافظين الجدد-مصفوفة على السقالة بعد 4 إلى 6 أسابيع للثقافة باستخدام الخلايا اللحمية الوسيطة. بعد 4 (أ-د) و 6 أسابيع (ح ه) الثقافة، مصفوفة المشكلة حديثا وغنية بالخلايا (A + E)، الكولاجين الثاني (ب + F)، والكمامات (ج + ز)، كما يمكن أن يلاحظ مع H & E والكولاجين الثاني ستاينينجس سافرانين-س، على التوالي. وباﻹضافة إلى ذلك، الكولاجين أنا موجود بعد 4 (د) و 6 (ح) أسابيع في محيط السقالة. كثافة الخلية، فضلا عن كمية ترسب المصفوفة أعلى في الهامش. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من الشواذ et al.11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إدارة المحتوى المؤسسي غضروف مفصلي كثيفة جداً ومرنة جداً للعلاجات الانزيمية المختلفة. بروتوكول ديسيلولاريزيشن متعددة الخطوات الموضحة في هذه المقالة يعالج هذه المقاومة وينشئ مصفوفات ديسيلولاريزيد بنجاح. ولتحقيق ذلك، العملية تمتد على مدى عدة أيام. تم اقتراح العديد من العمليات ديسيلولاريزيشن لأنواع مختلفة من الأنسجة18، وتوضح هذه المقالة بروتوكول مناسب ديسيلولاريزيشن الغضروف. في هذا البروتوكول، من الضروري، مع ذلك، لمتابعة العلاج الأنزيمي مع الخطوات المنظفات بغية إزالة جميع الخلايا. كمية الحمض النووي هو تناقص ملحوظ في الخطوات القليلة الأولى التي تنطوي على المعاملة مع التربسين، وترك هذه الخطوات لن تؤدي إلى ديسيلولاريزيشن السليم11.
علما بأن هذا البروتوكول يستند إلى ديسيلولاريزيشن لانسجة الغضاريف الخيول. تم العثور على نشاط إنزيم الحلول المستخدمة كافية لإزالة كافية chondrocytes الخيول. ومع ذلك، على الرغم من المحافظة على تكوين مصفوفة عبر الأنواع، قد البروتوكول يتعين تعديلها ديسيلولاريزيشن غضروف من الحيوانات الأخرى بسبب الاختلافات البالغة بطبيعة الحال المقيمين chondrocytes19. على سبيل المثال، غضروف حيوانات الصغيرة ومن المعروف أن يكون محتوى خلية أعلى، وربما، ولذلك تتطلب عملية ديسيلولاريزيشن أكثر عدوانية. سبب معين لاختيار الغضروف الخيول إنشاء السقالات ديسيلولاريزيد هو أن الغضاريف الخيول والإنسان إظهار التشابه واضح في سمك وكثافة الخلية والبيوكيميائية المكياج20.
لضمان منتج قابل لإعادة الإنتاج، عدة معايير التقييم قد تكون هامة تحديد ما إذا كان قد تم تحقيق ديسيلولاريزيشن كاملة. في هذا البروتوكول، استخدمت كلا من ح & ه تلطيخ والبيوكيميائية التحديد الكمي لتقييم المبلغ المتبقي من الحمض النووي في المنتج النهائي. واقترح باحثون آخرون أيضا لتحديد حجم الحمض النووي الباقية، بحد أقصى 200 شركة بريتيش بتروليوم في الطول لنوعية التحكم21، أو كمية الحمض النووي متبقية أقل من 50 نانوغرام/ملغ تجف الأنسجة الوزن18،22. بغض النظر، التعديلات على البروتوكول ويجب دائماً متابعة مع التقييم النسيجي وفحوصات الكمية لتحديد أثر ديسيلولاريزيشن، فضلا عن منتجات إدارة المحتوى في المؤسسة المتبقية.
القيد الرئيسي من هذا البروتوكول أن الإجراء ديسيلولاريزيشن شامل ينطوي على التعرض التربسين يؤدي إلى وقوع خسائر كبيرة من الكمامات. على الرغم من أن التربسين لم تهزم الكمامات، السبب في فقدان الكمامات يمكن فتح حتى أنسجة الغضروف من التربسين ناهضة البروتينات التي ارتساء أو تغليف الكمامات. مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، مثل الكمامات هامة للاحتفاظ بالمياه في الغضروف المفصلي، وذلك تلعب دوراً هاما في النشاط الحيوي مرونة الأنسجة4. البروتوكولات التي تهدف إلى الحد من الخسائر الكمامات طوال عملية ديسيلولاريزيشن سوف تؤثر على دقة عملية ديسيلولاريزيشن.
بعد ديسيلولاريزيشن، قد ثبت دمج الخلية ووظيفتها في المصنف خلية السقالات. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن إنتاج مصفوفة من تشوندروسيتيس على هذه السقالة غير مرض، لا سيما عند مقارنتها بترسب مصفوفة وفيرة من الخلايا اللحمية الوسيطة11. كما يتم إيداع الأنسجة مثل الغضاريف على السقالة، هذه المصفوفة الجديدة عموما أولاً وتودع في محيط السقالة قبل غزو بقية السقالات. هذا ويمكن ملاحظة وضوح على شرائح نسيجية فيها هامش الخلية الغنية، بدلاً من مركز الخلية الغنية، غالباً ما ينظر إلى (الشكل 6). ومع ذلك، ربما يتم تخفيض هذا التأثير عند استخدام المفاعلات الحيوية نضح للخلية البذر وتعزيز تبادل المغذيات. كما يحدث ترسب مصفوفة، السقالات سيتولى أيضا مظهر مصقول، يصبح ميكانيكيا أكثر اتساقا وأقل هشاشة. على هذا النحو، يمكن بسهولة خفض استخدام مشرط دون تتهاوى. ويمكن تقييم خصائص المصفوفة المكونة حديثا استخدام ستينينجس النسيجي والتحليلات الكمية. كما يتم ترك لا الكمامات بعد عملية ديسيلولاريزيشن، سيتم كافة الكمامات التي يمكن قياسها كمياً منتجات نيوسينثيسيس.
السقالات أنتجت باستخدام هذا البروتوكول ديسيلولاريزيشن توفر أحد حلول الجاهزة للاستخدام ويمكن زرعها دون الحاجة إلى بذر الخلية قبل غرس. ومع ذلك، عند تطبيقها لعلاج العيوب تشوندرال (osteo)، سيكون خصائص النشاط الحيوي إلى تعزيز يقلل من فرصة للمسافة البادئة للبناء في المراحل الأولى من تحميل مفصلي. قد يلزم غرس المشارك مع طبقات واقية على أعلى، أو استراتيجيات أخرى لتعزيز تنفيذها. في المستقبل، كذلك تنقيح البروتوكول قد تعزز إمكانات التجدد من السقالة. فعلى سبيل المثال,، الاحتفاظ بالكمامات، الحفاظ على اتجاه ألياف الكولاجين، أو مزيج مع المواد الحيوية الأخرى لتعزيز هذه السقالات قد تكون مفيدة للسماح سطح مفصلي محسنة والمجددة بسلاسة. ونتيجة لذلك، قد تؤدي هذه السقالات دوراً كمكونات للجيل القادم من الطعوم التجديدي لعلاج العيوب (osteo) تشوندرال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
الكتاب تود أن تقر التمهيد الأميركي للمساعدة في إنتاج السقالات. ويدعم الشواذ K.E.M. ستيبينديوم سويرمان ألكسندر من المركز الطبي في جامعة. لفتة R. وياء مالدا معتمدة من قبل "مؤسسة التهاب المفاصل الهولندية" (منح اتفاقات أول أكسيد الكربون-14-1-001 و LLP-12، على التوالي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J.
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
